腸のリモデリングを研究するためのレーザーアブレーションと生体内顕微鏡

このプロトコルは、顕微鏡レーザーアブレーションと縦方向の生体内顕微鏡を組み合わせて、初期の損傷反応から長期的な組織リモデリングまでの腸の再生を追跡します。この技術は、顕微鏡レーザーアブレーションを誘発して画像化するための倫理的考慮事項を厳守して確立されており、正確に従うと動物の健康を維持します。手術中は、腸の完全性が十分に保存されていることを確認することが重要です。これは、組織の出血や乾燥を防ぐ滅菌湿綿棒で組織を穏やかに取り扱うことによって達成できます。レーザー誘発顕微鏡的損傷の程度も、レーザーアブレーション後の領域のさまざまな腸層を画像化することによって注意深く評価する必要があります。研究者がこのプロトコルに記載されている実験ステップの頻度を適応させたい場合は、実験の前に研究所の動物倫理委員会に相談して、福祉への影響を確立する必要があります。

反復生体内顕微鏡検査により、同じマウスの組織回復を経時的に監視することができます。腸の外科的曝露を繰り返すと、腸管全体への光学的アクセスが容易になります。血管系などの組織固有の特徴は、各イメージングセッションで同じ腸領域を識別するためのランドマークとして機能します。したがって、同じ組織領域を数週間にわたって画像化することができ、同じマウスの同じ腸領域における長期の組織再生を定量化することができる。手術とイメージングを組み合わせた方法によって提供される時空間制御は、同じマウスで同じ臓器を恒常性と再生の両方の条件下でイメージングできるという利点をもたらし、これは、コントロールと再生サンプルが異なるマウスに由来する以前の全臓器損傷モデルとは対照的です11,12,18,19,20.したがって、私たちの実験設定は、実験に必要な動物の数を最小限に抑え、動物内の変動を減らします。

プロトコルのトラブルシューティングは、マウスと腸の取り扱い技術のレビュー、および顕微鏡機器と設定の制御から始める必要があります。このプロトコルには、特別な注意を必要とする多くの重要なステップがあります。まず、動物の健康と継続的な高データ品質を確保するために、すべての作業は無菌技術を使用して清潔な無菌環境で実行する必要があり、手術中および各イメージングセッション中にマウスの温度を維持する必要があります。イメージング中に滅菌済みの予熱生理食塩水で組織を水和させることは不可欠であり、組織の線維化を防ぎます。

実験が再現性のある方法で実行されるようにするには、最適な取得のために使用前にレーザーを位置合わせし、各セッションの開始時に多光子レーザーの出力を測定することが重要です。対物レンズの種類、倍率、滞留時間、レーザー出力、波長などのパラメータは、顕微鏡レーザーアブレーションの程度に影響を与えるため、考慮する必要があります。この研究では、レーザーアブレーションとイメージングの両方を、Fluotar VISIR 25x / 0.95 WATER対物レンズを介して、960nmの波長で1.2Wのレーザー出力(レンズ外)で実施します。波長または光学スキャン特性を変更すると、微視的損傷の程度に影響します。より低い波長(840nmなど)は、より高いエネルギーの光子に変換され、多くの場合、レーザーの出力が高くなり、微視的な損傷を強める可能性があります。ズームを高くすると、領域あたりのエネルギーが増えるため、暗号をアブレーションする時間が短くなり、その逆も同様です。ピクセル滞留時間を増減して、アブレーションの速度と損傷の程度を変更することもできます。画像化された組織が安定していない場合(例えば、蠕動運動のため)、アブレーションを迅速に実行する必要があります。この目的のために、アブレーションの速度は、例えば、ズームおよび/またはレーザー出力を増加させることによって最適化されるべきである。

複数のイメージングセッションで同じ腸領域を見つけることは、実験の成功を確実にするために適切に実行する必要がある別の重要なステップです。そのためには、腸を常に同じ方法で配置する必要があります。小腸と大腸の同じ領域を見つけるための基準点として常に盲腸を使用することをお勧めします。綿棒で関心のある組織を穏やかに伸ばすことで、関心のある領域が対物レンズの作動距離の範囲内にあることが保証され、さかのぼることができる領域の数が最大化されます。さらに、後のイメージングセッションでは局在化しない可能性のある領域を考慮して、各マウスの複数の顕微鏡位置を常にアブレーションしてイメージングすることをお勧めします。腸の位置が正しい場合でも、領域が見つからない場合は、マウスの位置を変更し、露出領域の向きを変更するのに役立ちます。経時的に陰窩を追跡することは、いくつかの隣接する陰窩のより大きな腸野がアブレーションされる実験では面倒な場合があります。このような有害な侮辱は、上皮単層を超えた組織のリモデリングを呼び起こす可能性があり、時間の経過とともに領域を追跡するために使用される組織ランドマークの変更に至る可能性があります。損傷部位から十分な距離にあるランドマークを選択し、損傷領域を数百マイクロメートル上回る広い視野をキャプチャすることで、長期実験が成功する可能性が高まります。顕微鏡ステージでの腸の誤った位置に加えて、胃腸管の蠕動運動は画像化を妨げる可能性があります。この問題は、2つの方法で改善される可能性があります。動きの頻度が高すぎない場合は、露光時間を増やして同じ領域でこのプロセスを繰り返すことができます。あるいは、蠕動運動を減少させるために、より多くの麻酔を使用することができる。高用量のイソフルランを短い調整に制限することをお勧めします。.全体として、迅速な回復を確実にするために、イメージングセッションは可能な限り短く、最適には3時間未満に保つ必要があります。

レーザーアブレーションと縦方向の生体内顕微鏡を組み合わせたアプローチには、他の損傷モデルと比較していくつかの利点があります。以前の(化学的)損傷モデルには、有害な侮辱を局所的に閉じ込める能力が欠けていました6,11,12,19,20。レーザーアブレーションは、定義された関心領域への損傷を制限することにより、この欠点を克服します。これにより、研究者は損傷の場所と損傷の程度を制御できます。損傷の重症度を調節して、陰窩または微視的な腸野全体を切除し、陰窩スケールでの再生応答について知らせることができます。空間制御に加えて、レーザーアブレーションは損傷の開始を正確に計ることも可能にし、それによって以前の薬物、化学、および感染モデル^の精度を上回ります9,10,11,12,19,20。私たちのプロトコルは、腸の局所的な損傷を誘発する方法としてレーザー誘発熱アブレーションを使用した以前の研究を拡張しています^21,23。以前のレーザー誘発損傷モデルは、小腸²¹または遠位結腸²³の管腔表面の局所領域を画像化した。手術とレーザーアブレーションを組み合わせたアプローチにより、腸上皮(特に陰窩)を高解像度で可視化し、小腸、盲腸、近位結腸の任意の位置で組織回復のレーザーアブレーションとフォローアップイメージングを行うことができます。同じ腸領域の経時的な回復を捉え、実験セットアップに従って腸のさまざまな層(粘膜、粘膜下組織、筋肉、漿膜)を視覚化することができます。私たちの技術は、主に数週間/数ヶ月の期間にわたる長期の繰り返しイメージング用に調整されています。陰窩の短期的な回復ダイナミクス(例えば、損傷後の数日間の連続)を研究するために、ここで説明するレーザーアブレーションアプローチを、生体内画像化ウィンドウ²⁷、^28、40と組み合わせることができる。

このプロトコルは、再生、免疫学、および癌研究にまたがる多様な科学分野の多数の研究アプリケーションに利用できます。腸管再生の縦断的イメージングは、上皮の完全性とバリア機能を維持し、腸管腔内の病原体に対する宿主防御を可能にし、発癌性変異のクリアランスと拡散の根底にある細胞動態に光を当てます。それぞれの科学的質問は、レーザー誘発損傷の程度とイメージングの期間に独自の要求を投げかけます。蛍光レポーターマウスと注入された色素は、目的の任意の細胞と構造の視覚化を可能にすることにより、取得できるデータを大幅に拡大および洗練することができます。例えば、Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confeti マウスは幹細胞の子孫を可視化するために使用でき、Rosa26-mTmG レポーターは組織構造に関する情報を提供します。これらの最近の技術的進歩により、生体内腸実験は、腸の生物学と病気の理解を深めるための有利なツールになっています。