Summary

Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanarak Yumurtalık Hücrelerinde X Kromozomal Anormalliklerinin Araştırılması

Published: April 07, 2023
doi:

Summary

Bu makalede, X kromozomal anomalileri olan kadınlardan aşılanmamış ve aşılanmış over korteks dokusundaki over hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için floresan in situ hibridizasyona dayalı iki yöntem sunulmaktadır.

Abstract

Dünya çapında milyonlarca insan doğurganlıkla ilgili sorunlarla uğraşmaktadır. Azalmış doğurganlık, hatta infertilite, kromozomal anormalliklerin en yaygın olduğu genetik bozukluklar da dahil olmak üzere birçok farklı nedenden kaynaklanabilir. Floresan in situ hibridizasyon (FISH), insanlarda kromozomal anormallikleri tespit etmek için iyi bilinen ve sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. FISH esas olarak sayısal veya yapısal kromozomal anormallikleri olan erkeklerin spermatozoasındaki kromozomal anormalliklerin analizi için kullanılır. Ayrıca, bu teknik, yumurtalık disgenezine neden olduğu bilinen X kromozomal anormalliklerini tespit etmek için kadınlarda da sıklıkla uygulanır. Bununla birlikte, lenfositlerde ve / veya bukkal hücrelerde X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriği hakkında bilgi hala eksiktir.

Bu çalışmanın amacı, over hücrelerinin X kromozomal içeriğini tanımlamak için FISH’e dayalı iki yöntem sunarak kadınlarda X kromozomal anormallikleri ile ilgili temel araştırmaları ilerletmektir. İlk olarak, X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan aşılanmamış yumurtalık korteks dokusunda izole yumurtalık hücrelerinin (oositler, granüloza hücreleri ve stromal hücreler) X kromozomal içeriğini belirlemek için bir yöntem tanımlanmıştır. İkinci yöntem, uzun süreli aşılamadan sonra X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan immün sistemi baskılanmış farelere yumurtalık dokusunda yeni oluşan sekonder ve antral foliküllerin yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirleyerek kromozomal anormalliklerin folikülogenez üzerindeki etkisini değerlendirmeye yöneliktir. Her iki yöntem de X kromozomal anormallikleri olan kadınların üreme potansiyeli hakkında fikir edinmek için gelecekteki araştırmalarda yardımcı olabilir.

Introduction

Kısırlık, erkek veya kadın üreme sisteminin bir sağlık sorunudur ve dünya çapında üreme çağındaki yaklaşık 186 milyon bireyi etkilemektedir1. İnfertil çiftlerin en az% 35’inde infertilite, kadın üreme sisteminin bir bozukluğundan kaynaklanır2. Kadın infertilitesine neden olabilecek genetik faktörler, genital sistem anormallikleri, endokrin disfonksiyon, inflamatuar hastalıklar ve iyatrojenik tedavi gibi birçok faktör vardır3.

İnfertil kadınların yaklaşık %10’unda genetik anormallikler mevcuttur 4,5. Tüm genetik anormallikler arasında, X kromozomu anormallikleri yumurtalık disgenezisinin en yaygın nedenidir2. Birçok çalışma, Turner sendromu (TS) veya Triple X sendromlu kadınlarda X kromozomal anormalliklerinin, germ hücrelerinin hızlandırılmış kaybı veya bozulmuş oogenez 6,7,8 nedeniyle erken yumurtalık yetmezliği ile ilişkili olduğunu bildirmiştir.

X kromozomunun anormallikleri ayrılabilir: 1) X kromozomlarının sayısının farklı olduğu ancak X kromozomlarının sağlam olduğu sayısal sapmalar; ve 2) X kromozomunun genetik materyal kazandığı veya kaybettiği yapısal sapmalar 3,9. X kromozomunun sayısal anormallikleri yapısal anormalliklerden daha yaygındır ve genellikle hücre bölünmesi sırasındaki kendiliğinden hatalardan kaynaklanır 3,9. Mayoz sırasında böyle bir hata meydana geldiğinde, anöploid gametlere ve nihayetinde tüm hücrelerde kromozomal anormallikleri olan yavrulara yol açabilir. Ontogenezin erken evrelerinde mitoz sırasında meydana gelen hataların bir sonucu olarak somatik hücrelerde kromozom kusurları ortaya çıktığında, mozaikliğe yol açabilir. Bu bireylerde hem normal X kromozomal içeriğine sahip hücreler hem de X kromozomal anormalliklerine sahip hücreler mevcuttur.

1980’lerde, metafaz ve interfaz kromozomları10,11 üzerindeki spesifik nükleik asit dizilerini görselleştirmek ve bulmak için floresan in situ hibridizasyon (FISH) adı verilen sitogenetik bir teknik geliştirilmiştir. Bu teknik, kromozomdaki belirli bir diziye bağlanmak için floresan etiketli DNA problarını kullanır ve daha sonra bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir.

Günümüzde, FISH klinik bir tanı aracı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve kromozomal anormalliklerin saptanmasında altın standart olarak kabul edilmektedir10. Üreme tıbbı alanında, sperm üzerindeki FISH analizi, somatik hücrelerde sayısal veya yapısal kromozomal anormallikleri olan erkeklerde spermatozoanın X kromozomal içeriği hakkında fikir edinmek için kullanılmıştır12,13,14. Bu çalışmalar, kromozomal anormallikleri olan erkeklerin, normal karyotipli erkeklere kıyasla menilerinde bulunan anöploid spermatozoa sıklığının daha yüksek olduğunu göstermiştir 12,13,14.

Spermatozoanın aksine, kromozomal anormalliği olan bireylerde yumurtalık hücrelerinin (oositler, granüloza / teka hücreleri ve stromal hücreler dahil) X kromozomal içeriği ve bu hücrelerin anöploidisinin üreme potansiyelleri üzerindeki olası sonuçları hakkında çok az şey bilinmektedir. Yumurtalık hücrelerinin karyotipi hakkında spermatozoaya kıyasla az bilgi bulunmasının önemli bir nedeni, kadınların oosit veya yumurtalık korteks dokusu elde etmek için folikül delinmesi veya ameliyatı gibi invaziv bir prosedürden geçmek zorunda kalmalarıdır. Bu nedenle dişi gametlerin araştırma amacıyla elde edilmesi zordur.

Şu anda, Hollanda’da TS15’li genç kadınlarda yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonunun etkinliğini araştırmak için gözlemsel bir müdahale çalışması yapılmaktadır. Hastanın over korteks dokusunun bir parçası, over hücrelerinin X kromozomal içeriğini tanımlamak için mevcuttu16,17. Çalışmanın bir parçası olarak, lenfositler veya bukkal hücreler gibi yumurtalık dışı somatik hücrelerde kromozomal anormallik taşıyan kadınlarda yumurtalık hücrelerinde kromozomal anormalliklerin olup olmadığını belirlemek için ayrışmış yumurtalık korteks dokusunun FISH’ine dayanan yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Ayrıca yumurtalık hücrelerinde anöploidinin folikülogenez üzerine etkisi de belirlenmiştir. Bu amaçla, immün sistemi baskılanmış farelerde uzun süreli ksenotransplantasyon sırasında yapay olarak indüklenen folikülogenez sonrası yumurtalık korteks dokusunun histolojik kesitlerinin analizini sağlayan yerleşik bir FISH protokolü değiştirilmiştir. Bu çalışmada, X kromozomal anomalileri olan kadınlarda aşılanmamış ve aşılanmış over korteks dokusundaki yumurtalık hücrelerinde X kromozomal içeriğini belirlemek için FISH’e dayalı iki yöntem sunulmuş ve bu konudaki temel bilimi geliştirmek amaçlanmıştır.

Protocol

TurnerFertility çalışma protokolü, İnsan Denekleri İçeren Araştırma Merkez Komitesi (NL57738.000.16) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada TS’li 93 kadının yumurtalık korteks dokusu elde edilmiştir. Güvenlik önlemleri gerektiren malzemeler Tablo 1’de listelenmiştir. Tablo 1: Güvenlik önlemleri. Malzeme …

Representative Results

Aşılamadan önce izole edilmiş yumurtalık hücrelerinde FISHBu protokol kullanılarak elde edilen sonuçları göstermek için 45,X/46,XX (hasta A) veya 45,X/46,XX/47,XXX (hasta B) TS’li kadınlardan kriyokorunmuş over korteks dokusu kullanıldı. Hasta A’da lenfositlerin ‘sinde 45,X karyotip, ‘sinde 46,XX karyotip saptandı. B hastasında lenfositlerin ‘i 45,X, ‘i 46,XX ve ‘ü 47,XXX idi. Kontrol (kırmızı) olarak X kromozomu (yeşil) ve kromozom 18 için sentromere özgü prob…

Discussion

FISH analizi, hem erkek hem de kadınların lenfositlerinde veya bukkal hücrelerinde X kromozomal anormalliklerini tespit etmek için iyi bilinen bir tekniktir10. Birçok çalışma, X kromozomal anormallikleri olan erkeklerin gametleri üzerinde FISH’i tanımlamıştır, ancak FISH tarafından X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücreleri hakkında elde edilen ayrıntılı bilgiler hala14’ten yoksundur. Bu makalede, X kromozomal anormallikleri olan …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef ve Milan Intezar’a uzmanlıkları ve teknik yardımları için teşekkür eder. Finansman kaynakları: Merck Serono (A16-1395), Goodlife ve Ferring.

Materials

Acetic acid Biosolve BV 0001070602BS
Centrifuge 1200 Hettich Universal 4140
Collagenase I Sigma 131470
Coverslip VWR 0631-0146
DAPI Vector H-1200
DNase I Roche 10104159001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline  Lonza BE17-513Q
EDTA Merck 108421
Eosin-Y Sigma 1159350100
Ethanol EMSURE 1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technology 10100147
Fluorescence microscope for sections DM4 B Leica Microsystems 
Fluorescence microscope scope A1 Zeiss AXIO
Fluorescent labeled probes for dissociated cells Abbott Diagnostics CEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluorescent labeled probes for tissue sections Abbott Diagnostics CEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
Formaldehyde Sigma 252549
Glucose Merck 108337
Glue (Fixogum) Leica Microsystems LK071A
Hematoxylin Sigma 1159380025
Hybridization buffer Abott Diagnostics 32-804826/06J67-001
Hybridization Station  Dako S2451
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) Leica Biosystems
Image processing software on paraffine sections  Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunohitochemistry microscope slides Dako K802021-2
L15 Lonza 12-700Q
Liberase DH Roche 05 401 151 001
Light microscope Zeiss West Germany
Magnesium sulphate Merck A335586
Methanol Honeywell 14262-1L
Mounting medium Vectashield, Vector H-1000
Nonidet P40 Sigma 7385-1L
Paraffin Poth Hile 2712.20.10
Pepsin Sigma P7000-25G
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco 11530546
Plastic pipette CooperSurgical 7-72-4075/1
Potassium chloride  Merck 1049361000
Proteinase K Qiagen 19131
Rotation microtome HM 355S Thermo sceintific
Scalpel Dahlhausen 11.000.00.515
Slide for FISH on dissociated cells Thermo scientific J1810AM1JZ
Sodium bicarbonate Sigma 55761-500G
Standard Sodium Citrate (SSC) Fisher Scientific, Invitrogen 10515203
Stereomicroscope IX 70 Olympus
Target Retrieval Solution    Dako GV80511-2
Trypsin Sigma T4799
Tween-20 ThermoFisher 85113
Xylene BOOM 760518191000

References

  1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
  3. Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
  4. Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
  5. Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
  6. Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
  7. Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
  8. Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
  9. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  10. Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
  11. Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
  12. Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
  13. Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
  14. Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
  15. Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
  16. Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner’s syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
  17. Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
  18. Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
  19. Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
  20. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
  21. Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
  22. Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).

Play Video

Cite This Article
Nadesapillai, S., van der Velden, J., Braat, D., Fleischer, K., Peek, R. Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (194), e64734, doi:10.3791/64734 (2023).

View Video