ניתוח תמונת ברקוד מרובה פרופיל חיסוני ואפיון מיפוי מרחבי באנליזה חד-תאית של דגימות רקמת פרפין

מחקר רטרוספקטיבי זה אושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של מרכז הסרטן MD Anderson באוניברסיטת טקסס. דגימות רקמת FFPE נאספו ממטופלים ב- MD Anderson כחלק מטיפול סטנדרטי שגרתי. לא בוצעו התערבויות אבחוניות או טיפוליות. התקבלה הסכמה מדעת של המטופלים לשימוש בדגימות שנאספו למחקר ולפרסום. 1. מקורות נוגדנים המשמשים לעיצוב לוח הנוגדנים צור פאנל נוגדנים להדמיה מרובת משתתפים לאחר ששקל בקפידה את איכות הרקמות והחלבונים המעניינים. שלושה מקורות נוגדנים נלקחים בחשבון עבור תכנון פאנל הנוגדנים: 1) נוגדנים מאומתים באופן מסחרי מלא, 2) נוגדנים מרובי מולקולות המוקרנות בטכנולוגיית הדמיה מרובה, ו -3) נוגדנים המשותפים למשתמש הקצה.הערה: נוגדנים המוקרנים בטכנולוגיית הדמיה מרובבת הוכחו כיעילים והם זמינים מספקים. נוגדנים מוקרנים אלה יכולים להיות מיושמים על צביעת תמונה מרובבת לאחר הצמדה אוליגונוקלאוטיד על ידי המשתמש. אם לא ניתן למצוא חלבון מעניין במקורות שהוזכרו לעיל, השתמש בשיבוטים של נוגדנים הידועים כעובדים עם IHC. בנוסף, איזוטיפים של IgG ולא שיבוטים של IgM מומלצים לטכנולוגיית הדמיה מרובת משתתפים זו בשל שיעור הכשל הגבוה יותר עם IgM מאשר עם שיבוטים של IgG. 2. לפני הצמדת נוגדנים בעת זיהוי שיבוטים של נוגדנים לצמידות באמצעות ברקודי הדמיה מרובה, שקול לרכוש נוגדנים ללא נשא במי מלח חוצצי פוספט (PBS) או במאגר דומה. חלבונים נשאים, כולל BSA, גלוטן, גליצרול ותוספי חלבון אחרים, ידועים כמפחיתים את יכולת הצמידות. בחר את שיבוט הנוגדנים המתאים ביותר, ותמיד מטב את תנאי הצביעה (כלומר, שליפת אנטיגן וטיטרציה) לפני הצמידה. עשה זאת על ידי החלת שיבוט נוגדנים לא מצומד על רקמה חיובית ושלילית עבור נוגדן זה באמצעות תקן IF או IHC.הערה: אם נוגדן מטוהר אינו זמין מסחרית, יש לבצע תהליך טיהור נוגדנים לפני הצמידה. הליך הטיהור המשמש עם ערכות טיהור נוגדנים אינו נדון כאן. 3. צימוד נוגדנים להשיג את ריאגנטים צימוד נוגדנים. ערכות צימוד זמינות מסחרית מכילות פתרון חסימת מסנן, פתרון הפחתה 2, תמיסת צימוד, תמיסת טיהור, תמיסת אחסון נוגדנים (כולם מאוחסנים ב- 4 ° C) ותמיסת הפחתה 1 (מאוחסנים ב -20 ° C). צימודהערה: נוגדן מטוהר מטופל בחומר מחזר, המאפשר למאדים המופחתים של הנוגדן להגיב עם ברקוד ההדמיה המרובב המשמש בטכנולוגיה זו, ובכך ליצור קשר קוולנטי. תהליך זה לוקח בערך 4.5 שעות ומביא בערך 120 μL של נוגדן מצומד, אשר קיימא במשך 1 שנה. כל הספין דאון מתבצע בטמפרטורת החדר (RT), והזרימה מושלכת למעט בשלב האחרון (3.2.9), שבו צינור איסוף מכיל את הנוגדן המצומד.יש לשאוף ולמרוח 500 μL של תמיסת חסימת המסנן באמצעות פיפטה על עמודות מסנן חיתוך המשקל המולקולרי של 50 kDa ולהסתובב כלפי מטה במהירות של 12,000 x גרם למשך 2 דקות כדי לחסום קשירת נוגדנים לא ספציפיים.הערה: אם ניתן להבחין בתמיסה שיורית בראש העמודה, הפוך את המסנן בצינור האיסוף וסובב כלפי מטה במהירות של 3,000 x גרם למשך 2 דקות. פיפטה 50 מיקרוגרם של הנוגדן בנפח 100 μL של תמיסה לעמודת המסנן, וסחרור כלפי מטה ב 12,000 x גרם במשך 8 דקות.הערה: השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ריכוז הנוגדן המטוהר ולחשב את נפח התמיסה המתאים ל- 50 מיקרוגרם של הנוגדן. אם נפח תמיסת הנוגדנים הוא פחות מ -100 μL, התאם את עוצמת הקול ל -100 μL על ידי הוספת 1x PBS. שמור 1 מיקרוגרם של נוגדן לא מצומד לאישור הצמדה (שלב 4.4). פיפטה 260 μL של תערובת מאסטר הפחתה (20 μL של תמיסת הפחתה 1 מעורבב עם 825 μL של תמיסת הפחתה 2, אשר מספיק עבור שלוש תגובות צימוד נוגדנים) לכל עמודת מסנן. מערבבים בעדינות את תערובת האב במשך 2-3 שניות, או פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התמיסה עם הנוגדן. יש לדגור ב-RT למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, סובבו את עמודות המסנן כלפי מטה במהירות של 12,000 x גרם למשך 8 דקות. הוסף 450 μL של תמיסת צימוד לעמודות המסנן, וסובב כלפי מטה ב- 12,000 x גרם למשך 8 דקות. השהה מחדש את הברקוד הרצוי ב- 10 μL מים ללא נוקלאז ו- 210 μL של תמיסת צימוד.הערה: יש להכין תג נוגדן מיד לפני השימוש להכתמה. אין לעשות שימוש חוזר ב- aliquots של ברקוד נוגדנים. לאחר השלמת הספין דאון בשלב 3.2.4, הוסף את תג הנוגדן המושעה מחדש (כ- 220 μL) לכל עמודת מסנן מתאימה. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה בעדינות כדי לערבב את ריאגנטים. סגור את מכסי עמודות המסנן ודגר על תגובת הצמידות ב- RT למשך שעתיים. לאחר שעתיים, סובב את עמודות המסנן כלפי מטה במהירות של 12,000 x גרם למשך 8 דקות.הערה: מומלץ להפריש 5 μL של התמיסה המצומדת בצינור תגובת שרשרת פולימראז ואחסונו, בטמפרטורה של 4°C, לפרוטוקול האישור (ראה להלן). פיפטה 450 μL של תמיסת הטיהור לתוך כל עמודת מסנן, ולהסתובב למטה ב 12,000 x גרם במשך 8 דקות. חזור על הפעולה שלוש פעמים. פיפטה 100 μL של פתרון האחסון לתוך עמודות המסנן. בעדינות פיפטה את התערובת למעלה ולמטה יותר מ 10 פעמים, בזהירות לשטוף את הצדדים של מסננים בעמודה.הערה: יש להמיס 50 מיקרוגרם נוגדנים ב-100 מיקרוליטר של תמיסת האחסון. אם תגובת הצמידות מתחילה עם יותר מ -50 מיקרוגרם של נוגדן, הוסף תמיסת אחסון נוספת ביחס זה. הפוך את עמודות המסנן בצינור איסוף חדש. סובב כלפי מטה ב- 3,000 x גרם למשך 2 דקות ב- RT. שמור את התמיסה שנאספת. פיפטה תמיסת נוגדנים מצומדת לתוך צינורות בורג סטריליים, ולאחסן עד 1 שנה ב 4 ° C.הערה: נוגדן מצומד צריך להיבדק עם טכנולוגיית הדמיה מרובת לאחר יומיים. בדיקות לפני כן עלולות לגרום להכתמה גרעינית ברקע גבוה. 4. אישור צימוד הערה: לפני ביצוע ניסויי צביעה עם נוגדן מצומד המשתמש באמצעות טכנולוגיית הדמיה מרובה, יש לאשר את הצמידות באמצעות אלקטרופורזה בג’ל עם 5 מיקרוליטר של הנוגדן המצומד (ראה שלב 3.2.6) יחד עם 1 מיקרוגרם של נוגדן לא מצומד (בדרך כלל ב -2 מיקרוליטר של התערובת) כבקרה. צימוד נוגדנים מוצלח יודגם על ידי עלייה במשקל המולקולרי של הנוגדן. עם זאת, פרוטוקול אישור זה רק מעריך את הצלחת התגובה הכימית לצמידות ואינו מתייחס לאימות הנוגדנים המשמש להדמיה מרובה. פיפטה 8 μL ו 11 μL של מים ללא nuclease לתוך נוגדן מצומד שמור לשלוט נוגדן unconjugated, בהתאמה, כדי לקבל נפח סופי של 13 μL. פיפטה 5 μL של LDS (או מערכת אלקטרופורזה אחרת של נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג’ל) חיץ דגימה ו 2 μL של חומר מקטין דגימה לתוך כל דגימה של נוגדן מצומד שמור, ו denature את הדגימות באמבטיה יבשה 95 ° C במשך 10 דקות. בזמן שהדגימות עוברות דנטורציה, יש לדלל 40 מ”ל של חיץ ריצה MOPS SDS ב-760 מ”ל מים טהורים במיוחד, להניח ג’ל במיכל של מערכת אלקטרופורזה ולשפוך את חיץ הריצה המדולל על הג’ל. לאחר השלמת תקופת הדה-נטוריזציה בת 10 הדקות, טען באר אחת של הג’ל בתקן חלבון מוכתם מראש, באר אחת עם נוגדן לא מצומד (משלב 3.2.2), ואת הבארות הנותרות עם דגימות נוגדנים מצומדות. לאחר מכן, הפעל את הג’ל ב 150 V עד תקן החלבון מופיע בסוף הג’ל.הערה: הג’ל נצמד בקלות למיכלים בטוחים לשימוש במיקרוגל, ולכן עלול להיקרע, ולכן יש לטפל בג’ל בזהירות בשלבים הבאים. לאחר סיום הריצה, העבירו את הג’ל למיכל בטוח למיקרוגל שמולא מראש במים טהורים במיוחד, וחממו אותו במיקרוגל עד להדמיה של הבועה הראשונה במים.הערה: זמן היווצרות הבועות משתנה מאוד בהתאם למיקרוגל שבו משתמשים. מסננים את המים מהמיכל, יוצקים כ 250 מ”ל של כתם Coomassie G-250 על הג’ל, ומחממים את הג’ל במיקרוגל עד הבועה הראשונה הוא דמיין. לאחר מכן, הוציאו את המיכל עם הג’ל וכתם Coomassie G-250 מהמיקרוגל, והניחו אותו על שייקר למשך 10 דקות. לאחר ניעור, בזהירות לנקז את הכתם, להחליף אותו עם כ 200 מ”ל של מים טהורים במיוחד, ולאחר מכן להניח את המיכל על שייקר לשטוף את הג’ל. מסננים את המים האולטרה-טהורים, ומחליפים אותם במים אולטרה-טהורים חדשים חמש פעמים או עד ששאריות הכתם אינן ניכרות באמבט המים. השאירו את הג’ל לשטיפה למשך הלילה על השייקר עד שהרצועות גלויות, במידת הצורך, לפני צילום הג’ל (איור 1).הערה: הנוגדנים המשמשים בהדמיה מרובבת צריכים להיות בעלי דפוסי צביעה דומים לאלה של נוגדנים מצומדים. חלקי רקמות עם אנטיגנים ידועים חיוביים לנוגדנים מצומדים יכולים להיות מוכתמים בנוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים ונוגדנים מצומדים. בעבודה זו, בכל מקרה, מורפולוגיות הרקמה של שני סוגי הנוגדנים היו שקולות והרמוניות זו עם זו, כמו גם התפלגות התאים הצפויה, בהתבסס על הביולוגיה של החלבונים המעניינים ודגימות רקמת הבדיקה. תוצאה זו מדגימה את היעילות של שימוש בנוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטידים עבור גישות מבוססות צביעת רקמות באמצעות רקמת FFPE. 5. צביעת נוגדנים מצומדים אוליגונוקלאוטיד הכינו כיסויים למיקום רקמות.השרו את החלקות בתמיסת פולי-L-ליזין 0.1% למשך 24 שעות ב-RT כדי לשפר את היצמדות הרקמות. לאחר ההשריה, מסננים את תמיסת הפולי-L-ליזין ושוטפים את הכיסויים במים טהורים במיוחד למשך 30 שניות. חזרו על הכביסה ארבע עד שש פעמים. הסירו את הכיסויים מהמים האולטרה-טהורים המשמשים לכביסה, והניחו אותם על מגבת ללא סיבים לייבוש למשך הלילה.הערה: על היסטולוג לחתוך את הרקמה שנבחרה למקטעים בעובי 5 מיקרומטר, להניח אותם במרכז מכסה טעון פולי-L-ליזין, ולאפשר להם להתייבש למשך הלילה. לאחר הייבוש, יש לאחסן את הכיסויים עם חלקי הרקמה ב -4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ -6 חודשים. לוח הצביעה בפרוטוקול זה הכיל 26 סמנים. הרקמה ששימשה בפרוטוקול זה הייתה רקמת שקדים אנושית רגילה. זמן ההשריה בתלוש הכיסוי לא יעלה על שבוע. ניתן לאחסן כיסויים מצופים פולי-L-ליזין ב-RT ויש להשתמש בהם תוך חודשיים מההכנה. יום לפני הכתמה, יש להכניס את מחזיק הכיסוי לתנור בטמפרטורה של 60°C למשך הלילה. למחרת, הניחו את דוגמת הכיסוי במחזיק כיסוי שחומם מראש בתנור בטמפרטורה של 60°C. לאחר אפייה של 30 דקות, בודקים שהפרפין נמס מהרקמה. מקם במהירות את מחזיק הכיסוי/הדגימה בסדרת הפתרונות הבאה: שני סבבים של חומר להסרת שעווה למשך 6 דקות כל אחד; שני סבבים של 100% אתנול במשך 5 דקות כל אחד; סיבוב אחד של 90% אתנול במשך 5 דקות; סיבוב אחד של אתנול 70% במשך 5 דקות; סיבוב אחד של אתנול 50% במשך 5 דקות; סיבוב אחד של 30% אתנול במשך 5 דקות; ושני סבבים של מים אולטרה-טהורים שטופלו בדיאתיל פירוקרבונט (DEPC) במשך 5 דקות כל אחד.הערה: כל הדילולים של אתנול מוכנים עם מים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC. אם קסילן משמש להסרת שעווה, יש להשתמש בו במכסה מנוע. בעת חשיפת מחזיק הכיסוי/הדגימה לסדרת התמיסות, בצע את הפעולות הבאות:הכינו תא לחות על ידי הנחת קופסת טיפים פיפטה ריקה עם מגבת נייר ספוגה במים בתחתית. מלאו סיר לחץ בכמות מספקת של מים כדי לכסות בחצי הדרך של 50 מ”ל. מניחים 5 מ”ל מתנול לדגימה בכד ב 4 ° C. יש לדלל את חיץ AR9 במים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC עד פי 1; יש צורך בכ-50 מ”ל של החיץ המדולל לכל מחזיק כיסוי. לאחר השלמת סדרת התמיסות, מלאו זכוכית בנפח 50 מ”ל בכ-40 מ”ל של חיץ AR9 אחד, השקיעו את מחזיק הכיסוי/הדגימה בכד וכסו לחלוטין את מחזיק הכיסוי/הכיסוי ברדיד אלומיניום.הניחו את המשקוף/מחזיק הכיסוי המכוסה ברדיד אלומיניום בסיר הלחץ המלא במים, ובשלו בלחץ גבוה (כ-15 psi) במשך 20 דקות. לאחר הבישול, הסירו את מחזיק הכד/כיסוי, הסירו בזהירות את נייר הכסף מאלומיניום והניחו למחזיק הכוסית/מכסה להתקרר ב-RT למשך כ-10 דקות. הסר את מחזיק הכיסוי/הדגימה ממאגר AR9 1x, והשקע אותו בשני סבבים של מים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC, תוך ביצוע דגירה של הדגימות בשני הסבבים במשך 2 דקות כל אחד. במהלך הדגירה, יש לאחזר את מאגר ההידרציה, את ה-N החוסמ, לחסום את G, לחסום J ולחסום את תמיסות S, ואת דילול/חסימת הנוגדנים מערכת צביעת ההדמיה המרובבת. עבור שתי דוגמאות כיסוי, תייגו לוחות בעלי 6 בארות עבור הפתרונות באמצעות התצורות המוצגות באיור 2. הניחו את דגימת הכיסוי בשני סבבים של 5 מ”ל של חיץ ההידרציה למשך 2 דקות כל אחד. לאחר שני סבבי ההשמה במאגר ההידרציה, הניחו את דגימת הכיסוי ב-5 מ”ל של דילול/בלוק נוגדני ההדמיה המרובבים, ודגרו במשך 20-30 דקות ב-RT (אין לחרוג מ-30 דקות). במהלך הדגירה, הכינו קוקטייל נוגדנים על ידי הכנת תערובת מאסטר של 200 μL של מדלל/בלוק נוגדני הדמיה מרובה, חוסם N, חוסם G, חוסם J ותמיסות חוסם S.הערה: חשב את כמות הנוגדנים הכוללת בהתבסס על מספר הסמנים והטיטרציה המאומתת של כל סמן, והפחת את כמות הנוגדנים הכוללת מתערובת האב. לדוגמה, עבור שישה סמנים, כל אחד עם טיטרציה של 1:200, המשוואה תהיה 200 μL של תערובת מאסטר – 6 μL של קוקטייל נוגדנים = 194 μL של תערובת מאסטר. לאחר הדגירה בדילול/בלוק נוגדני ההדמיה המרובבים, הניחו את דגימת הכיסוי בתא הלחות שהוכנה בשלב 5.5.1, פיפטה 190 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים על דגימת הכיסוי, ודגרו על דגימת הכיסוי ב-RT למשך 3 שעות.לאחר הדגירה, שטפו את דגימת הכיסוי בשני סבבים עם 5 מ”ל של נוגדן הדמיה מרובה/בלוק למשך 2 דקות כל אחד. כדי לתקן את הנוגדנים הקשורים לרקמה על הכיסוי, בצע שלבים 5.7.3-5.7.5 בתא הלחות. יש לדגור על החלקות במשך 10 דקות עם 16% פורמלדהיד מדולל ל-1.6% בתמיסת אחסון, ולאחר מכן לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים עם PBS אחד. לדגור את הכיסויים במשך 5 דקות עם מתנול 4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים עם 1x PBS. לדגור על הכיסויים במשך 20 דקות עם 5 מ”ל של מגיב קיבוע מדולל עם 1x PBS, ולאחר מכן לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים עם 1x PBS. אחסנו את דגימות הכיסוי המוכתם במאגר האחסון בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים 6. לוחית כתב הדמיה מרובבת הערה: צלחת בת 96 בארות, המכונה לוחית כתב, המכילה פלואורופורים ברקודים בבארות בודדות מוכנה על פי ניסויי הדמיה מרובי תרבבים שתוכננו במיוחד ומתואמת עם כל דגימת כיסוי מוכתמת. השלבים הבאים הם להכנת צלחת הכתב. הכינו תערובת מאסטר לכתב על ידי שילוב של 4,880 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז, 600 מיקרוליטר של חיץ הדמיה מרובב פי 10, 500 מיקרוליטר של מגיב בדיקה ו-20 מיקרוליטר של תמיסת כתמים גרעיניים. זה יספיק ל -20 מחזורים של כל הבארות. בכל מחזור של ניסוי הדמיה מרובת ריבובים שתוכנן בהתאמה אישית, מלא באר עם 245 μL של תמיסה המכילה את תערובת המאסטר של הכתב ואת הפלואורופורים המקודדים הספציפיים עבור מחזור זה.הערה: ראה איור 3 עבור תצורת לוחית הכתב המשמשת בפרוטוקול זה עבור לוח קרצינומה. כדי להגן על הפלואורופורים המקודדים, הדביקו כיסוי צלחת רדיד אלומיניום מעל לוחית הכתב, והניחו את הצלחת בתוך מכשיר ההדמיה המרובב. אחסנו את צלחת הכתב בקופסה חשוכה בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים. 7. כיול והפעלה של מכונת ההדמיה המרובבת הערה: מיקרוסקופ ההדמיה הפלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה לוכד ארבע תעלות פלואורסצנטיות שונות בכל מחזור הדמיה מרובב במהירות של 20x, 100% עירור אור, ועם הלבנה נמוכה. כיול מוקד ההדמיה באמצעות ערוץ DAPI על ידי הנחת כיסוי דגימה על במת המיקרוסקופ, תוך הזרמה ידנית של 700 μL של טיטרציה של 1:1,500 של תמיסת כתמים גרעיניים על הרקמה.הערה: הכיסוי נשמר בשלב המיקרוסקופ במהלך שטיפת הדגימה והדמיה. כדי להכין את מכשיר ההדמיה המרובב, יש לדלל את מאגר הדימות המרובב 10x ל-1x באמצעות מים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC, ולמלא בקבוקי ריאגנטים בתמיסות/ממסים מתאימים, כולל מאגר הדמיה מדולל 1x מרובב, מים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC ודימתיל סולפוקסיד (DMSO). לאחר מילוי בקבוקי המגיב כראוי, הזן את התכנון הניסיוני בתוכנת מנהל מכשירי ההדמיה המרובבים; לציין את המחזור הנכון, מספרי בארות, מקומות מחסנית z, שם סמן, מחלקה וזמן חשיפה עבור כל מחזור (איור 4); הגדר את כל הפרמטרים של המיקרוסקופ; ובחר את אזורי העניין בתלוש הכיסוי לדוגמה שברצונך לצלם.לחצו על כפתור הניסוי בתוכנת הבקרה (איור 4A). בחלון Experiment Setup and Management , לחצו על הלחצן New Template (איור 4B). הקלד את שם הפרויקט בשטח שליד לחצן פרוייקט (איור 4C). הקלד או בחר את מספר המחזורים הכולל (איור 4D). לחצו על כפתור הקצאת הערוץ , הקלידו את המידע עבור כל מחזור בעמודות (איור 4E) ולחצו על הלחצן ‘ שמור תבנית’ . התחל את הניסוי על ידי לחיצה על כפתור התחל ניסוי .הערה: במהלך ניסוי הדמיה מרובה, המכשיר שולף את הפלואורופורים המקודדים מבאר אחת של לוחית הכתב (מקסימום ארבעה פלואורופורים לכל באר, כולל DAPI), מפזר אותם ישירות על מכסה הדגימה, ומצלם את אזורי העניין עבור כל ערוץ פלואורסצנטי. לאחר כל ההדמיה של אותו מחזור, המכשיר שוטף את הפלואורופורים המקודדים ומחלק את המחזור הבא של הכתבים (מהבאר הבאה על צלחת הכתב). ההדמיה נמשכת עד להשלמת כל המחזורים באמצעות 26 סמנים. 8. אוסף תמונות הערה: ניתן לאסוף תמונות מרובבות באמצעות כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך מותאם המוגדר עם ארבע תעלות פלואורסצנטיות (DAPI, Cy3, Cy5 ו- Cy7) ומצויד בעדשת Plan Fluor 20x. הדמיה ושטיפה של דגימות הכיסוי מבוצעות באופן איטרטיבי באופן אוטומטי באמצעות מערך פלואידיקה שפותח במיוחד. התמונות נרכשות באמצעות תוכנת מעבד (v1.8.0.7) בפורמט QPTIFF. בחלון המעבד, לחץ על כפתור הקלט ובחר את שם הניסוי. במקטע אפשרויות עיבוד , בחר וסמן את חיסור רקע, ביטול פיתול, עומק שדה מורחב ותיקון הצללה. לחץ על לחצן התחל . 9. ניתוח תמונות הערה: ניתן להעלות את התמונות שנרכשו לתוכנת ניתוח תמונות אוטומטית המוגנת בפטנט או לתוכנת קוד פתוח (איור 5) לצורך ניתוח במורד הזרם. לחץ על סמל QuPath במחשב ופתח את התוכנה. גרור את קובץ ה- QPTIFF לחלון מציג . לחץ על כפתור בהירות וניגודיות, שיפתח את החלון בהירות וניגודיות. סמן או בטל את הסימון של הסמן בעמודה נבחר כדי להציג או לסגור את אות הסמן. לחץ על כפתור Zoom to fit כדי להגדיל או להקטין את אזור העניין.הערה: תצוגה חזותית של נתוני תמונה מרובבים מספקת למשתמש מבט מעמיק לתוך המיקרו-סביבה של הרקמות. ניתן להמחיש סמנים בודדים בדגימות FFPE בתבנית פלואורסצנטית (איור 6 ואיור 7) או בתצוגת פתולוגיה. ניתן להשתמש במספר פלטפורמות חישוביות כדי לעבד את התמונות המרוכבות ולנתח את נתוני התמונה של הרקמה המרובבת. באמצעות תוכנה זו, ניתן לבצע פנוטיפ מרחבי, כמו גם גילוי תאים נדירים וחישוב שכונתי תאים, עם תמונות שקופיות שלמות של רקמה מרובבת גבוהה במיוחד הנוצרת באמצעות טכנולוגיית הדמיה מרובבת. ראו איור 6 עבור 26 הנוגדנים בלוח הקרצינומה ובדגימת השקדים (איור משלים 1).