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Medicine

Ein perinatales Asphyxie-Modell für Ferkel zur Untersuchung von Herzverletzungen und Hämodynamik nach Herzstillstand, Wiederbelebung und der Rückkehr der Spontanzirkulation

Published: January 13, 2023
doi:
10.3791/64788
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1Institute of Clinical Medicine, Faculty of Medicine,University of Oslo, 2Department of Neonatal Intensive Care, Division of Pediatric and Adolescent Medicine,Oslo University Hospital Rikshospitalet, 3Department of Pediatric Research, Division of Paediatric and Adolescent Medicine,Oslo University Hospital Rikshospitalet, 4Department of Pediatrics,Vestfold Hospital Trust, 5Department of Anesthesiology,Oslo University Hospital Rikshospitalet, 6Department of Pediatrics, Faculty of Medicine and Dentistry,University of Alberta, 7Centre for the Studies of Asphyxia and Resuscitation, Neonatal Research Unit,Royal Alexandra Hospital, 8Division of Paediatric and Adolescent Medicine, Institute of Clinical Medicine,University of Oslo, 9Department of Paediatrics and Adolescent Health,University of Botswana, 10Department of Pediatric Research, Oslo University Hospital,University of Oslo, 11Department of Pediatrics, Robert H Lurie Medical Research Center,Northwestern University Chicago

Summary

Dieses Ferkelmodell umfasst chirurgische Instrumente, Erstickung bis zum Herzstillstand, Wiederbelebung und Beobachtung nach der Reanimation. Das Modell ermöglicht eine mehrfache Probenahme pro Tier und bietet durch die kontinuierliche invasive Überwachung des arteriellen Blutdrucks, des EKGs und des nicht-invasiven Herzzeitvolumens Kenntnisse über die Hämodynamik und die Pathophysiologie des Herzens bei perinataler Asphyxie und Herz-Lungen-Wiederbelebung bei Neugeborenen.

Abstract

Neugeborene Ferkel wurden ausgiebig als Translationsmodelle für perinatale Asphyxie verwendet. Im Jahr 2007 haben wir ein etabliertes Ferkel-Asphyxie-Modell durch die Einführung eines Herzstillstands angepasst. Dies ermöglichte es uns, die Auswirkungen einer schweren Asphyxie auf die wichtigsten Endpunkte zu untersuchen, einschließlich der Zeit, die für die Rückkehr der spontanen Zirkulation (ROSC) benötigt wird, sowie die Wirkung von Herzdruckmassagen nach alternativen Protokollen für die Herz-Lungen-Wiederbelebung. Aufgrund der anatomischen und physiologischen Ähnlichkeiten zwischen Ferkeln und menschlichen Neugeborenen dienen Ferkel als gute Modelle für Studien zur Herz-Lungen-Wiederbelebung und hämodynamischen Überwachung. Tatsächlich hat dieses Herzstillstandsmodell durch die Erforschung von Reanimationsprotokollen, Pathophysiologie, Biomarkern und neuartigen Methoden zur hämodynamischen Überwachung Hinweise auf die Entwicklung von Leitlinien geliefert. Insbesondere der Zufallsbefund, dass ein erheblicher Teil der Ferkel während eines Herzstillstands eine pulslose elektrische Aktivität (PEA) aufweist, könnte die Anwendbarkeit des Modells erhöhen (d. h. es kann zur Untersuchung der Pathophysiologie verwendet werden, die über die perinatale Periode hinausgeht). Die Modellerstellung ist jedoch technisch anspruchsvoll und erfordert verschiedene Fähigkeiten, engagiertes Personal und ein feines Gleichgewicht der Maßnahmen, einschließlich der chirurgischen Protokolle und des Einsatzes von Beruhigungsmitteln/Analgetika, um eine angemessene Überlebensrate zu gewährleisten. In diesem Beitrag wird das Protokoll ausführlich beschrieben, ebenso wie die Erfahrungen mit Anpassungen des Protokolls im Laufe der Jahre.

Introduction

Perinatale Asphyxie wird durch einen gestörten Gasaustausch (Hypoxämie und Hyperkapnie) vor, während und/oder nach der Geburt verursacht. Es führt zu einer verminderten Durchblutung (Ischämie) zu lebenswichtigen Organen und in der Folge zu einer gemischten respiratorischen und metabolischen Azidose. Perinatale Asphyxie ist eine häufige Geburtskomplikation, die jährlich weltweit 580.000 Todesfälle bei Säuglingen verursacht1. Die Senkung dieser Zahl ist unerlässlich, um die Todesfälle bei Neugeborenen und Kindern unter 5 Jahren zu reduzieren, wie im Ziel der Vereinten Nationen für nachhaltige Entwicklung Nummer 3.2 festgelegt (d. h. Neugeborenensterblichkeit <12 pro 1.000 Lebendgeburten und Sterblichkeit unter 5-Jährigen <25 pro 1.000 Lebendgeburten)2.

Klinisch äußert sich Asphyxie als hypoxisch-ischämische Enzephalopathie (HIE), Atemdepression und Kreislaufversagen beim Neugeborenen3 (d. h. Symptome und Anzeichen einer Hypoxie-Ischämie lebenswichtiger Organe)4. Folglich kann ein erstickter Säugling eine Behandlung wegen Enzephalopathie, einschließlich Krampfanfällen, und einer erweiterten Atem- und Kreislaufunterstützung benötigen. Weltweit benötigen jedes Jahr bis zu 10 Millionen Säuglinge irgendeine Form von Intervention, wie z. B. taktile Stimulation, und 6-7 Millionen Säuglinge benötigen bei der Geburt eine assistierte Beatmung5. Perinatale Asphyxie stellt daher eine enorme Belastung für das Gesundheitssystem dar, mit den damit verbundenen sozioökonomischen Auswirkungen. Um die globale Krankheitslast zu verringern, die der perinatalen Asphyxie zugeschrieben wird, sind unsere Forschungsgruppen der Meinung, dass die folgenden Schwerpunktbereiche in wissenschaftlichen Studien untersucht werden sollten: Prävention, einschließlich der Verbesserung der pränatalen und geburtshilflichen Versorgung und Nachsorge; prognostische Biomarker; und optimierte Reanimation und Stabilisierung im Kreißsaal6.

Neugeborene Ferkel und menschliche Säuglinge in der Nähe der Trächtigkeit haben eine ähnliche Anatomie und Pathophysiologie7. Obwohl kein Tiermodell für perinatale Asphyxie und Herzstillstand den vollen Aspekt eines fehlgeschlagenen perinatalen Übergangs darstellen kann, der zu Asphyxie und Herzstillstand führt, sind Ferkel gute translationale Modelle.

Bereits in den 1970er Jahren haben wir ein Hypoxie-Modell bei erwachsenen Schweinenentwickelt 8. Es wurde von den Forschungsgruppen9 erfolgreich weiterentwickelt und lieferte so ein Ferkelmodell der perinatalen Asphyxie 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Im Jahr 2007 wurden die ersten Experimente mit Herzstillstand bei Ferkeln am Institut für chirurgische Forschung des Universitätskrankenhauses Oslo durchgeführt11,13,15,16. Das Arrestmodell hat Evidenz für die Entwicklung von Leitlinien 10,13,15,16,19,20 sowie für umfangreiche Möglichkeiten für physiologische Studien und die Erprobung von Geräten/Diagnosewerkzeugen 14,21, Wiederbelebungsprotokolle (randomisierte kontrollierte Studien)13,15,16,22 und Blut- und Gewebe-Biomarker10,12,20. Damit hat sich das Modell als vielseitig erwiesen, und eine einzige Versuchsreihe wurde traditionell verwendet, um mehrere Forschungsfragen zu beantworten. Dies ist wichtig und steht in Übereinstimmung mit den drei Rs (Reduction, Replacement, Refinement) der Versuchstierforschung23 (d.h. dem Prinzip, die Anzahl der Tiere, die für wissenschaftliche Zwecke geopfert werden, zu reduzieren).

Im folgenden Protokoll wird das Ferkelmodell der perinatalen Asphyxie ausführlich beschrieben, einschließlich der Induktion, Definition und Feststellung eines Herzstillstands. Das Modell wurde verfeinert, um die Exposition gegenüber Beruhigungsmitteln und chirurgischen Eingriffen zu minimieren, und umfasst mechanische Beatmung, Erstickung, Wiederbelebung, Beobachtung nach der Wiederbelebung und die Entnahme von Blut-, Urin- und Liquorproben. Unsere Gruppen entnehmen traditionell auch Gewebe aus lebenswichtigen Organen post mortem, aber das Verfahren der Gewebeentnahme wird in diesem Protokoll nicht im Detail beschrieben. Das Modell simuliert einen hypoxischen Insult mit gemischter respiratorischer und metabolischer Azidose, die die Biochemie erstickter menschlicher Neugeborener widerspiegelt. Durch die engmaschige Überwachung der Ferkel mit invasivem Blutdruck (BP) und Herzfrequenz (HR), Pulsoximetrie (PO), Elektrokardiogramm (EKG), Impedanzkardiographie (ICG) und Nahinfrarotspektroskopie (NIRS) kann die Physiologie der perinatalen Asphyxie, mit besonderem Fokus auf das Herz, im Detail untersucht werden.

Das Modell ist technisch anspruchsvoll, da ein sehr feines Gleichgewicht zwischen den Medikamenten, den chirurgischen Eingriffen und der Methode zur Herbeiführung des Herzstillstands erforderlich ist, um eine vernünftige Überlebensrate zu gewährleisten. Die Durchführung der Experimente erfordert eine gründliche Vorbereitung und ein engagiertes und gut funktionierendes Team. Auch die Auswahl der Versuchstiere scheint eine wichtige Rolle für den Erfolg von Experimenten zu spielen. In diesem Beitrag beschreiben wir das Protokoll im Detail und unsere Erfahrungen damit.

Protocol

Das Protokoll wurde von der norwegischen Behörde für Lebensmittelsicherheit genehmigt (Zulassung Nr. 25030), und die Experimente wurden gemäß den europäischen, norwegischen und institutionellen Vorschriften durchgeführt. Die Replikation dieses Modells erfordert die Einholung einer ethischen Genehmigung für die Tierversuche in Übereinstimmung mit den institutionellen und nationalen Vorschriften und die Sicherstellung, dass die Versuche gemäß den drei Rs23 durchgeführt werden. Das gesamte Personal, das mit den Tieren umgeht, muss gemäß Artikel 23 und Artikel 24 der EU-Richtlinie 2010/63/EU24 oder gleichwertig mit den Funktionen A, B und D zertifiziert sein. Überwachen Sie die Tiere während des gesamten Experiments sorgfältig und passen Sie die Anästhesie, die Beatmungseinstellungen, die Temperatur und die Tierlagerung an, um das Wohlbefinden der Tiere zu gewährleisten. Beurteilen Sie das Modell und seine Anwendung regelmäßig kritisch und verfeinern Sie es nach Bedarf und Möglichkeit. HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Ferkel waren zwischen 12 und 36 Stunden alt, wogen 1,7 bis 2,3 kg, hatten eine gleichmäßige Geschlechterverteilung, gehörten einer gemischten norwegischen Landrasse, Duroc- und Yorkshire-Rasse an und waren genetisch unverändert. Schritt 1 und Schritt 2 des Protokolls umfassen Vollnarkose- und Datenprobenverfahren, die während des gesamten Experiments angewendet werden, und die Schritte 3-10 beschreiben die experimentellen Verfahren, einschließlich der Vorbereitung der Tiere, des chirurgischen Eingriffs, der Erstickung bis zum Herzstillstand, der Wiederbelebung und der Beobachtung nach der Wiederbelebung. 1. Anästhesieprotokoll (ZEIT: gilt für das gesamte Experiment) Die Anästhesie wird mit einem Bolus aus i.v. Fentanyl (50 μg/kg) und Pentobarbital (15-20 mg/kg) in einem peripheren Venenkatheter in einer Ohrvene eingeleitet.ACHTUNG: Fentanyl ist schädlich, wenn es eingeatmet oder verschluckt wird, und reizt die Augen und die Haut. Es ist auch eine eingeschränkte Droge. Die Abgabe und der Konsum sollten gemäß den Vorschriften für verbotene Arzneimittel überwacht und reguliert werden. Pentobarbital ist schädlich, wenn es verschluckt wird, und reizt Augen und Haut. Die Anästhesie mit i.v. Fentanyl (50 μg/kg/h) wird bis zum Ersticken aufrechterhalten, dann während der Erstickung unterbrochen und nach der Rückkehr der spontanen Zirkulation (ROSC) bei 25 μg/kg/h wieder aufgenommen.HINWEIS: Die hochdosierte Fentanyl-Anästhesie, die in diesem Modell verwendet wird, stammt aus Jahrzehnten der Verfeinerung des Modells in einer gemeinsamen Anstrengung von Neonatologen und Kinderanästhesisten. Die hochdosierte Fentanyl-Anästhesie ist mit kardiovaskulärer und hämodynamischer Stabilitätassoziiert 25,26 bei Erwachsenen und Neugeborenen. Eine Studie an neugeborenen Ferkeln zeigte jedoch, dass die Verwendung von Fentanyl mit einer verringerten Herzfrequenz und einem reduzierten Herzzeitvolumen (CO) sowie einem erhöhten mittleren arteriellen Druck (MAP), dem linksventrikulären enddiastolischen Druck und dem Gesamtindex des peripheren Widerstands verbunden war27. Überwachen Sie das Wohlbefinden des Ferkels während des gesamten Versuchs. Überprüfen Sie den Muskeltonus und beurteilen Sie die Vitalwerte, um sicherzustellen, dass das Ferkel gründlich betäubt ist. Wenn das Ferkel Anzeichen von Stress zeigt, verabreichen Sie zusätzlich i.v. Fentanyl oder i.v. Pentobarbital nach klinischem Urteil. 2. Datenentnahme und Registrierung (ZEIT: gilt für das gesamte Experiment) Drucken Sie für jedes Ferkel ein Papier-Case-Registrierungsformular (CRF) aus. Der CRF enthält Informationen über die Herzfrequenz, den Blutdruck (einschließlich MAP), die Sauerstoffsättigung (SpO2), die regionale zerebrale Sauerstoffsättigung (NIRS), die Temperatur, die zusätzlich verabreichten Medikamente und das Zittern. Geben Sie dem Ferkel auf dem CRF eine ID-Nummer und notieren Sie das Gewicht und das Geschlecht des Ferkels auf der Titelseite. Machen Sie die Registrierungen alle 5 Minuten während der Stabilisierungsphase und kurz vor der Einleitung der Asphyxie. Nach der Induktion der Asphyxie die erste Registrierung nach 10 min und dann alle 5 min bis zum Herzstillstand vornehmen. Wenn ROSC erreicht wird, machen Sie die Registrierungen so bald wie möglich nach ROSC, alle 5 Minuten für die erste Stunde nach ROSC und dann alle 30 Minuten für den Rest des Beobachtungszeitraums. Geben Sie auf dem CRF an, wann die verschiedenen Proben entnommen werden sollen.Entnahme von Vollblut und Plasma zu Beginn der Stabilisierung, kurz vor der Induktion der Asphyxie, bei Herzstillstand, bei ROSC, 30 min, 60 min, 120 min, 240 min und 540 min nach ROSC und am Ende der Studie (570 min).HINWEIS: Es ist wichtig zu berechnen, wie viel Blut von jedem Ferkel entnommen werden kann. Zum Beispiel kann kleineren Ferkeln, instabilen Ferkeln und Ferkeln, die durch die Halsoperation einen gewissen Blutverlust erlitten haben, weniger Blut abgenommen werden. Es ist auch wichtig, das Hämoglobin (Hb) aus dem Säure-Basen-Status während des gesamten Experiments zu beobachten. In dieser Studie wurden Ferkel mit einem Hb <6 g/dl ausgeschlossen. Sammeln Sie den Urin 240 min nach ROSC und am Ende der Studie (570 min). Nehmen Sie den Säure-Basen-Status zu Beginn der Stabilisierung, kurz vor der Induktion der Asphyxie, 10 min nach der Induktion der Asphyxie und dann alle 5 min bis zum Herzstillstand. Messen Sie den Säure-Basen-Status bei Herzstillstand, bei ROSC, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 120 min, 240 min und 540 min nach ROSC und am Ende der Studie (570 min). Entnahme von Liquor cerebrospinalis (CSF) am Ende der Studie (570 min). Entnehmen Sie Vollblut und Plasma aus dem zentralen arteriellen Katheter.Entnehmen Sie 2 ml Blut aus dem zentralen arteriellen Katheter in eine heparinisierte Spritze und legen Sie sie beiseite. Entnehmen Sie dann 2,5 ml Blut in eine neue heparinisierte Spritze. Geben Sie 0,5 ml des zuletzt entnommenen Vollbluts in ein Mikrozentrifugenröhrchen und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein. Die restlichen 2 ml werden in eine EDTA-Durchstechflasche geeigneter Größe gegeben und 10 Minuten lang bei 1.700 x g bei 4 °C zentrifugiert. Pipettieren Sie das Plasma (das sich als oberste Schicht von der Buffy-Hülle und den Erythrozyten trennt) in Mikrozentrifugenröhrchen und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein. Entnehmen Sie weitere 0,2 ml Blut aus dem zentralen arteriellen Katheter in eine neue heparinisierte Spritze. Legen Sie die Spritze in die Säure-Base-Maschine (siehe Materialtabelle) und geben Sie die entsprechenden Informationen (ID, Zeitpunkt und Temperatur des Ferkels) ein. Schieben Sie das Blut, das in die erste heparinisierte Spritze entnommen wurde, zurück in den arteriellen Katheter. Spülen Sie den arteriellen Katheter mit heparinisierter normaler Kochsalzlösung, um sicherzustellen, dass das gesamte Blut in den Kreislauf des Ferkels zurückgeführt wird. Sammeln Sie den Urin durch suprapubische Aspiration des Urins.Lokalisieren Sie die Orientierungspunkte: den Bereich zwischen dem drittniedrigsten und zweitniedrigsten Brustwarzenpaar, etwa 2 cm unterhalb des Nabels und einige Millimeter seitlich der Mittellinie. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze mit einer 23-g-Kanüle. Schieben Sie die Kanüle etwa 1 cm senkrecht vor und saugen Sie ab, bis sich die Spritze mit Urin füllt. Geben Sie den Urin in ein kryogenes Röhrchen und frieren Sie ihn in flüssigem Stickstoff ein. Sammeln Sie Liquor durch eine Lumbalpunktion.Legen Sie das Ferkel auf die Seite und ziehen Sie die Hinterbeine nach oben zur Brust. Lokalisieren Sie die Orientierungspunkte: zwischen den Wirbelsäulenmarken auf Höhe des Beckenkamms des Ferkels. Schieben Sie eine 21-G-Kanüle leicht kranial zwischen die Wirbelsäulenmarkierungen, bis der Liquor austritt. Geben Sie den Liquor in Mikrozentrifugenröhrchen und frieren Sie ihn in flüssigem Stickstoff ein. Erfassen Sie kontinuierliche EKG- und invasive arterielle Blutdruckdaten (siehe Schritt 6 und Schritt 7) mit einer Datenerfassungs- und Analysesoftware (siehe Materialtabelle). Führen Sie NIRS (siehe Schritt 7) mit einem handelsüblichen NIRS-Gerät durch (siehe Materialtabelle). 3. Vorbereitung (ZEIT: Wochen bis Monate, so lange wie nötig) Einholung einer ethischen Genehmigung für die Tierversuche. Setzen Sie sich mit einem Landwirt in Verbindung und organisieren Sie die Auswahl der Ferkel (Alter: 12-36 h, gleiche Geschlechterverteilung, Gewicht: 1,7-2,3 kg), den Liefertermin und die Transportmodalitäten.HINWEIS: Die Auswahl von Ferkeln derselben Rasse (in dieser Studie eine Mischung aus norwegischer Landrasse, Duroc und Yorkshire) und Farm, idealerweise aus demselben Wurf und innerhalb einer engen Altersspanne, ist wichtig, um die biologische und physiologische Varianz zu reduzieren. Stellen Sie sicher, dass das Personal zu den festgelegten Terminen verfügbar ist. Überprüfen Sie, ob alle erforderlichen Geräte vorhanden sind und ob alle Instrumente und Beobachtungswerkzeuge funktionieren. Überprüfen Sie das Verfallsdatum des Asphyxiegases (8 % O2, 92 %N2) und stellen Sie sicher, dass es nicht leer ist. Richten Sie das Labor und die gesamte Ausrüstung so ein, dass es für den Empfang der Ferkel bereit ist. Kalibrieren Sie alle erforderlichen Geräte. Führen Sie eine Schätzung der Stichprobengröße im Falle einer randomisierten kontrollierten Studie durch und bereiten Sie die Randomisierung der Ferkel vor. 4. Empfang der Ferkel (ZEIT: von 10 min bis 2 h, abhängig von der Anzahl der Ferkel) Organisieren Sie den Transport der Hausferkel vom Betrieb zur chirurgischen Einrichtung am Tag der Experimente. Decken Sie den “Boden” des Behälters mit feinen Holzspänen und Wärmflaschen ab, um die Temperatur der Ferkel zu halten. Bohren Sie Gratlöcher in den Behälter, um die Luftzirkulation zu gewährleisten. Lassen Sie sich vom Landwirt über das Alter und das Gewicht der Ferkel informieren. Überprüfen Sie ihr Gewicht bei der Ankunft. Messen Sie SpO2 und HR, indem Sie eine Pulsoximeter-Sonde (PO) (siehe Materialtabelle) auf die Hintergliedmaße des Ferkels legen, während das Ferkel ruhig und entspannt im Behälter ist. Bereiten Sie alle Instrumente vor und schalten Sie die Heizung der elektrischen Heizmatratzen auf dem Operationstisch ein. Lassen Sie die Ferkel im Container ruhen, bis alle im Team für die Einleitung der Narkose und des chirurgischen Eingriffs bereit sind. 5. Einleitung von Anästhesie, Intubation und mechanischer Beatmung (DAUER: 15 min) Bereiten Sie die Ausrüstung für den intravenösen Zugang und die Intubation vor. Legen Sie die PO-Sonde an einer Hintergliedmaße an, um die Oxygenierung und HR während der Einleitung von Anästhesie und Intubation zu überwachen. Stellen Sie sicher, dass die Person das gewickelte Ferkel ruhig und ruhig hält. Stellen Sie sicher, dass Person zwei einen peripheren intravenösen Katheter in eine Ohrvene einführt. Spülen Sie den Katheter mit ca. 1 ml normaler Kochsalzlösung, um die Platzierung zu bestätigen. Befestigen Sie den Katheter mit Klebeband. Injizieren Sie eine Bolusdosis Fentanyl und Pentobarbital in die Ohrvene (wie in Schritt 1.1 beschrieben). Spülen Sie den Katheter mit 1 ml normaler Kochsalzlösung. Überprüfen Sie, ob das Ferkel betäubt ist, indem Sie die Entzugsreflexe beurteilen. Stellen Sie sicher, dass die erste Person das Ferkel in Rückenlage bringt. Öffnen Sie den Mund und ziehen Sie die Zunge mit einem 10 cm x 10 cm großen Mulltupfer heraus. Halte den Kehlkopf in einer geraden Linie. Stellen Sie sicher, dass Person zwei das Laryngoskop (siehe Materialtabelle) verwendet, um die Zunge anzuheben. Schieben Sie das Laryngoskop vor, um den Kehldeckel anzuheben und die Stimmbänder sichtbar zu machen. Schieben Sie den Endotrachealtubus (ETT, siehe Materialtabelle) durch die Stimmbänder.HINWEIS: Die Verwendung eines ETT mit Manschetten kann das Vordringen des ETT durch die Stimmbänder schwieriger machen. Wenn die Intubation schwierig ist, ist es besonders wichtig, die Vitalfunktionen des Ferkels zu beobachten. Wenn die Vitalwerte abfallen, legen Sie eine Maske über die Schnauze des Ferkels, verbinden Sie die Maske mit einem selbstaufblasenden Beutel und lüften Sie das Ferkel manuell, bis sich die Vitalwerte normalisiert haben. Versuchen Sie dann erneut, zu intubieren. Wenn es immer noch schwierig ist, sollten Sie eine zusätzliche Dosis Pentobarbital in Betracht ziehen. In seltenen Fällen (z. B. Anomalie der oberen Atemwege) sollte eine Tracheotomie durchgeführt werden. Mit erfahrenem Personal ist die Intubation jedoch in der Regel problemlos durchzuführen. Schließen Sie das ETT an einen selbstaufblasenden Beutel an (siehe Materialtabelle) und starten Sie die manuelle Belüftung. Bestätigen Sie die korrekte ETT-Platzierung durch 1) bilaterale und symmetrische Thoraxerhöhung bei der Beatmung, 2) bilaterale und symmetrische Atemgeräusche über den Lungenfeldern ohne Geräusch des Lufteintritts über das Epigastrium, 3) SpO2 – und HR-Reaktionen und 4) Kondensation im ETT. Das ausgeatmete CO2 könnte im Zweifelsfall auch (semi-)quantitativ gemessen werden. Pumpen Sie die ETT-Manschette auf. Befestigen Sie das ETT in einer Tiefe von 12-13 cm (für ein 2 kg schweres Ferkel) mit Klebeband, das in Längshälfte geteilt wurde. Drapieren Sie das Klebeband um den Teil des ETT unmittelbar distal der Frontzähne und fahren Sie um die Schnauze herum fort. Setzen Sie die manuelle Beatmung des Ferkels fort, bis es auf den chirurgischen Eingriffstisch gebracht wird, wo es an ein mechanisches Beatmungsgerät angeschlossen wird. Schließen Sie auf dem Tisch den ETT mit den folgenden Einstellungen an das mechanische Beatmungsgerät an (siehe Materialtabelle): P Insp = 15-20 cm H 2 O,Peep = 5,0 cm H2O, Flow Insp = 8,0 L/min, Frequenz = 30 bpm und T Insp = 0,34 s. HINWEIS: Wenn das Ferkel SpO 2 <90 % hat, können derP-Insp und die Frequenz erhöht werden, bis der SpO2 ≥90 % beträgt. Zusätzlicher Sauerstoff könnte verwendet werden, wenn das Reanimationsprotokoll nicht den Vergleich verschiedener FiO2s beinhaltet. Legen Sie ein Rektalthermometer an und befestigen Sie es mit chirurgischem Klebeband um den Schwanz des Ferkels. Halten Sie die Temperatur des Ferkels (38,5-39,0 °C) mit warmen Decken/Handtüchern, die wie ein Nest um das Ferkel drapiert sind, indem Sie die Temperatur der Heizmatratze unter dem Ferkel einstellen und/oder Gummi-/Latexhandschuhe mit heißem Leitungswasser füllen und in die Handtücher legen, die das Ferkel umgeben. Beobachten Sie die Temperatur des Ferkels während des chirurgischen Eingriffs und führen Sie bei Bedarf temperaturstabilisierende Maßnahmen durch. 6. Chirurgischer Eingriff (DAUER: 20 min) Bereiten Sie alle erforderlichen Geräte vor und füllen Sie alle Katheter mit normaler Kochsalzlösung (Abbildung 1). Notieren Sie den Zeitpunkt des Beginns des chirurgischen Eingriffs auf der CNI. Sterilisieren Sie die Haut des anästhesierten Ferkels mit 5 mg/ml farbigem Chlorhexidin mit 3-5 chirurgischen Schwämmen. Machen Sie mit einem Skalpell einen 2,5 cm langen Hautschnitt auf der rechten Seite des Ferkelhalses. Verwenden Sie Augenlidretraktoren, um die Haut auf beiden Seiten des Schnitts zurückzuziehen. Verwenden Sie eine Arterienzange, um die Vena jugularis interna zu präparieren und freizulegen (Abbildung 2). Legen Sie zwei Nylon 3-0 Nahtfäden unter die Halsvene, um sie stabil zu halten. Halten Sie eine der Nähte in der einen Hand und den zentralen Venenkatheter in der anderen Hand (Abbildung 3). Führen Sie den zentralen Venenkatheter ein und ziehen Sie die Nadel heraus. Binden Sie einen der Nahtfäden, mit denen die Vene um die Vene (und den Katheter) herum gehalten wurde, in dem Bereich, in dem sich der Katheter in der Vene befindet (Abbildung 4).HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Haltenaht nicht zu fest um den Katheter gebunden ist und dass sich der Knoten proximal an der distalen Spitze des Katheters befindet. Mit 1 ml normaler Kochsalzlösung abspülen, um die korrekte Platzierung des Katheters zu bestätigen. Verschließen Sie die Haut mit resorbierbaren 4-0-Nähten. Fentanyl 50 μg/kg/h und eine ausgewogene Kohlenhydrat-Elektrolyt-Lösung (10 mg/ml Glukose, siehe Materialtabelle) an den zentralen Venenkatheter anschließen. Machen Sie mit einem Skalpell einen 2,5 cm langen Hautschnitt auf der linken Seite des Ferkelhalses. Machen Sie den Schnitt etwas medialer als den Schnitt auf der rechten Seite des Halses. Verwenden Sie Augenlidretraktoren, um die Haut auf beiden Seiten des Schnitts zurückzuziehen. Verwenden Sie dann eine Arterienzange, um die Arteria carotis communis (medial des Musculus sternocleidomastoideus) zu präparieren und freizulegen. Platzieren Sie zwei Nylon 3-0-Nahtfäden unter der Arteria carotis communis, um sie stabil zu halten. Halten Sie eine der Nähte in der einen Hand und den zentralen arteriellen Katheter in der anderen. Führen Sie den zentralen arteriellen Katheter ein und ziehen Sie die Nadel heraus. Binden Sie einen der Nahtfäden, mit denen die Arterie um die Arterie (und den Katheter) herum gehalten wurde, in dem Bereich, in dem sich der Katheter in der Arterie befindet.HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Haltenaht nicht zu fest um den Katheter gebunden ist und dass sich der Knoten proximal an der distalen Spitze des Katheters befindet. Mit 1 ml normaler Kochsalzlösung abspülen, um die korrekte Platzierung des Katheters zu bestätigen. Verwenden Sie resorbierbare 4-0-Nähte, um die Katheterflügel auf der Haut zu befestigen und die Haut zu verschließen. Stellen Sie eine Verbindung zur Überwachung des invasiven arteriellen Blutdrucks her (siehe Materialtabelle) und beginnen Sie mit der Aufzeichnung mit der Datenerfassungs- und Analysesoftware.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der invasive arterielle Blutdruckwandler auf Herzhöhe kalibriert ist, um korrekte Blutdruckwerte zu erhalten. Mit einem transparenten Verband abdecken. Nun ist der zentrale arterielle Katheter angelegt. Notieren Sie auf dem CNI, wann die Operation beendet wurde. 7. Stabilisierung (ZEIT: Mindestens 1 Stunde, aber so lange wie nötig, um das Ferkel nach der Operation zu stabilisieren und damit sich das Personal auf die Einleitung der Asphyxie vorbereiten kann) Schließen Sie das Ferkel an das EKG-Überwachungsgerät an (siehe Materialtabelle).Rasieren und entfernen Sie die Haare nach Bedarf, bevor Sie die Elektroden platzieren. Platzieren Sie zwei Elektroden auf jeder Seite des Thorax – auf der medialen Seite jeder oberen Extremität. Platzieren Sie die dritte Elektrode auf der linken Seite des Nabels. Schließen Sie die Leitungen an die Elektroden an und starten Sie die Aufzeichnung mit der Datenerfassungs- und Analysesoftware. Schließen Sie das Ferkel an ein nicht-invasives CO-Überwachungsgerät an (siehe Materialtabelle).Rasieren und entfernen Sie die Haare nach Bedarf, bevor Sie die Elektroden platzieren (siehe Materialtabelle). Platzieren Sie die erste Elektrode auf dem Kopf des Ferkels, direkt hinter den Augen, die zweite auf der linken Seite des Halses, die dritte auf der linken Seite des Bauches, in der Mitte der Achselhöhle auf Höhe des Nabels und die vierte Elektrode auf dem linken Oberschenkel. Geben Sie die relevanten Informationen auf dem Gerät ein und starten Sie die Aufnahme. Aufgrund des begrenzten internen Speichers ist die Abtastrate entsprechend der Dauer des Experiments anzupassen. Schließen Sie das Ferkel an die NIRS-Überwachung an.Rasieren und entfernen Sie die Haare nach Bedarf, bevor Sie die Elektroden platzieren. Platzieren Sie die NIRS-Elektroden (siehe Materialtabelle) auf der Oberseite des Ferkelkopfes hinter der nicht-invasiven CO-Elektrode und sichern Sie sie mit undurchsichtigem Klebeband zum Schutz vor Licht. Schließen Sie das Ferkel gegebenenfalls an zusätzliche Überwachungsgeräte an und führen Sie eine Echokardiographie durch, wenn dies Teil des Versuchsprotokolls ist. Bringen Sie das Ferkel in eine bequeme Position, vorzugsweise in Bauchlage. Führen Sie die Messungen und Registrierungen durch und zeichnen Sie während der Stabilisierungsphase auf dem CRF auf (siehe Schritt 2). Beobachten Sie das Ferkel in Bezug auf Temperatur, SpO2, HR, Blutdruck und Zittern während der Stabilisierungsphase. Passen Sie die Einstellungen des Beatmungsgeräts und die Temperatur des Ferkels an und geben Sie gegebenenfalls eine zusätzliche Anästhesie. 8. Induktion von Asphyxie und Herzstillstand (DAUER: 15-60 min, variiert je nach Ferkel) HINWEIS: Alle beteiligten Mitarbeiter müssen ihre Rollen vor der Einleitung der Asphyxie kennen. Legen Sie einen Zeitpunkt für den Beginn der Asphyxie fest (basierend auf der Dauer der Stabilisierung und der Verfügbarkeit des Personals) und notieren Sie dies auf dem CRF. Notieren Sie die physiologischen Messungen des Ferkels auf dem CNI und entnehmen Sie Blutproben kurz vor der Einleitung der Asphyxie. Beenden Sie die Fentanyl-Infusion kurz vor Beginn der Erstickung. Um die Asphyxie zu starten, drehen Sie den Sauerstoffregler am mechanischen Beatmungsgerät auf 100 % und schalten Sie den Sauerstoffschlauch am Beatmungsgerät auf das Asphyxiegas (8 % O2, 92%N2). Reduzieren Sie die Beatmungsleistung um 10 Aufblasvorgänge/min. Stellen Sie sicher, dass der SpO2 des Ferkels abfällt, um sicherzustellen, dass die Induktion erfolgreich ist. Reduzieren Sie nach 10 Minuten Erstickung die Beatmungsfrequenz um weitere 10 Aufblähungen/min. Nach 10 Minuten Erstickung und danach alle 5 Minuten wird der Säure-Basen-Status gemessen und die physiologischen Maße des Ferkels auf dem CRF notiert. Fahren Sie bis zum Herzstillstand fort. Reduzieren Sie nach 20 Minuten Erstickung die Beatmungsfrequenz um weitere 10 Aufblasungen/min. Nach 30 Minuten Erstickung wird die ETT mit einer arteriellen Pinzette geklemmt. Wenn der MAP unter 20 mm Hg fällt, beginnen Sie mit der kontinuierlichen Auskultation des Herzens.HINWEIS: Ein Herzstillstand ist definiert als ein nicht hörbarer Herzschlag durch Auskultation und/oder den Verlust der arteriellen Pulsation. Beachten Sie, dass es zu impulsloser elektrischer Aktivität (PEA) im EKG kommen kann. Stellen Sie sicher, dass die Person das Herz auskultiert. Rufen Sie laut, wenn der Herzschlag nicht mehr hörbar ist (Herzstillstand), während Sie die ETT-Klemme entfernen. Stellen Sie sicher, dass Person zwei den Asphyxie-Gasschlauch am Beatmungsgerät zurück zum Sauerstoffauslass schaltet. Notieren Sie den Zeitpunkt des Herzstillstands auf dem CRF und starten Sie einen Timer. Stellen Sie die FiO 2 so ein, wie sie durch das Protokoll zugewiesen wurde (in dieser Studie wurden die Ferkel randomisiert, um eine FiO2 von 0,21 oder 1,0 zu erhalten). Stellen Sie die Einstellungen des Beatmungsgeräts wie folgt ein: P Insp = 30cm H 2 O, Peep = 5,0 cmH2O, Flow Insp = 8,0 l/min, Frequenz = 40 bpm und TInsp = 0,34 s. Entnahme von Blutproben ab dem Zeitpunkt des Herzstillstands, wie in Schritt 2.5 beschrieben. 9. Herz-Lungen-Wiederbelebung (HLW) (DAUER: 0-15 min) HINWEIS: Die Herz-Lungen-Wiederbelebung kann gemäß den Richtlinien28 des International Liaison Committee on Resuscitation (ILCOR) durchgeführt werden, mit einem Verhältnis von 3:1 zwischen Thoraxkompression und Beatmung oder einem unterschiedlichen Verhältnis von Thoraxkompression zu Beatmung, je nach Ziel der Studie. Wenn Sie die von ILCOR empfohlene 3:1-HLW verwenden, führen Sie die folgenden Schritte aus.Beatmung des Ferkels für 30 s nach dem Herzstillstand. Beginnen Sie dann mit der Herzdruckmassage und streben Sie ein Verhältnis von 3:1 zwischen Brustkompression und Beatmung an.HINWEIS: Da das Beatmungsgerät die Beatmungen durchführt und nicht eine Person, können die Herzdruckmassagen und Beatmungen manchmal gleichzeitig/unkoordiniert sein. Komprimieren Sie den Brustkorb bis zu einer Tiefe von 1/3 des anteroposterioren Brustdurchmessers, lassen Sie den vollen Brustrückstoß zu und wenden Sie die Technik der umlaufenden Hände mit zwei Daumen an. Ziel ist es, einen systolischen arteriellen Druck ≥20 mmHg zu erzeugen. Verabreichen Sie Adrenalin (0,02-0,03 mg/kg) i.v. nach 30 s Herzdruckmassage und dann alle 3 Minuten HLW (maximal vier Dosen). Nach jeder Adrenalingabe mit 1 ml normaler Kochsalzlösung spülen. Bestimmen Sie die ROSC durch Beobachtung der arteriellen Blutdruckmessungen und des EKGs und bestätigen Sie dies durch eine Herzauskultation. Die Definition von ROSC ist eine stabile, nicht unterstützte HR ≥100 bpm. Setzen Sie die Wiederbelebungsbemühungen bis zum ROSC oder für maximal 15 Minuten fort. Wenn die Herz-Lungen-Wiederbelebung nicht innerhalb von 15 Minuten erfolgreich ist, stellen Sie die Wiederbelebungsbemühungen ein, geben Sie den Todeszeitpunkt an und notieren Sie es auf dem CRF. Wenn die Wiederbelebungsbemühungen erfolgreich sind, notieren Sie auf dem CRF die Zeit des ROSC, die Dauer der HLW in Sekunden und die Anzahl der verabreichten Adrenalindosen. Entnehmen Sie Blutproben und CNI-Registrierungen so bald wie möglich nach ROSC und setzen Sie die Registrierungen wie in Schritt 2 beschrieben für weitere 9,5 h (570 min) fort. 10. Post-ROSC-Beobachtung (DAUER: 9,5 h) Beginnen Sie die Fentanyl-IV-Infusion zunächst mit 25 μg/kg/h und titrieren Sie entsprechend den klinischen Auswirkungen/Anforderungen.HINWEIS: Während und nach der Asphyxie wird die Stoffwechselrate reduziert, daher die niedrigere Dosis von Fentanyl IV. Einige Ferkel benötigen jedoch möglicherweise höhere Infusionsraten, daher ist es wichtig, die Vitalfunktionen und Reflexe des Ferkels zu beobachten. Überwachen Sie das Ferkel 9,5 h lang sorgfältig. Passen Sie die Einstellungen des mechanischen Beatmungsgeräts nach Bedarf an, um den SpO 2 ≥90 % zu halten und die Normokapnie (temperaturangepasster Partialdruck von CO 2 (pCO2) von 5-7,5 kPa) aufrechtzuerhalten). Halten Sie die Temperatur des Ferkels bei 38,5-39,0 °C und führen Sie die angegebenen temperaturkorrigierenden Maßnahmen durch.HINWEIS: Die Ferkel neigen dazu, während und nach der Asphyxie unterkühlt zu werden. Entnehmen Sie Proben und CRF-Registrierungen zu vorgegebenen Zeitpunkten, die vom CRF vorgegeben werden (Schritt 2). Nach 9,5 h post-ROSC-Beobachtung wird das Ferkel euthanasiert (Schritt 11).HINWEIS: Einige Ferkel überleben möglicherweise nicht die gesamten 9,5 Stunden nach der ROSC-Beobachtung. Wenn das Ferkel Anzeichen von erheblichem Stress und einer Verschlechterung des Zustands zeigt, führen Sie die Euthanasie früher durch. 11. Euthanasie (DAUER: 10 min) Bereiten Sie den Seziertisch mit der erforderlichen chirurgischen Ausrüstung, Fläschchen zur Aufbewahrung der Gewebeproben und flüssigem Stickstoff zum Einfrieren der Proben vor. Entnahme der Proben am Ende der Studie (570 min) wie in Schritt 2 beschrieben. Pentobarbital i.v. 150 mg/kg verabreichen. Führen Sie eine Sektion durch, legen Sie die Organproben in markierte kryogene Röhrchen und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein. Bewahren Sie eine Gehirnhälfte nach Belieben in Formalin auf. Legen Sie die Proben aus dem Experiment (Vollblut-, Plasma-, Urin-, Liquor- und Organproben) in einen Gefrierschrank von −80 °C oder lagern Sie sie auf eine andere Weise, die es für die geplanten Analysen vorschreibt. Abbildung 1: Steriltisch mit chirurgischen Instrumenten. Die chirurgischen Instrumente werden vor Beginn der Halsoperation vorbereitet und auf einem sterilen Tisch gelagert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Vena jugularis interna. Die Vena jugularis interna, nachdem sie frei präpariert und freigelegt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Legen des zentralen Venenkatheters. Die Nahtfäden werden kurz vor dem Einlegen des zentralen Venenkatheters gehalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Nähte zur Befestigung des zentralen Venenkatheters. Die Nähte werden um die Vene (und den Katheter) gebunden, um den Katheter in der Vene zu fixieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Representative Results

Nachdem die Ferkel instrumentiert und stabilisiert wurden, werden EKG- und Blutdruckmessungen kontinuierlich mit einer Datenerfassungs- und Analysesoftware erfasst. Die hämodynamischen Veränderungen während der Asphyxie sind in der Software leicht zu erkennen (Abbildung 5). Der Blutdruck sinkt während der Erstickung allmählich bis zum Herzstillstand, wenn der Blutdruck = 0 ist. Nachdem ROSC erreicht ist, steigt der Blutdruck an und normalisiert sich nach einiger Zeit wieder. Die Blutdruck- und EKG-Daten können für verschiedene Arten von Analysen verwendet werden, z. B. für die Berechnung des koronaren Perfusionsdrucks während der Herz-Lungen-Wiederbelebung und für Veränderungen des Blutdruck- und EKG-Rhythmus und der Morphologie vor, während und/oder nach der Erstickung. Das Herzschlagvolumen und der Herzindex werden kontinuierlich mit der Impedanzkardiographie (einer nicht-invasiven Messung des Herzzeitvolumens) überwacht21. Um die Herzschädigung zu untersuchen, werden myokardiale Marker für oxidativen Stress und anaeroben Stoffwechsel gemessen19. Darüber hinaus können kardiale Enzyme, einschließlich kardiales Troponin T, im Plasma gemessen werden (Ergebnisse noch nicht veröffentlicht). Die Asphyxie verändert die Physiologie des Ferkels. Abbildung 6 zeigt ein Beispiel dafür, wie sich HR (Abbildung 6A), MAP (Abbildung 6B), pH (Abbildung 6C), pCO2 (Abbildung 6D), Basenüberschuss (Abbildung 6E) und Laktat (Abbildung 6F) während des Experiments verändern. Erwartungsgemäß nehmen MAP, pH-Wert und Basenüberschuss während der Asphyxie ab, während pCO2 und Laktat zunehmen (gemischte respiratorische und metabolische Azidose). Gegen Ende des Experiments normalisieren sich die Werte. In der Vergangenheit wurden Experimente mit tracheotomierten Ferkeln 11,13,15,16,19 (d. h. mit einem leckfreien Atemweg) durchgeführt. Um den chirurgischen Stress zu begrenzen, wurden die Ferkel in Versuchen ab 2019 mit ETTs ohne Cuff endotracheal intubiert. In diesenExperimenten 21 wurden deutlich niedrigere ROSC-Raten beobachtet. Daher haben wir in neueren Experimenten die ROSC-Raten mit nicht gefesselten und gefesselten ETTs verglichen. Bei Verwendung von ETTs ohne Manschette erreichten 7/19 Ferkel ROSC und bei Verwendung von ETTs mit Manschetten erreichten 5/5 Ferkel ROSC (p = 0,012) (unveröffentlichte Ergebnisse). Diese Erkenntnis unterstreicht die Bedeutung eines leckagefreien Atemwegs in diesem Modell. Abbildung 5: Kontinuierliche Datenstichprobenentnahme mit der Datenerfassungs- und Analysesoftware. Ein Beispiel dafür, wie die kontinuierliche Datenstichprobenentnahme in der Datenerfassungs- und Analysesoftware aussieht. (A) BP für das gesamte Experiment. (B) Schlag-zu-Schlag-Komplexe von Blutdruck und EKG. Verschiedene Teile des Experiments sind in Tafel (A) markiert: 1) Beginn der Asphyxie, 2) Herzstillstand und Herz-Lungen-Wiederbelebung, 3) ROSC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 6: Veränderungen der kardiovaskulären und metabolischen Variablen während des Experiments. Eine Demonstration, wie sich verschiedene Variablen im Laufe des Experiments ändern. Die sechs angezeigten Zeitpunkte sind wie folgt: kurz vor Beginn der Hypoxie (Baseline), 10 min Hypoxie, Herzstillstand, ROSC, 120 min nach ROSC und Ende der Studie (570 min nach ROSC). (A) Herzfrequenz (HF), (B) mittlerer arterieller Druck (MAP), (C) pH-Wert, (D) Partialdruck von CO 2 (pCO2), (E) Basenüberschuss und (F) Laktat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Dieses Ferkelmodell ist zeitaufwändig und technisch anspruchsvoll, mit mehreren kritischen Schritten. Um eine vernünftige Überlebensrate zu gewährleisten, ist ein feines Gleichgewicht zwischen den Medikamenten, den chirurgischen Eingriffen und der Methode zur Herbeiführung eines Herzstillstands erforderlich. Da das Protokoll relativ lang ist und mehrere kritische Schritte umfasst, erfordert die Durchführung der Experimente eine gründliche Vorbereitung und ein engagiertes und gut funktionierendes Team, und die Experimente sollten in Einrichtungen durchgeführt werden, die Erfahrung mit Großtierversuchen haben. Unsere Forschungsteams haben Experimente an ein bis drei Ferkeln parallel durchgeführt. Es wird empfohlen, während der Versuche immer mindestens zwei Personen anwesend zu haben und mindestens drei Personen, wenn die Versuche mit drei Ferkeln gleichzeitig durchgeführt werden sollen.

Zu den besonders kritischen und technisch herausfordernden Teilen der Experimente gehören die folgenden: 1) Sicherstellen, dass alle Geräte funktionieren und alle Datenprobenwerkzeuge verfügbar, funktionsfähig und kalibriert sind; 2) gute und zufriedenstellende mechanische Beatmung, insbesondere vor dem Ersticken und während der Herz-Lungen-Wiederbelebung; 3) chirurgischer Eingriff; 4) die Induktion von Asphyxie; 5) Feststellung eines Herzstillstands; 6) Herz-Lungen-Wiederbelebung; und 7) die Probenahme von Proben, insbesondere an zeitkritischen Punkten wie Herzstillstand und ROSC. Die wichtigsten Schritte im Protokoll sind die Induktion von Asphyxie und die Feststellung eines Herzstillstands. In den ersten Experimenten wurde dem Asphyxiegas CO2 zugesetzt, um die gemischte respiratorische und metabolische Azidose der perinatalen Asphyxie genau nachzuahmen 10,11,13,14,15,16,20. In späteren Experimenten 7,21,22, in denen kein CO2 -Gas verfügbar war, wurde jedoch auch beobachtet, dass die Verringerung der mechanischen Beatmungsrate mit anschließendem Abklemmen des ETT nach 20-30 min zu einer gemischten respiratorischen und metabolischen Azidose führte. Hohe CO2 -Werte bei Herzstillstand sind nicht nur wichtig für die Nachahmung der klinischen Situation, sondern können auch die ROSC beeinflussen. Der Grund dafür könnte sein, dass der Herzstillstand bei einem bestimmten pH-Wert aufzutreten scheint und der pH-Wert sowohl von Laktat als auch von CO2 abhängt. Da die Hyperkapnie leichter rückgängig gemacht werden kann als die Laktatazidose, kann vor allem die respiratorische versus metabolische Azidose bestimmen, wie schnell sich die Ferkel von der Asphyxie erholen. Andere Ferkelmodelle der perinatalen Asphyxie oder HIE beginnen die Reoxygenierung/Reanimation oft vor dem Herzstillstand, typischerweise entsprechend den MAP-Werten oder der Dauer der Asphyxie (z. B. 45 min Asphyxie 29, 2 h Asphyxie 30, MAP von 20 mmHg 31, MAP von 30-35 mmHg 30, MAP70% unter dem Ausgangswert29,32). Der Vorteil dieses Modells besteht darin, dass es durch die Induktion eines Herzstillstands möglich ist, die Herz-Lungen-Wiederbelebung von Neugeborenen und Probendaten vor, während und unmittelbar nach dem Herzstillstand zu untersuchen. Insbesondere der zufällige Befund, dass ein erheblicher Teil der Ferkel während eines Herzstillstands PEA 7,33 aufweist, kann die Anwendbarkeit des Modells über das perinatologische Feldhinaus erhöhen 34.

Im Laufe der Jahre wurde das Modell verfeinert, um die Exposition der Ferkel gegenüber Beruhigungsmitteln und chirurgischen Eingriffen zu minimieren und die Datenprobenahme und -registrierung zu verbessern. Frühere Protokolle 10,11,13,14,15,16,20 beinhalteten die Einleitung einer Anästhesie mit Sevofluran. Dies wurde nun aufgegeben, da das aktuelle Protokoll die direkte Einrichtung eines intravenösen Zugangs durch eine Ohrvene und intravenöse Medikamente vorsieht. Dies ist möglich, da die Belastung des Ferkels einfach dadurch vermieden wird, dass das Ferkel vor dem Legen des peripheren intravenösen Katheters durch einen geschulten Arzt in ein Handtuch gewickelt wird. Midazolam wurde auch in den ersten Versuchsprotokollen verwendet; Die subjektive Einschätzung des Forschers (R.S.), der die überwiegende Mehrheit der Autopsien durchführte, war jedoch, dass sich das Gehirn während der Autopsie in einem schlechteren Zustand befand, wenn Midazolam als kontinuierliche Infusion verwendet wurde. Daher verwenden wir Fentanyl i.v. nur noch zur Aufrechterhaltung der Anästhesie. Midazolam kann in Bolusdosen angewendet werden, wenn das Ferkel Anzeichen von Stress zeigt und Fentanyl und/oder Pentobarbital keine Wirkung zeigen; Wir mussten es jedoch fast nie verabreichen.

In früheren Experimenten wurden die Ferkel mit einem fest gesicherten Endotrachealtubus, der durch einen subglottischen Schnitt geführt wurde, tracheotomiert. Dieses Verfahren sorgt für einen leckagefreien Atemweg, verursacht aber eine chirurgische Belastung für das Ferkel. Auf der anderen Seite ist die endotracheale Intubation aufgrund der größeren oberen Atemwege des Ferkels mit einer erheblichen Leckage verbunden, wenn ETTs ohne Manschette verwendet werden. Daher haben wir begonnen, ETTs mit Manschetten zu verwenden, was zu null Leckagen und signifikant höheren ROSC-Raten geführt hat, vergleichbar mit Experimenten mit tracheotomierten Ferkeln. Darüber hinaus wurden einige Anpassungen in Bezug auf die Datenstichprobe vorgenommen. Einige der früheren Experimente 7,19,22,33,35,36 beinhalteten die Verwendung einer Flusssonde, die um die linke Arteria carotis communis platziert wurde. Diese Strömungssonde war in den letzten Jahren an unserem Institut in Oslo nicht ohne weiteres verfügbar. Unser Labor in Edmonton verwendet immer noch eine Carotis-Durchflusssonde, deren Verwendung dem Modell wertvolle zusätzliche hämodynamische Daten liefern könnte. Einige frühere Experimente beinhalteten auch die Verwendung eines Druckvolumenkatheters, der in die linke Herzkammer eingeführt wurde, indem er durch eine der Halsschlagadern vorgeschoben wurde. Die Verabreichung von Herzdruckmassagen verwirrte die Druckvolumen-Katheterregistrierungen und führte in einigen Fällen sogar zu Katheterversagen und -bruch. Daher wurde seine Verwendung im Verhaftungsmodell aufgegeben. Vor kurzem wurden nicht-invasive CO-Monitore in das Protokoll aufgenommen, und wir konzentrieren uns auf die Optimierung der EKG-Signale während des Herzstillstands und der Herz-Lungen-Wiederbelebung, da sie wertvolle Informationen über die EKG-Morphologie und die PEA liefern könnten. Schließlich wurde die Post-ROSC-Beobachtungszeit von 4 h auf 9,5 h verlängert, da 4 h zu kurz sind, um histopathologische Veränderungen, Zelltod und Veränderungen einiger Biomarker erkennen zu können.

Eine der wichtigsten Einschränkungen dieses Modells und der Verwendung von Ferkeln im Allgemeinen als translationales Modell besteht darin, dass im Gegensatz zur Kreißsaal-HLW der postnatale kardiopulmonale Übergang bei den Ferkeln bereits stattgefunden hat. Es ist unwahrscheinlich, dass die Ferkel offene fetale kardiovaskuläre Shunts und einen hohen Lungendruck haben, wie es bei einem erstickten Neugeborenen der Fall wäre. Obwohl eine Studie von Fugelseth et al.37, die eine frühere Version dieses Ferkel-Asphyxie-Modells (nicht Herzstillstand) verwendete, zeigte, dass sich Gefäßshunts bei den Ferkeln während der Asphyxie wahrscheinlich wieder öffnen, können ihre Reaktionen auf Beatmung und hämodynamische Unterstützung unterschiedlich sein. Daher sind physiologische Messungen möglicherweise nicht immer repräsentativ für ein sich wandelndes menschliches Neugeborenes. Es gibt auch einige anatomische Unterschiede zwischen Ferkeln und Neugeborenen, wie z. B. die größeren oberen Atemwege bei den Ferkeln, die eine ETT-Leckage verursachen (was bedeutet, dass es wichtig ist, ETTs mit Manschette zu verwenden) und eine höhere Basaltemperatur.

Trotz dieser Einschränkungen gibt es in der globalen Forschungsgemeinschaft eine lange Tradition, Ferkel als translationales Modell für perinatale Asphyxie zu verwenden. Das Schwein ähnelt dem Menschen in Bezug auf Anatomie, Physiologie, Histologie, Biochemie und Entzündung38, und abgesehen von einem niedrigeren Geburtsgewicht (1,5-2,5 kg) hat das neugeborene Ferkel eine ziemlich ähnliche Größe wie das menschliche Neugeborene. Die Größe und Anatomie ermöglichen die Instrumentierung, Überwachung, Bildgebung und das Sammeln biologischer Proben, die mit dem menschlichen Neugeborenen vergleichbar sind. Dieses Modell ermöglicht auch Wiederbelebungsuntersuchungen, da Herzdruckmassagen relativ einfach durchzuführen sind wie bei menschlichen Neugeborenen und Schweine eine Herzanatomie und -physiologie aufweisen, die der des Menschen ähnelt39, einschließlich der koronaren Blutverteilung, der Blutversorgung des Reizleitungssystems, des histologischen Erscheinungsbildes des Myokards und der biochemischen und metabolischen Reaktionen auf ischämische Verletzungen40. Ein weiterer wichtiger Faktor ist, dass das neugeborene Ferkel eine vergleichbare perinatale Gehirnentwicklung wie das menschliche Neugeboreneaufweist 41 und die Asphyxie zu einer biochemischen Reaktion mit Hyperkapnie und gemischter respiratorischer und metabolischer Azidose führt, die der des erstickten Neugeborenen ähnelt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Modell der perinatalen Asphyxie technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig ist. Es liefert jedoch wertvolle Informationen über die physiologischen und hämodynamischen Veränderungen während der perinatalen Asphyxie, ermöglicht Wiederbelebungsstudien bei Neugeborenen und liefert wertvolle Informationen über die physiologischen Veränderungen vor, während und nach einem Herzstillstand, die neben der Perinatologie auch für andere Forschungsbereiche der Medizin von Interesse sein könnten.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten uns bei allen Forschungsstipendiaten und Forschern bedanken, die dazu beigetragen haben, dieses Ferkelmodell der perinatalen Asphyxie und des Herzstillstands in unseren Einrichtungen zu etablieren, zu entwickeln und zu verfeinern. Wir danken den Mitarbeitern der Tierforschungseinrichtungen des Instituts für Chirurgische Forschung und des Instituts für Vergleichende Medizin der Universität Oslo, Norwegen, und den Forschungstechnikern der University of Alberta, Edmonton, Kanada, für die jahrelange Zusammenarbeit. Wir danken dem Medical Student Research Program der Universität Oslo, dem norwegischen Forschungsrat und der norwegischen Gesellschaft für SIDS und Stillbirth für die finanzielle Unterstützung dieser Publikation.

Materials

Acid-base machine (ABL 800 Flex) Radiometer Medical ApS, Brønshøj, Denmark 989-963
AcqKnowledge 4.0 software for PC Biopac Systems Inc., Goleta, CA, USA ACK100W
Adhesive aperture drape OneMed Group Oy, Helsinki, Finland 1505-01
Adrenaline (1 mg/mL) Takeda AS, Asker, Norway Vnr 00 58 50 Dilute 1:10 in normal saline to 0.1 mg/mL
Arterial cannula 20 G 1,10 mm x 45 mm Becton Dickinson Infusion Therapy, Helsingborg, Sweden 682245
Arterial forceps Any
Asphyxia gas, 8% oxygen in nitrogen Linde Gas AS (AGA AS), Oslo, Norway 110093
Benelyte, 500 mL Fresenius Kabi, Norge AS, Halden, Norway 79011
Biopac ECG and invasive blood pressure modules, Model MP 150 Biopac Systems Inc., Goleta, CA 93117, USA ECG100C, MP150WSW
Box of cardboard for sample storage Syhehuspartner HF, Oslo, Norway 2000076
Cannula , 23G x 1 1/4"- Nr.14 Beckton Dickinson S.A., Fraga, Spain 300700
Cannula, 18G x 2" Beckton Dickinson S.A., Fraga, Spain 301900
Cannula, 21G x 1 1/2"- Nr.2 Beckton Dickinson S.A., Fraga, Spain 304432
Centrifuge (Megafuge 1.0R)  Heraeus instruments, Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau, Germany 75003060
Chlorhexidin colored 5 mg/mL Fresenius Kabi Norge AS, Halden, Norway 00 73 24
Combi-Stopper B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4495101
CRF form Self-made
Desmarres eyelid retractor 13 cm x 18 mm Any
Digital Thermometer ama-digit ad 15 th Amarell, Kreuzwertheim, Germany 9243101
ECG electrodes, Skintact Leonhard Lang, Innsbruck, Austria FS-TC1 /10
Electric heating mattress Any
Extension set Codan Medizinische Geräte GmbH & Co KG, Lensahn, Germany 71.4021
Fentanyl (50 µg/mL) Hameln, Saksa, Germany 00 70 16
Fine wood chips Any
Finnpipette F1, 100-1000 µL VWR, PA, USA 613-5550
Fully equipped surgical room
Gas hose Any
Gauze swabs 5 cm x 5 cm Bastos Viegas,.a., Penafiel, Portugal
Heparin, heparinnatium 5000 IE/a.e./mL LEO Pharma AS, Ballerup, Denmark 46 43 27
HighClean Nonwoven Swabs, 10 cm x 10 cm Selefa, OneMed Group Ay, Helsinki, Finland 223003
ICON  Osypka Medical GmbH, Berlin, Germany Portable non-invasive cardiometer
ICON electrodes/ECG electrodes, Ambu WhiteSensor WSP25 Ambu A/S, Ballerup, Denmark WsP25-00-S/50
Infusomat Space medical pump B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 8713050
Invasive blood pressure monitoring system Codan pvb Critical Care GmbH, Forstinning, Germany 74.6604
Laryngoscope SunMed Greenlinen blade No 2  KaWe Medical, Asperg, Germany
Leoni plus mechanical ventilator  Löwenstein Medical SE & Co. KG, Bad Ems, Germany
Liquid nitrogen 230 L Linde Gas AS (AGA AS), Oslo, Norway 102730
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml Forsyningssenteret, Trondheim, Norway 72.690.001
Microcuff endotracheal tube, size 3.5 Avanos, GA, USA 35162
Needle holder Any
Neoflon, peripheral venous catheter, 24 G 0.7 mm x 19 mm Becton Dickinson Infusion Therapy AB, Helsingborg, Sweden 391350
Neonatal piglets 12-36 h of age As young as possible
NIRS electrodes, FORE-SIGHT Single Non-Adhesive Sensor Kit Small Cas Medical systems Inc., Branford Connecticut, USA 01-07-2000
NIRS machine, FORE-SIGHT Universal, Cerebral Oximeter MC-202, Benchtop regional oximeter FORE-SIGHT Cas Medical systems Inc., Branford Connecticut, USA 01-06-2020 May also use INVOS, Covidien
Normal saline, NaCl 9 mg/mL, 500 mL. Fresenius Kabi Norge AS, Halden, Norway Vare nr. 141387 Unmixed
Normal saline, NaCl 9 mg/mL, 500 mL. Fresenius Kabi Norge AS, Halden, Norway 141388 For IV blood pressure monitoring, add heparin (0.2 ml heparin 5000 IE/a.e./mL in 500 mL of 0.9% NaCl)
Nunc Cryogenic Tubes 1.8 mL VWR, PA, USA 479-6847
Original Perfusor Line, I Standard PE B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 8723060
Oxygen saturation monitor, MasimoSET, Rad 5 Masimo, Neuchâtel, Switzerland 9196
Oxygen saturation monitor, OxiMax N-65 Covidien LP (formerly Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, USA N65-PDN1
Pentobarbital (100 mg/mL) Norges Apotekerforening, Oslo, Norway Pnr 811602
Pipette tips VWR, PA, USA 732-2383
Plastic container with holes Any Has to allow for circulation of air
Printer labels B-492, hvit, 25 mm x 9 mm, 3000 labels VWR, PA, USA BRDY805911 For nunc tubes
Razor, single use disposable Any
Rubber gloves Any
Rubber hot water bottles Any
Self-inflating silicone pediatric bag 500 ml Laerdal Medical, Stavanger, Norway 86005000
Smallbore T-Port Extension Set B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 471954
Sterile surgical gloves latex, Sempermed supreme Semperit Technische Produkte Ges.m.b.H., Vienna, Austria size 7: 822751701 Different sizes
Stethoscope  Any
Stopcocks, 3-way, Discofix B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 16494C
Stylet size 3.5  Any
SunMed Greenlinen laryngoscope blade No 2  KaWe Medical, Asperg, Germany
Surgical blade, size 15 Swann Morton LTD, Sheffield England 205
Surgical forceps Any
Surgical scissors Any
Surgical sponges, sterile Mölnlycke Health Care, Göteborg, Sweden C0130-3025
Surgical swabs Mölnlycke Health Care, Göteborg, Sweden 159860-00
Surgical tape Micropore 2.5 cm x 9.1 m  3M Norge AS, Lillestrøm, Norway 153.5
Suture, Monsoft Monofilament Nylon 3-0 Covidien LP (formerly Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, USA SN653
Suture, Polysorb Braided Absorbable Covidien LP (formerly Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, USA GL884
Syringe 0.01-1 mL Omnifix F Luer Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 9161406V Used for acid base blood sampling. Flush with heparin
Syringe 10 mL Omnifix Luer Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4616103V
Syringe 2.5 mL BD Plastipak Beckton Dickinson S.A., Madrid, Spain 300185 Used for blood sampling. Flush with heparinized NaCl
Syringe 20 mL Omnifix Luer Loc Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4617207V
Syringe 20 mL Omnifix Luer Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4616200V
Syringe 5 mL Omnifix Luer Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4616057V
Syringe 50 mL Omnifix Luer Lock Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4617509F
Syringe 50 mL Omnifix Luer Solo B. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germany 4616502F
Table drape sheet, asap drytop Asap Norway AS, Skien, Norway 83010705
Tape Tensoplast 2.5 cm x 4.5 m  BSN Medical, Essity Medical Solutions, Charlotte, NC, USA 66005305, 72067-00
Timer Any
Towels Any
Transparent IV-fixation Mediplast AB, Malmö, Sweden 60902106
Ultrasound gel Optimu Medical Solutions Ltd. Leeds, UK 1157
Ultrasound machine, LOGIQ e GE Healthcare, GE Medical Systems, WI, USA 5417728-100
Utility drape, sterile OneMed Group Oy, Helsinki, Finland 1415-01
Vacuette K3E K3EEDTA 2mL Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Austria 454222
Venflon Pro Safety 22 G 0.9 mm x 25 mm Becton Dickinson Infusion Therapy, Helsingborg, Sweden 393222
Ventilation mask made to fit tightly around a piglet snout Any Typically cone shaped
Weight Any
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References

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Stenersen, E. O., Olsen, A., Melheim, M., Solberg, R., Dannevig, I., Schmölzer, G., Cheung, P., Nakstad, B., Saugstad, O. D., Rønnestad, A., Solevåg, A. L. A Piglet Perinatal Asphyxia Model to Study Cardiac Injury and Hemodynamics after Cardiac Arrest, Resuscitation, and the Return of Spontaneous Circulation. J. Vis. Exp. (191), e64788, doi:10.3791/64788 (2023).
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