Analyse d’images de codes à barres multiplexés pour l’immunoprofilage et la caractérisation de la cartographie spatiale dans l’analyse unicellulaire d’échantillons de tissus de paraffine

Cette étude rétrospective a été approuvée par le comité d’examen institutionnel du MD Anderson Cancer Center de l’Université du Texas. Les échantillons de tissus FFPE ont été prélevés chez des patients de MD Anderson dans le cadre des soins standard de routine. Aucune intervention diagnostique ou thérapeutique n’a été effectuée. Le consentement éclairé des patients a été obtenu pour l’utilisation des échantillons prélevés à des fins de recherche et de publication. 1. Sources d’anticorps utilisées pour la conception du panel d’anticorps Créez un panel d’anticorps pour l’imagerie multiplexée après avoir soigneusement examiné la qualité des tissus et des protéines d’intérêt. Trois sources d’anticorps sont prises en compte pour la conception du panel d’anticorps : 1) les anticorps entièrement validés commercialement, 2) les anticorps multiplexés criblés par la technologie d’imagerie et 3) les anticorps partagés par l’utilisateur final.REMARQUE : Les anticorps dépistés par la technologie d’imagerie multiplexée ont fait leurs preuves et sont disponibles auprès des fournisseurs. Ces anticorps criblés peuvent être appliqués à la coloration d’images multiplexées après conjugaison d’oligonucléotides par l’utilisateur. Si une protéine d’intérêt ne peut pas être trouvée dans les sources mentionnées ci-dessus, utilisez les clones d’anticorps connus pour fonctionner avec IHC. De plus, les isotypes IgG plutôt que les clones IgM sont recommandés pour cette technologie d’imagerie multiplexée en raison du taux d’échec plus élevé avec les clones IgM qu’avec les clones IgG. 2. Avant la conjugaison des anticorps Lors de l’identification de clones d’anticorps pour la conjugaison à l’aide de codes-barres d’imagerie multiplexés, envisagez d’acheter des anticorps sans support dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou un tampon similaire. Les protéines porteuses, y compris le BSA, le gluten, le glycérol et d’autres additifs protéiques, sont connues pour réduire la capacité de conjugaison. Sélectionnez le clone d’anticorps le plus approprié et optimisez toujours les conditions de coloration (c.-à-d. récupération et titrage de l’antigène) avant la conjugaison. Pour ce faire, appliquez un clone d’anticorps non conjugué sur les tissus positifs et négatifs pour cet anticorps en utilisant l’IF ou l’IHC standard.REMARQUE: Si un anticorps purifié n’est pas disponible dans le commerce, un processus de purification des anticorps doit être effectué avant la conjugaison. La procédure de purification utilisée avec les kits de purification d’anticorps n’est pas abordée ici. 3. Conjugaison des anticorps Obtenir les réactifs de conjugaison des anticorps. Les trousses de conjugaison disponibles dans le commerce contiennent une solution de blocage du filtre, une solution de réduction 2, une solution de conjugaison, une solution de purification, une solution de stockage d’anticorps (toutes stockées à 4 °C) et une solution de réduction 1 (stockées à −20 °C). ConjugaisonREMARQUE: Un anticorps purifié est traité avec un agent réducteur, ce qui permet aux fractions réduites de l’anticorps de réagir avec le code-barres d’imagerie multiplexé utilisé avec cette technologie et, ainsi, de former une liaison covalente. Ce processus prend environ 4,5 heures et donne environ 120 μL d’anticorps conjugués, ce qui est viable pendant 1 an. Tout le spin-down est effectué à température ambiante (RT) et l’écoulement continu est éliminé, sauf à la toute dernière étape (3.2.9), dans laquelle un tube de collecte contient l’anticorps conjugué.Aspirer et appliquer 500 μL de la solution de blocage du filtre à l’aide d’une pipette sur les colonnes filtrantes de coupure de poids moléculaire de 50 kDa, puis tourner vers le bas à 12 000 x g pendant 2 minutes pour bloquer la liaison d’anticorps non spécifiques.REMARQUE: Si une solution résiduelle en haut de la colonne est visible, inverser le filtre dans le tube de collecte et tourner vers le bas à 3 000 x g pendant 2 min. Introduire à la pipette 50 μg de l’anticorps dans un volume de solution de 100 μL sur la colonne filtrante et faire tourner vers le bas à 12 000 x g pendant 8 min.NOTE: Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la concentration de l’anticorps purifié et pour calculer le volume de solution correspondant à 50 μg de l’anticorps. Si le volume de la solution d’anticorps est inférieur à 100 μL, ajuster le volume à 100 μL en ajoutant 1x PBS. Conserver 1 μg d’anticorps non conjugué pour la confirmation de la conjugaison (étape 4.4). Pipeter 260 μL de mélange maître de réduction (20 μL de solution de réduction 1 mélangée à 825 μL de solution de réduction 2, ce qui est suffisant pour trois réactions de conjugaison d’anticorps) à chaque colonne filtrante. Tourbillonner doucement le mélange principal pendant 2-3 s, ou pipeter de haut en bas pour mélanger la solution avec l’anticorps. Incuber à TA pendant 30 min. Après l’incubation, faire tourner les colonnes filtrantes à 12 000 x g pendant 8 min. Ajouter 450 μL de solution de conjugaison aux colonnes filtrantes et faire tourner vers le bas à 12 000 x g pendant 8 min. Remettez en suspension le code-barres souhaité dans 10 μL d’eau sans nucléase et 210 μL de solution de conjugaison.REMARQUE : Préparez une étiquette d’anticorps immédiatement avant l’utilisation pour la coloration. Ne réutilisez pas les aliquotes de code-barres d’anticorps. Une fois l’essorage terminé à l’étape 3.2.4, ajouter l’étiquette d’anticorps remis en suspension (environ 220 μL) dans chaque colonne de filtre correspondante. Pipeter doucement le mélange de haut en bas pour mélanger les réactifs. Fermer les couvercles de la colonne filtrante et incuber la réaction de conjugaison à TA pendant 2 h. Après 2 h, faites tourner les colonnes filtrantes à 12 000 x g pendant 8 min.NOTE: Il est recommandé de mettre de côté 5 μL de la solution conjuguée dans un tube de réaction en chaîne par polymérase et de la stocker à 4 °C pour le protocole de confirmation (voir ci-dessous). Pipeter 450 μL de la solution de purification dans chaque colonne filtrante et faire tourner vers le bas à 12 000 x g pendant 8 min. Répétez trois fois. Pipeter 100 μL de la solution de stockage dans les colonnes filtrantes. Pipeter doucement le mélange de haut en bas plus de 10 fois et laver soigneusement les côtés des filtres dans la colonne.REMARQUE : Dissoudre 50 μg d’anticorps dans 100 μL de la solution de stockage. Si la réaction de conjugaison est commencée avec plus de 50 μg d’anticorps, ajouter plus de solution de stockage à ce rapport. Inversez les colonnes filtrantes dans un nouveau tube de collecte. Faire tourner vers le bas à 3 000 x g pendant 2 min à TA. Conserver la solution recueillie. Introduire à la pipette la solution d’anticorps conjugués dans des tubes à vis stériles et conserver jusqu’à 1 an à 4 °C.REMARQUE: Un anticorps conjugué doit être testé avec la technologie d’imagerie multiplexée après 2 jours. Les essais préalables peuvent entraîner une coloration nucléaire de fond élevée. 4. Confirmation de la conjugaison REMARQUE : Avant d’effectuer des expériences de coloration avec un anticorps conjugué par l’utilisateur à l’aide de la technologie d’imagerie multiplexée, la conjugaison doit être confirmée en utilisant l’électrophorèse sur gel avec 5 μL de l’anticorps conjugué (voir étape 3.2.6) avec 1 μg d’anticorps non conjugué (habituellement dans 2 μL du mélange) comme témoin. Une conjugaison réussie de l’anticorps sera démontrée par une augmentation du poids moléculaire de l’anticorps. Cependant, ce protocole de confirmation évalue uniquement le succès de la réaction chimique pour la conjugaison et ne traite pas de la validation des anticorps utilisée pour l’imagerie multiplexée. Pipeter 8 μL et 11 μL d’eau exempte de nucléase dans l’anticorps conjugué réservé et contrôler l’anticorps non conjugué, respectivement, pour obtenir un volume final de 13 μL. Introduire à la pipette 5 μL de LDS (ou un autre système d’électrophorèse sur gel dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium) et 2 μL d’agent réducteur d’échantillon dans chaque échantillon de l’anticorps conjugué réservé, et dénaturer les échantillons dans un bain sec à 95 °C pendant 10 min. Pendant la dénaturation des échantillons, diluer 40 mL de tampon MOPS SDS dans 760 mL d’eau ultrapure, placer un gel dans le réservoir d’un système d’électrophorèse et verser le tampon courant dilué sur le gel. Une fois la période de dénaturation de 10 minutes terminée, charger un puits du gel avec un étalon protéique pré-coloré, un avec l’anticorps non conjugué (à partir de l’étape 3.2.2) et les puits restants avec les échantillons d’anticorps conjugués. Ensuite, exécutez le gel à 150 V jusqu’à ce que l’étalon protéique apparaisse à la fin du gel.REMARQUE: Le gel adhère facilement aux récipients allant au micro-ondes et, par conséquent, peut se déchirer, de sorte que le gel doit être manipulé avec prudence dans les étapes suivantes. Une fois l’exécution terminée, transférez le gel dans un récipient allant au micro-ondes prérempli d’eau ultrapure et chauffez-le au micro-ondes jusqu’à ce que la première bulle dans l’eau soit visualisée.REMARQUE: Le temps de formation des bulles varie considérablement en fonction du micro-ondes utilisé. Vidangez l’eau du contenant, versez environ 250 ml de colorant Coomassie G-250 sur le gel et chauffez le gel au micro-ondes jusqu’à ce que la première bulle soit visualisée. Ensuite, retirez le récipient avec le gel et la coloration Coomassie G-250 du micro-ondes et placez-le sur un shaker pendant 10 min. Après avoir agité, égoutter soigneusement la tache, la remplacer par environ 200 ml d’eau ultrapure, puis placer le récipient sur le shaker pour laver le gel. Vidangez l’eau ultrapure et remplacez-la par de l’eau ultrapure neuve cinq fois ou jusqu’à ce que les restes de la tache ne soient pas apparents dans le bain-marie. Laissez le gel laver toute la nuit sur le shaker jusqu’à ce que des bandes soient visibles, si nécessaire, avant de photographier le gel (Figure 1).REMARQUE : Les anticorps utilisés en imagerie multiplexée doivent présenter des profils de coloration comparables à ceux des anticorps conjugués à un colorant. Les coupes de tissus avec des antigènes connus positifs pour les anticorps conjugués peuvent être colorées avec des anticorps conjugués à des oligonucléotides et des anticorps conjugués à un colorant. Dans ce travail, dans chaque cas, les morphologies tissulaires des deux types d’anticorps étaient équivalentes et harmonisées l’une avec l’autre, ainsi que la distribution cellulaire anticipée, basée sur la biologie des protéines d’intérêt et des échantillons de tissus testés. Ce résultat démontre l’efficacité de l’utilisation de groupements d’anticorps conjugués aux oligonucléotides pour les approches basées sur la coloration tissulaire utilisant du tissu FFPE. 5. Coloration par anticorps conjugués aux oligonucléotides Préparez les lames de couverture pour le placement des tissus.Faire tremper les lames de couverture dans une solution de poly-L-lysine à 0,1% pendant 24 h à TA pour améliorer l’adhérence des tissus. Après trempage, égoutter la solution de poly-L-lysine et laver les lamelles de couverture à l’eau ultrapure pendant 30 s. Répétez le lavage quatre à six fois. Retirez les lamelles de couverture de l’eau ultrapure utilisée pour le lavage et placez-les sur une serviette non pelucheuse pour sécher pendant la nuit.REMARQUE: Un histologiste doit couper le tissu sélectionné en sections de 5 μm d’épaisseur, les placer au centre d’une lame de couverture chargée en poly-L-lysine et les laisser sécher pendant la nuit. Après séchage, les lamelles de couverture avec les sections de tissu doivent être conservées à 4 °C pendant 6 mois au maximum. Le panneau de coloration de ce protocole contenait 26 marqueurs. Le tissu utilisé dans ce protocole était du tissu amygdale humain normal. Le temps de trempage de la housse ne doit pas dépasser 1 semaine. Les lamelles de couverture revêtues de poly-L-lysine peuvent être stockées chez RT et doivent être utilisées dans les 2 mois suivant leur préparation. La veille de la coloration, placez le porte-couvercle dans un four à 60 °C pendant la nuit. Le lendemain, placez l’échantillon de bordereau dans un porte-lame-couvercle préchauffé dans un four à 60 °C. Après la cuisson pendant 30 minutes, vérifiez que la paraffine a fondu loin du tissu. Placer rapidement le porte-lame/échantillon dans la série de solutions suivante : deux cycles d’agent déparaffinant pendant 6 min chacun; deux cycles d’éthanol à 100 % pendant 5 min chacun; un tour d’éthanol à 90% pendant 5 min; un tour d’éthanol à 70% pendant 5 min; un tour d’éthanol à 50% pendant 5 min; un tour d’éthanol à 30% pendant 5 min; et deux cycles d’eau ultrapure traitée au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) pendant 5 minutes chacun.NOTE: Toutes les dilutions d’éthanol sont préparées avec de l’eau ultrapure traitée au DEPC. Si le xylène est utilisé pour le déparaffinage, il doit être utilisé dans une hotte. Lorsque vous soumettez le porte-feuillet/échantillon à la série de solutions, procédez comme suit :Préparez une chambre d’humidité en plaçant une boîte vide d’embout de pipette avec une serviette en papier imbibée d’eau au fond. Remplissez un autocuiseur avec suffisamment d’eau pour couvrir à moitié un bécher de 50 mL. Placer 5 mL de méthanol par échantillon dans le bécher à 4 °C. Diluer le tampon AR9 avec de l’eau ultrapure traitée DEPC à 1x; environ 50 mL du tampon dilué sont nécessaires par porte-lame. Une fois la série de solutions terminée, remplissez un bécher en verre de 50 ml avec environ 40 ml de 1x tampon AR9, immergez le porte-couvercle/échantillon dans le bécher et recouvrez complètement le porte-lame/couvercle avec du papier d’aluminium.Placer le porte-bécher/couvercle recouvert de papier d’aluminium dans l’autocuiseur rempli d’eau et cuire à haute pression (environ 15 psi) pendant 20 min. Après la cuisson, retirez le porte-bécher/couvercle, déballez soigneusement le papier d’aluminium et laissez le porte-bécher/couvercle refroidir à TA pendant environ 10 minutes. Retirez le porte-lame/échantillon du tampon AR9 1x et immergez-le dans deux cycles d’eau ultrapure traitée par DEPC, en effectuant une incubation des échantillons dans les deux tours pendant 2 minutes chacun. Pendant l’incubation, récupérez le tampon d’hydratation, le bloc N, le blocage G, le blocage J et le blocage des solutions S, ainsi que le diluant/bloc d’anticorps du kit de coloration d’imagerie multiplexé. Pour deux échantillons de lamelles de couverture, étiqueter les plaques à 6 puits pour les solutions en utilisant les configurations illustrées à la figure 2. Placer l’échantillon de la lamelle de couverture en deux cycles de 5 mL du tampon d’hydratation pendant 2 minutes chacun. Après les deux cycles de placement dans le tampon d’hydratation, placer l’échantillon de capuchon dans 5 ml du diluant/bloc d’anticorps d’imagerie multiplexé et incuber pendant 20 à 30 minutes à TA (ne pas dépasser 30 min). Pendant l’incubation, préparez un cocktail d’anticorps en préparant un mélange maître de 200 μL de diluant/bloc d’anticorps d’imagerie multiplexé, de bloqueur N, de bloqueur G, de bloqueur J et de solutions de bloqueur S.REMARQUE : Calculez la quantité totale d’anticorps en fonction du nombre de marqueurs et du titrage validé de chaque marqueur, et soustrayez la quantité totale d’anticorps du mélange maître. Par exemple, pour six marqueurs, chacun avec un titrage de 1:200, l’équation serait 200 μL de mélange maître − 6 μL de cocktail d’anticorps = 194 μL de mélange maître. Après incubation dans le diluant/bloc d’anticorps d’imagerie multiplexé, placer l’échantillon de lamelle de couverture dans la chambre d’humidité préparée à l’étape 5.5.1, pipeter 190 μL du cocktail d’anticorps sur l’échantillon de lamelle de couverture et incuber l’échantillon de lamelle de couverture à TA pendant 3 h.Après l’incubation, laver l’échantillon de couvercle en deux cycles avec 5 mL du diluant/bloc d’anticorps imageur multiplexé pendant 2 minutes chacun. Pour fixer les anticorps liés au tissu sur la lame, effectuez les étapes 5.7.3-5.7.5 dans la chambre d’humidité. Incuber les lames de couverture pendant 10 min avec 16% de formaldéhyde dilué à 1,6% avec une solution de stockage, puis laver les lamelles trois fois avec 1x PBS. Incuber les lames de couverture pendant 5 min avec du méthanol à 4 °C, puis laver les lamelles trois fois avec 1x PBS. Incuber les lames de couverture pendant 20 min avec 5 mL du réactif fixateur dilué avec 1x PBS, puis laver les lamelles trois fois avec 1x PBS. Conservez les échantillons de lamelles tachées dans le tampon de stockage à 4 °C pendant 2 semaines maximum 6. Plaque rapporteur d’imagerie multiplexée REMARQUE : Une plaque de 96 puits, appelée plaque rapporteure, contenant des fluorophores à code à barres dans des puits individuels est préparée selon des expériences d’imagerie multiplexées conçues sur mesure et est corrélée avec chaque échantillon de feuillet de couverture coloré. Les étapes suivantes concernent la préparation de la plaque rapporteure. Préparer un mélange-maître rapporteur en combinant 4 880 μL d’eau exempte de nucléases, 600 μL de tampon d’imagerie multiplexé 10x, 500 μL d’un réactif de dosage et 20 μL de solution de coloration nucléaire. Ce sera suffisant pour 20 cycles de tous les puits. À chaque cycle de l’expérience d’imagerie multiplexée conçue sur mesure, remplissez un puits avec 245 μL d’une solution contenant le mélange principal rapporteur et les fluorophores à code-barres spécifiques pour ce cycle.REMARQUE : Voir la figure 3 pour la configuration de la plaque de rapport utilisée dans ce protocole pour un panneau de carcinome. Pour protéger les fluorophores à code-barres, collez un couvercle de plaque en aluminium sur la plaque rapporteur et placez la plaque dans l’instrument d’imagerie multiplexé. Conservez la plaque rapporteur dans une boîte sombre à 4 °C pendant 2 semaines maximum. 7. Étalonnage et fonctionnement de l’appareil d’imagerie multiplexé REMARQUE: Le microscope à fluorescence d’imagerie haute résolution capture quatre canaux de fluorescence différents dans chaque cycle d’imagerie multiplexé à 20x, 100% de lumière d’excitation et avec un faible photoblanchiment. Calibrez la focalisation de l’imagerie à l’aide du canal DAPI en plaçant une lame de couverture d’échantillon sur la platine du microscope, en pipetant manuellement 700 μL d’un titrage 1:1 500 de solution de coloration nucléaire sur le tissu.REMARQUE: La lamelle de couverture est conservée sur l’étage du microscope pendant le lavage et l’imagerie de l’échantillon. Pour préparer l’instrument d’imagerie multiplexé, diluer 10x tampon d’imagerie multiplexé à 1x avec de l’eau ultrapure traitée DEPC et remplir les flacons de réactifs avec des solutions/solvants appropriés, y compris le tampon d’imagerie multiplexé 1x dilué, de l’eau ultrapure traitée par DEPC et du diméthylsulfoxyde (DMSO). Une fois les flacons de réactifs remplis correctement, entrez le plan expérimental dans le logiciel de gestion d’instruments d’imagerie multiplexé; désigner le cycle, les numéros de puits, les emplacements de la pile Z, le nom du marqueur, la classe et le temps d’exposition appropriés pour chaque cycle (figure 4); régler tous les paramètres du microscope; et sélectionnez les régions d’intérêt sur l’exemple de bordereau de couverture à imager.Cliquez sur le bouton Expérimenter dans le logiciel de contrôle (Figure 4A). Dans la fenêtre Configuration et gestion des expériences , cliquez sur le bouton Nouveau modèle (Figure 4B). Tapez le nom du projet dans l’espace situé à côté du bouton Projet (Figure 4C). Tapez ou sélectionnez le nombre total de cycles (Figure 4D). Cliquez sur le bouton Channel Assignment (Attribution de canal ), saisissez les informations pour chaque cycle dans les colonnes (Figure 4E), puis cliquez sur le bouton Save Template (Enregistrer le modèle ). Démarrez l’expérience en cliquant sur le bouton Démarrer l’expérience .REMARQUE: Au cours d’une expérience d’imagerie multiplexée, l’instrument récupère les fluorophores à code-barres d’un puits de la plaque rapporteur (maximum de quatre fluorophores par puits, y compris DAPI), les distribue directement sur la feuille de couverture de l’échantillon et imagera les régions d’intérêt pour chaque canal de fluorescence. Après toute l’imagerie de ce cycle, l’instrument lave les fluorophores à code-barres et distribue le prochain cycle de rapporteurs (à partir du puits suivant sur la plaque du rapporteur). L’imagerie se poursuit jusqu’à ce que tous les cycles utilisant 26 marqueurs soient terminés. 8. Collection d’images REMARQUE: Les images multiplexées peuvent être collectées à l’aide de n’importe quel microscope à fluorescence inversée adapté configuré avec quatre canaux de fluorescence (DAPI, Cy3, Cy5 et Cy7) et équipé d’une lentille Plan Fluor 20x. L’imagerie et le lavage des échantillons de feuillet de couverture sont effectués automatiquement de manière itérative à l’aide d’une configuration fluidique spécialement développée. Les images sont acquises à l’aide du logiciel Processor (v1.8.0.7) au format QPTIFF. Dans la fenêtre du processeur, cliquez sur le bouton Entrée et sélectionnez le nom de l’expérience. Dans la section Options de traitement, sélectionnez et cochez Soustraction d’arrière-plan, Déconvolution, Profondeur de champ étendue et Correction de l’ombrage. Cliquez sur le bouton Démarrer. 9. Analyse d’images REMARQUE : Les images acquises peuvent être téléchargées vers un logiciel breveté d’analyse d’images automatisée ou un logiciel open source (Figure 5) pour une analyse en aval. Cliquez sur l’icône QuPath sur l’ordinateur et ouvrez le logiciel. Faites glisser le fichier QPTIFF vers la fenêtre Viewer . Cliquez sur le bouton Luminosité et contraste, qui ouvrira la fenêtre Luminosité et contraste. Cochez ou décochez le marqueur dans la colonne Sélectionné pour afficher ou fermer le signal du marqueur. Cliquez sur le bouton Zoom pour ajuster pour effectuer un zoom avant ou arrière sur la zone d’intérêt.REMARQUE: La visualisation de données d’image multiplexées fournit à l’utilisateur un aperçu approfondi du microenvironnement tissulaire. Les marqueurs individuels dans les échantillons FFPE peuvent être visualisés en fluorescence (Figure 6 et Figure 7) ou en vue pathologique. Plusieurs plates-formes de calcul peuvent être utilisées pour traiter les images composites et analyser les données d’images tissulaires multiplexées. À l’aide de ce logiciel, le phénotypage spatial, ainsi que la découverte de cellules rares et le calcul du voisinage cellulaire, peuvent être réalisés avec des images entières de tissus multiplexés ultra-élevés générées via la technologie d’imagerie multiplexée. Voir la figure 6 pour les 26 anticorps dans le panel de carcinome et l’échantillon d’amygdale (Figure supplémentaire 1).