الاستئصال بالليزر والفحص المجهري داخل الجسم لدراسة إعادة تشكيل الأمعاء
Summary
هنا ، نقدم طريقة للحصول على صور للأمعاء عند الجرح الناجم عن الليزر. من خلال تعريض أمعاء الفأر لليزر متعدد الفوتونات ، يتم إحداث فقدان سرداب (سرداب) واحد أو عدة مرات محليا. من خلال تصوير المنطقة المتضررة بشكل متكرر على مدار أشهر ، يتم التقاط ديناميكيات الوقت الفعلي للتعافي المعوي.
Abstract
التحقيق في الانتعاش المعوي في الجسم الحي هو تحد تقني رائع. أدى الافتقار إلى بروتوكولات التصوير الطولي إلى منع رؤى أعمق في ديناميكيات مقياس الخلايا والأنسجة التي تنظم تجديد الأمعاء. هنا ، نصف طريقة الفحص المجهري داخل الجسم التي تحفز محليا تلف الأنسجة على مقياس سرداب واحد وتتبع الاستجابة التجديدية لظهارة الأمعاء في الفئران الحية. تم استئصال الخبايا المفردة أو الحقول المعوية الأكبر بواسطة ليزر الأشعة تحت الحمراء متعدد الفوتونات عالي الكثافة بطريقة يتم التحكم فيها زمانيا ومكانيا. مكن التصوير اللاحق المتكرر على المدى الطويل داخل الجسم من تتبع المناطق المتضررة بمرور الوقت وسمح بمراقبة ديناميكيات القبو أثناء استعادة الأنسجة على مدى عدة أسابيع. لوحظت أحداث إعادة تشكيل القبو مثل انشطار القبو والاندماج والاختفاء في الأنسجة المجاورة عند التلف الناجم عن الليزر. يتيح هذا البروتوكول دراسة ديناميكيات القبو في كل من الإعدادات الاستتبابية والفيزيولوجية المرضية ، مثل الشيخوخة وبدء الورم.
Introduction
يتم تحدي البطانة الظهارية للأمعاء باستمرار بواسطة أحماض المعدة والسموم والميكروبات التي يمكن أن تسبب اضطرابا في الحاجز الظهاري. البنية المعوية وتنظيم الأنسجة متخصصة في التجديد الذاتي وإصلاح الأضرار باستمرار. يتم تنظيم ظهارة أحادية الطبقة من الأمعاء الدقيقة في وحدات سردابالزغابات 1. في الاتزان الداخلي ، تؤدي الخلايا الجذعية المعوية Lgr5 + ذاتية التجديد الموجودة في قاعدة القبو إلى ذرية متباينة. تنتقل الخلايا الابنة المتمايزة إلى طرف محور الزغابات بطريقة الحزام الناقل ، حيث يتم إلقاؤها بحيث يتم تجديد بطانة الأمعاء في 3-5 أيام 2,3. على المدى الطويل ، لا تساهم جميع خلايا Lgr5 + بالتساوي في تجديد الأنسجة ، لأن هذا يعتمد أيضا على قدرة الخلايا على التحرك ضد الحزام الناقل نحو قاعدة القبو (أي الحركة التراجعية)4,5. في الواقع ، عند استئصال خلايا Lgr5 + عن طريق الإشعاع ، على سبيل المثال ، تنتقل الخلايا السلفية خارج قاعدة القبو إلى القاعدة لإلغاء التمايز وتجديد تجمع الخلايا الجذعية6،7،8.
يمكن أن يسبب الالتهاب الحاد فقدان الخلايا الجذعية Lgr5 + 9,10. بالإضافة إلى فقدان الخلايا الجذعية ، يمكن أن تسبب العديد من العوامل الخارجية أضرارا حادة للظهارة على نطاق القبو. ثبت أن الإشعاع والعلاجات الكيميائية والمضادات الحيوية تصيب الخبايا المعويةوالزغابات 11. يمكن أن تتأثر الحقول الأكبر من الخبايا والزغابات بالعدوى البكتيرية والفيروسية والطفيلية12. تمتلك الأمعاء قدرة ملحوظة على التعافي من التلف الداخلي والخارجي على نطاق القبو عن طريق انشطار القبو (تقسيم سرداب واحد إلى قسمين)13. عند الإصابة ، تخضع الخبايا في المنطقة المجاورة للضرر للانشطار لتجديد أرقام القبوات. تحدث هذه الظاهرة أيضا ، وإن كان بدرجة أقل ، أثناء التوازن14,15. لموازنة الزيادة المحتملة في أعداد الأكواخ أثناء التوازن ، يمكن للخبايا أيضا دمج (دمج سربيتين في واحد)16,17. من غير المعروف ما إذا كان اندماج الشفرة يلعب أيضا دورا في إعادة إنشاء أرقام الخوادم بعد الإصابة. وعلاوة على ذلك، لا يزال يتعين توضيح الديناميات والعوامل التنظيمية لهذه العملية.
لا غنى عن نماذج الإصابة لدراسة تجديد الأنسجة في الجسم الحي. تم استخدام نماذج إصابة مختلفة لدراسة تجديد الأنسجة المعوية. استخدمت الاستراتيجيات التجريبية السابقة جرعة عالية من الإشعاع لاستنفاد تجمعات الخلايا الجذعية18 أو العلاج بكبريتات ديكستران الصوديوم (DSS) للحث على التهاب القولون المزمن والحاد وفقدان القبو في الفئران19,20. تم استخدام الاجتثاث أحادي الخلية بالوسائل الوراثية أو البصرية لتحسين تلف الأنسجة ويعتبر أداة جذابة لفصل دور الخلايا الجذعية والسلفية21،22 ودراسة تجديد الأوعية الدموية23. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير نظام إصابة الخزعة لإحداث ضرر في حقول أكبر للعديد من الخبايا والزغابات24. الأهم من ذلك ، أن الاستجابة للإهانة الضارة قد تختلف على طول المحور القريب البعيد للأمعاء ، كما ورد للإشعاع ، والذي تسبب في أضرار في الأمعاء الدقيقة أكثر من القولون25. هذا يسلط الضوء على الحاجة إلى طرق مستهدفة تتحكم في كل من مدى الإهانة الضارة وتوطينها في الأمعاء.
تم تقييم مدى الضرر والتعافي تقليديا بوسائل ثابتة ، والتي توفر معلومات محدودة حول ديناميكيات استعادة الأنسجة. فتح الفحص المجهري داخل الجسم (IVM) فرصا فريدة لقياس سلوك الخلايا الجذعية ، وإعادة تشكيل الظهارة ، والتجديد في العديد من الأعضاء 26،27،28،29،30 ، وقدم رؤى مؤثرة في بيولوجيا الأمعاء4،5،21،31،32،33،34 ، 35,36.
هنا ، نصف طريقة لإحداث تلف معوي محدد زمانيا مكانيا والتقاط استعادة البطانة الظهارية المعوية. نحن نستخدم اثنين من الاجتثاث بالليزر القائم على الفوتون لإتلاف الخبايا المعوية ومتابعة الاستجابة الفورية للجرح والتعافي على المدى الطويل عن طريق الفحص المجهري المتكرر داخل الجسم. يسمح بروتوكولنا للمرء برسم خريطة لإعادة التشكيل التجديدي لبنية الأنسجة المعوية استجابة لتلف الأنسجة المحلية. يمكن قياس ديناميات القبو ، بما في ذلك أحداث الانشطار والاندماج ، وتتبعها بسهولة بمرور الوقت. يمكن استخدام تطبيق الاستئصال بالليزر والتصوير المتكرر داخل الجسم كمنصة للتحقيق في ديناميكيات الأنسجة في بنية الأمعاء أثناء التوازن والفيزيولوجيا المرضية ، مثل بدء الورم.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجمع هذا البروتوكول بين الاستئصال المجهري بالليزر والفحص المجهري الطولي داخل الجسم لمتابعة تجديد الأمعاء من الاستجابة المبكرة للتلف إلى إعادة تشكيل الأنسجة على المدى الطويل. تم تأسيس هذه التقنية في الالتزام الصارم بالاعتبارات الأخلاقية للحث على الاستئصال بالليزر المجهري وتصويره ، وعند اتباعها بدقة ستحافظ على رفاهية الحيوان. أثناء الجراحة ، من المهم التأكد من الحفاظ على سلامة الأمعاء بشكل جيد. يمكن تحقيق ذلك عن طريق التعامل بلطف مع الأنسجة باستخدام مسحات قطنية مبللة معقمة ، مما يمنع النزيف أو الجفاف من الأنسجة. يجب أيضا تقييم مدى الضرر المجهري الناجم عن الليزر بعناية عن طريق تصوير الطبقات المعوية المختلفة للمنطقة بعد الاستئصال بالليزر. إذا رغب الباحث في تكييف وتيرة الخطوات التجريبية الموضحة في هذا البروتوكول ، فيجب استشارة لجنة أخلاقيات الحيوان في المعهد قبل التجربة لتحديد النتيجة على الرفاهية.
يسمح الفحص المجهري المتكرر داخل الجسم بمراقبة استعادة الأنسجة في نفس الماوس بمرور الوقت. التعرض الجراحي المتكرر للأمعاء يمنح بسهولة الوصول البصري إلى القناة المعوية بأكملها. تعمل السمات المتأصلة في الأنسجة ، مثل الأوعية الدموية ، كمعالم لتحديد نفس المناطق المعوية في كل جلسة تصوير. وبالتالي ، يمكن تصوير نفس منطقة الأنسجة على مدى عدة أسابيع ، مما يمكن المرء من تحديد تجديد الأنسجة على المدى الطويل في نفس منطقة الأمعاء في نفس الفأر. يوفر التحكم الزماني المكاني الذي توفره طريقة الجراحة والتصوير المدمجة ميزة أنه يمكن تصوير نفس العضو في ظل ظروف الاستتباب والتجديد في نفس الفأر ، وهو ما يتناقض مع نماذج تلف العضو بالكامل السابقة حيث نشأت عينات التحكم والتجديد من فئران مختلفة11،12،18،19،20 . وبالتالي ، فإن إعدادنا التجريبي يقلل من العدد المطلوب من الحيوانات اللازمة للتجربة ويقلل من التباين داخل الحيوان.
يجب أن يبدأ استكشاف أخطاء البروتوكول وإصلاحها بمراجعة تقنية التعامل مع الماوس والأمعاء ، والتحكم في معدات وإعدادات الفحص المجهري. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي تتطلب مزيدا من الاهتمام. أولا ، من أجل ضمان رفاهية الحيوان وجودة البيانات العالية المستمرة ، يجب تنفيذ جميع الأعمال في بيئة معقمة نظيفة باستخدام تقنية التعقيم ، ويجب الحفاظ على درجة حرارة الماوس أثناء الجراحة وكل جلسة تصوير. يعد الحفاظ على رطوبة الأنسجة بمحلول ملحي معقم ودافئ مسبقا أثناء التصوير أمرا ضروريا ويمنع تليف الأنسجة.
لضمان إجراء التجربة بطريقة قابلة للتكرار ، من المهم محاذاة الليزر قبل الاستخدام للحصول على الأمثل وقياس خرج الطاقة لليزر متعدد الفوتونات في بداية كل جلسة. معلمات مثل نوع الهدف والتكبير ووقت المسكن وقوة الليزر والطول الموجي لها تأثيرات على مدى الاجتثاث بالليزر المجهري ويجب أخذها في الاعتبار. في هذه الدراسة ، يتم إجراء كل من الاستئصال بالليزر والتصوير بقوة ليزر تبلغ 1.2 واط (خارج العدسة) بطول موجي 960 نانومتر من خلال هدف Fluotar VISIR 25x / 0.95 WATER. يؤثر تغيير الطول الموجي أو خصائص المسح الضوئي على مدى الضرر المجهري. يترجم الطول الموجي المنخفض (مثل 840 نانومتر) إلى فوتونات ذات طاقة أعلى وغالبا في ناتج أعلى من الليزر ، وقد يعزز الضرر المجهري. ينتج عن التكبير العالي المزيد من الطاقة لكل منطقة ، وبالتالي وقت أقل لاستئصال الخبايا ، والعكس صحيح. يمكن أيضا زيادة وقت مسكن البكسل أو تقليله لتغيير سرعة الاجتثاث ومدى الضرر. عندما يكون النسيج المصور غير مستقر (على سبيل المثال ، بسبب الحركات التمعجية) ، يجب إجراء الاستئصال بسرعة. لهذا الغرض ، يجب تحسين سرعة الاجتثاث ، على سبيل المثال ، زيادة التكبير و / أو إخراج الليزر.
يعد العثور على نفس المنطقة المعوية خلال جلسات تصوير متعددة خطوة مهمة أخرى يجب تنفيذها بشكل صحيح لضمان نجاح التجربة. للقيام بذلك ، يجب وضع الأمعاء بنفس الطريقة بالضبط في جميع النقاط الزمنية. نوصي دائما باستخدام الأعور كنقطة مرجعية للعثور على نفس المناطق في الأمعاء الدقيقة والكبيرة. يضمن تمديد الأنسجة ذات الأهمية برفق باستخدام مسحات القطن أن تكون منطقة الاهتمام في نطاق مسافة العمل الموضوعية ويزيد من عدد المناطق التي يمكن تتبعها. بالإضافة إلى ذلك ، نوصي دائما باستئصال وتصوير مواضع مجهرية متعددة في كل ماوس لحساب المناطق التي قد لا يتم توطينها مرة أخرى في جلسة تصوير لاحقة. إذا تعذر العثور على المناطق ، على الرغم من أن وضع الأمعاء صحيح ، فقد يساعد ذلك في إعادة وضع الماوس وتغيير اتجاه المنطقة المكشوفة. يمكن أن يكون تتبع الخبايا بمرور الوقت مرهقا للتجارب التي يتم فيها إزالة الحقول المعوية الأكبر للعديد من الخبايا المجاورة. يمكن أن تؤدي مثل هذه الإهانات الضارة إلى إعادة تشكيل الأنسجة خارج الطبقة الظهارية الأحادية ، والتي يمكن أن تتوج بتعديل معالم الأنسجة المستخدمة لتتبع المنطقة بمرور الوقت. إن اختيار المعالم على مسافة كافية من الموقع المتضرر والتقاط مجالات رؤية أكبر تتجاوز المنطقة المتضررة بعدة مئات من الميكرومترات يزيد من فرصة نجاح التجارب طويلة الأجل. بالإضافة إلى الوضع غير الصحيح للأمعاء على مرحلة المجهر ، قد تتداخل الحركات التمعجية في الجهاز الهضمي مع التصوير. يمكن تحسين هذه المشكلة بطريقتين. إذا لم يكن تواتر الحركات مرتفعا جدا ، فقد تتكرر العملية في نفس المنطقة مع زيادة وقت التعرض. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام كميات أكبر من التخدير لتقليل التمعج. نوصي بالحد من جرعات أعلى من الأيزوفلوران إلى تعديلات قصيرة. إجمالا ، يجب أن تبقى جلسات التصوير قصيرة قدر الإمكان ، على النحو الأمثل أقل من 3 ساعات ، لضمان التعافي السريع.
يتميز نهج الاجتثاث بالليزر والفحص المجهري الطولي داخل الجسم بالعديد من المزايا عند مقارنته بنماذج الضرر الأخرى. افتقرت نماذج الضرر (الكيميائية) السابقة إلى القدرة على حصر الإهانة الضارة محليا6،11،12،19،20. يتغلب الاجتثاث بالليزر على هذا القصور من خلال تقييد الضرر بمنطقة اهتمام محددة. وهذا يمكن الباحثين من التحكم في موقع الإصابة ، وكذلك مدى الضرر. يمكن تعديل شدة الضرر لاستئصال الخبايا أو الحقول المعوية المجهرية بأكملها للإبلاغ عن الاستجابات التجديدية على نطاق السرداب. بالإضافة إلى التحكم المكاني ، يسمح الاجتثاث بالليزر أيضا بتحديد وقت ظهور الضرر بدقة ، وبالتالي تجاوز دقة نماذج الأدوية والكيماويات والعدوى السابقة9،10،11،12،19،20. يتوسع بروتوكولنا في الدراسات السابقة التي استخدمت الاستئصال الحراري الناجم عن الليزر كوسيلة لإحداث تلف موضعي في الأمعاء21,23. صورت نماذج الضرر السابقة التي يسببها الليزر المناطق المحلية في الأمعاءالدقيقة 21 أو السطح اللمعي للقولون البعيد23. يتيح نهج الجراحة والاستئصال بالليزر المشترك تصور ظهارة الأمعاء (الخبايا على وجه الخصوص) بدقة عالية ، وإجراء الاستئصال بالليزر ومتابعة تصوير استعادة الأنسجة في أي موضع من الأمعاء الدقيقة والأزعور والقولون القريب. إنه يلتقط استعادة نفس المناطق المعوية بمرور الوقت ، مما يسمح بتصور طبقات مختلفة من الأمعاء (الغشاء المخاطي ، تحت المخاطية ، العضلات ، والأمصال) وفقا للإعداد التجريبي. تم تصميم تقنيتنا بشكل أساسي للتصوير المتكرر طويل المدى لمدة عدة أسابيع / أشهر. لدراسة ديناميكيات الاسترداد قصيرة المدى للخبايا (على سبيل المثال ، لعدة أيام متتالية بعد الضرر) ، يمكن دمج نهج الاجتثاث بالليزر الموصوف هنا مع نوافذ التصوير داخل الجسم27،28،40.
يمكن استخدام هذا البروتوكول للعديد من التطبيقات البحثية من مجالات علمية متنوعة تشمل التجديد والمناعة وأبحاث السرطان. يلقي التصوير الطولي لتجديد الأمعاء الضوء على الديناميات الخلوية التي تحافظ على سلامة الظهارة ووظيفة الحاجز ، وتمكن من الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض في تجويف الأمعاء ، والتي تكمن وراء إزالة وانتشار الطفرات المسرطنة. سيلقي كل سؤال علمي مطالب فريدة على مدى الضرر الناجم عن الليزر ومدة التصوير. يمكن للفئران المراسل الفلورية والأصباغ المحقونة توسيع وتحسين البيانات التي يمكن الحصول عليها بشكل كبير من خلال السماح بتصور أي خلية وبنية ذات أهمية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام ماوس Lgr5-CreERt2: Rosa26-Confetti لتصور ذرية الخلايا الجذعية ، بينما يبلغ مراسل Rosa26-mTmG عن بنية الأنسجة. معا ، تجعل هذه التطورات التكنولوجية الحديثة التجارب المعوية داخل الجسم أداة مربحة لتعزيز فهمنا لبيولوجيا الأمعاء والمرض.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي NWO (منحة Vici 09150182110004 إلى JVR ومنحة Veni 09150161910151 إلى H.A.M) ، OCENW. GROOT.2019.085 (إلى JVR) ، وزمالة EMBO لما بعد الدكتوراه (منحة ALTF 452-2019 إلى H.A.M).
Materials
| Anesthesia induction box | Veterinary Technics | ||
| Autoclave | Certoclav | ||
| Betadine | Mylan | 202809 | |
| Diaper (underpad) | Absorin comfort | ||
| Dumont forceps | Fine Scientific Tools | 11255-20 or 11272-40 | Inox, style #55, used to hold the peritoneum |
| Enzymatic instrument cleaner | Roboz | EC-1000 | |
| Ethanol 80% | homemade | NA | |
| Eye ointment | Duratears Z (Alcon) | 288/28282-6 | |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Scientific Tools | 14060-09 | Used to cut skin and peritoneum of the mouse |
| Gauze 5 cmX5 cm | Cutisoft (Bsn medical) | 45847-00 | |
| Graefe Forceps Curved Serrated | Fine Scientific Tools | 11051-10 | Used to hold the skin |
| Hartman Hemostat Straight | Fine Scientific Tools | 13002-10 | Used for suturing |
| Heating pad | Comfort | T5-5000 | |
| Imaging box | Custom made | ||
| Incision film | Nobafilm | 172215 | |
| Inverted multi-photon microscope with automated stage | Leica Microsystems | NA | |
| Isoflurane (vetflurane) | Pharmachemie BV, Haarlem, Netherlands | 305788 | |
| Isoflurane vaporizer | Penlon sigma delta | ||
| Micropore paper tape | Micropore | ||
| NaCl 0.9% | Braun | Other brands available | |
| Needle 25G | BD | 300600 | |
| Paper tape tesa | Tesa | NA | |
| Parafilm | Bemis | PM-994 | semi-transparent tape |
| Razor blades | Supermax stainless steel | Other brands available | |
| Rectal probe | Kent Scientific | 20250-91 | |
| Rimadyl Cattle (carprofen) | Zoetis B.V | Registration# REG NL 10130 | |
| Student Fine Scissors Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | Used to cut gauze |
| Surgical instrument cleaner | Roboz | IC-1000 | |
| Surgical instrument lubricant | Roboz | IL-1000 | |
| Syringes (1 ml) | BD | 303172 | Other brands available |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride) | Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare | Registration# RVG 08725 | |
| Vicryl polyglactin suture 5-0 FS-2 needle | Ethicon | V292ZH | |
| VirkonS | Bio-services | antiseptic solution | |
| Wooden cotton swab (sterile) | Klinion | 531530 | Other brands available |
References
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Darwich, A. S., Aslam, U., Ashcroft, D. M., Rostami-Hodjegan, A. Meta-analysis of the turnover of intestinal epithelia in preclinical animal species and humans. Drug Metabolism and Disposition. 42 (12), 2016-2022 (2014).
- Beumer, J., Clevers, H. Regulation and plasticity of intestinal stem cells during homeostasis and regeneration. Development. 143 (20), 3639-3649 (2016).
- Ritsma, L., et al. Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging. Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).
- Azkanaz, M., et al. Retrograde movements determine effective stem cell numbers in the intestine. Nature. 607 (7919), 548-554 (2022).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tomic, G., et al. Phospho-regulation of ATOH1 is required for plasticity of secretory progenitors and tissue regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 436-443 (2018).
- Asfaha, S., et al. Krt19+/Lgr5- cells are radioresistant cancer-initiating stem cells in the colon and intestine. Cell Stem Cell. 16 (6), 627-638 (2015).
- Schmitt, M., et al. Paneth cells respond to inflammation and contribute to tissue regeneration by acquiring stem-like features through SCF/c-Kit signaling. Cell Reports. 24 (9), 2312-2328 (2018).
- Davidson, L. A., et al. Alteration of colonic stem cell gene signatures during the regenerative response to injury. Biochimica et Biophysica Acta. 1822 (10), 1600-1607 (2012).
- Ijiri, K., Potten, C. S. Further studies on the response of intestinal crypt cells of different hierarchical status to eighteen different cytotoxic agents. British Journal of Cancer. 55 (2), 113-123 (1987).
- Andersson-Rolf, A., Zilbauer, M., Koo, B. K., Clevers, H. Stem cells in repair of gastrointestinal epithelia. Physiology. 32 (4), 278-289 (2017).
- Totafurno, J., Bjerknes, M., Cheng, H. The crypt cycle. Crypt and villus production in the adult intestinal epithelium. Biophysical Journal. 52 (2), 279-294 (1987).
- Dekaney, C. M., Gulati, A. S., Garrison, A. P., Helmrath, M. A., Henning, S. J. Regeneration of intestinal stem/progenitor cells following doxorubicin treatment of mice. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297 (3), G461-G470 (2009).
- Cairnie, A. B., Millen, B. H. Fission of crypts in the small intestine of the irradiated mouse. Cell and Tissue Kinetics. 8 (2), 189-196 (1975).
- Bruens, L., Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J., Snippert, H. J. In vivo imaging reveals existence of crypt fission and fusion in adult mouse intestine. Gastroenterology. 153 (3), 674-677 (2017).
- Baker, A. M., et al. Crypt fusion as a homeostatic mechanism in the human colon. Gut. 68 (11), 1986-1993 (2019).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118 (2), 229-241 (2004).
- Choi, J., et al. Intestinal crypts recover rapidly from focal damage with coordinated motion of stem cells that is impaired by aging. Scientific Reports. 8 (1), 10989 (2018).
- Tian, H., et al. A reserve stem cell population in small intestine renders Lgr5-positive cells dispensable. Nature. 478 (7368), 255-259 (2011).
- Choi, M., Yun, S. H. In vivo femtosecond endosurgery: an intestinal epithelial regeneration-after-injury model. Optics Express. 21 (25), 30842-30848 (2013).
- Seno, H., et al. Efficient colonic mucosal wound repair requires Trem2 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (1), 256-261 (2009).
- Hua, G., et al. Distinct levels of radioresistance in Lgr5+ colonic epithelial stem cells versus Lgr5+ small intestinal stem cells. Cancer Research. 77 (8), 2124-2133 (2017).
- Rompolas, P., et al. Live imaging of stem cell and progeny behaviour in physiological hair-follicle regeneration. Nature. 487 (7408), 496-499 (2012).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917 (2014).
- Rakhilin, N., et al. An intravital window to image the colon in real time. Nature Communications. 10 (1), 5647 (2019).
- Messal, H. A., et al. Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH. Nature Protocols. 16 (1), 239-262 (2021).
- Farrelly, O., et al. Two-photon live imaging of single corneal stem cells reveals compartmentalized organization of the limbal niche. Cell Stem Cell. 28 (7), 1233-1247 (2021).
- Krndija, D., et al. Active cell migration is critical for steady-state epithelial turnover in the gut. Science. 365 (6454), 705-710 (2019).
- Bruens, L., et al. Calorie restriction increases the number of competing stem cells and decreases mutation retention in the intestine. Cell Reports. 32 (3), 107937 (2020).
- Bietar, B., Zhou, J., Lehmann, C. Utility of intestinal intravital microscopy for the study of CNS injury-induced immunodepression syndrome (CIDS). Clinical Hemorheology and Microcirculation. 79 (1), 137-147 (2021).
- Erreni, M., Doni, A., Weigert, R. Method for acute intravital imaging of the large intestine in live mice. Methods in Molecular Biology. 2304, 285-299 (2021).
- Hiltensperger, M., et al. Skin and gut imprinted helper T cell subsets exhibit distinct functional phenotypes in central nervous system autoimmunity. Nature Immunology. 22 (7), 880-892 (2021).
- Martínez-Sánchez, L. D. C., et al. Epithelial RAC1-dependent cytoskeleton dynamics controls cell mechanics, cell shedding and barrier integrity in intestinal inflammation. Gut. 72 (2), 275-294 (2022).
- Means, A. L., Xu, Y., Zhao, A., Ray, K. C., Gu, G. A CK19(CreERT) knockin mouse line allows for conditional DNA recombination in epithelial cells in multiple endodermal organs. Genesis. 46 (6), 318-323 (2008).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Messal, H. A., van Rheenen, J., Scheele, C. L. An intravital microscopy toolbox to study mammary gland dynamics from cellular level to organ scale. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 26 (1), 9-27 (2021).
