Summary

Exploración de las aberraciones cromosómicas X en células ováricas mediante el uso de hibridación fluorescente in situ

Published: April 07, 2023
doi:

Summary

Este artículo presenta dos métodos basados en la hibridación fluorescente in situ para determinar el contenido cromosómico X de las células ováricas en tejido de la corteza ovárica no injertado e injertado de mujeres con aberraciones cromosómicas X.

Abstract

Millones de personas en todo el mundo se ocupan de cuestiones relacionadas con la fertilidad. La reducción de la fertilidad, o incluso la infertilidad, puede deberse a muchas causas diferentes, incluidos los trastornos genéticos, de los cuales las anomalías cromosómicas son las más comunes. La hibridación fluorescente in situ (FISH) es un método bien conocido y utilizado con frecuencia para detectar aberraciones cromosómicas en humanos. FISH se utiliza principalmente para el análisis de anomalías cromosómicas en los espermatozoides de varones con aberraciones cromosómicas numéricas o estructurales. Además, esta técnica también se aplica con frecuencia en mujeres para detectar aberraciones cromosómicas X que se sabe que causan disgenesia ovárica. Sin embargo, todavía falta información sobre el contenido cromosómico X de las células ováricas de mujeres con aberraciones cromosómicas X en linfocitos y/o células bucales.

El objetivo de este estudio es avanzar en la investigación básica sobre las aberraciones cromosómicas X en mujeres, mediante la presentación de dos métodos basados en FISH para identificar el contenido cromosómico X de las células ováricas. Primero, se describe un método para determinar el contenido cromosómico X de células ováricas aisladas (ovocitos, células de la granulosa y células del estroma) en tejido de corteza ovárica no injertado de mujeres con aberraciones cromosómicas X. El segundo método está dirigido a evaluar el efecto de las aberraciones cromosómicas en la foliculogénesis mediante la determinación del contenido cromosómico X de las células ováricas de los folículos secundarios y antrales recién formados en el tejido ovárico, de hembras con aberraciones cromosómicas X después de un injerto a largo plazo en ratones inmunocomprometidos. Ambos métodos podrían ser útiles en futuras investigaciones para obtener información sobre el potencial reproductivo de las mujeres con aberraciones cromosómicas X.

Introduction

La infertilidad es un problema de salud del sistema reproductor masculino o femenino, que afecta a aproximadamente 186 millones de personas en edad reproductiva en todo el mundo1. En al menos el 35% de las parejas infértiles, la infertilidad es causada por un trastorno del sistema reproductor femenino2. Hay muchos factores que pueden causar infertilidad femenina, como factores genéticos, anomalías del tracto genital, disfunción endocrina, enfermedades inflamatorias y tratamiento iatrogénico3.

Las anomalías genéticas están presentes en aproximadamente 10% de las hembras infértiles 4,5. De todas las anomalías genéticas, las aberraciones del cromosoma X son la causa más común de disgenesia ovárica2. Varios estudios han reportado que las aberraciones cromosómicas X en mujeres con síndrome de Turner (ST) o síndrome Triple X están asociadas con insuficiencia ovárica prematura debido a una pérdida acelerada de células germinales o alteración de la ovogénesis 6,7,8.

Las aberraciones del cromosoma X se pueden dividir en: 1) aberraciones numéricas, en las que el número de cromosomas X es diferente pero los cromosomas X están intactos; y 2) aberraciones estructurales, en las que el cromosoma X ha ganado o perdido material genético 3,9. Las aberraciones numéricas del cromosoma X son más comunes que las anomalías estructurales y a menudo son causadas por errores espontáneos durante la división celular 3,9. Cuando tal error ocurre durante la meiosis, puede conducir a gametos aneuploides y, en última instancia, a descendencia con aberraciones cromosómicas en todas las células. Cuando surgen defectos cromosómicos en las células somáticas como resultado de errores que ocurren durante la mitosis en las primeras etapas de la ontogénesis, puede conducir al mosaicismo. En estos individuos, tanto las células con contenido cromosómico X normal como las células con aberraciones cromosómicas X están presentes.

En la década de 1980, se desarrolló una técnica citogenética llamada hibridación fluorescente in situ (FISH) para visualizar y localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos en los cromosomas de metafase e interfase10,11. Esta técnica utiliza sondas de ADN marcadas con fluorescencia para unirse a una secuencia específica en el cromosoma, que luego se puede visualizar mediante el uso de un microscopio de fluorescencia.

Hoy en día, el FISH es ampliamente utilizado como herramienta de diagnóstico clínico y es considerado el estándar de oro en la detección de aberraciones cromosómicas10. En el campo de la medicina reproductiva, el análisis FISH en espermatozoides se ha utilizado para obtener información sobre el contenido cromosómico X de los espermatozoides en varones con aberraciones cromosómicas numéricas o estructurales en células somáticas12,13,14. Estos estudios mostraron que los varones con aberraciones cromosómicas tenían más probabilidades de tener una mayor frecuencia de espermatozoides aneuploides presentes en su semen en comparación con los hombres con cariotipos normales12,13,14.

A diferencia de los espermatozoides, se sabe muy poco sobre el contenido cromosómico X de las células ováricas (incluidos los ovocitos, las células granulosa/teca y las células del estroma) en individuos con una aberración cromosómica, así como las posibles consecuencias de la aneuploidía de estas células en su potencial reproductivo. Una razón importante para la escasa información sobre el cariotipo de las células ováricas en comparación con los espermatozoides es el hecho de que las mujeres tienen que someterse a un procedimiento invasivo como una punción del folículo o una cirugía para obtener ovocitos o tejido de la corteza ovárica. Los gametos femeninos son, por lo tanto, difíciles de obtener con fines de investigación.

Actualmente, se está realizando un estudio de intervención observacional en los Países Bajos para explorar la eficacia de la criopreservación del tejido ovárico en mujeres jóvenes con ST15. Un fragmento del tejido de la corteza ovárica de la paciente estaba disponible para identificar el contenido cromosómico X de las células ováricas16,17. Como parte del estudio, se desarrolló un nuevo método basado en FISH de tejido de corteza ovárica disociado para determinar si las aberraciones cromosómicas están presentes en las células ováricas en mujeres portadoras de una aberración cromosómica en células somáticas no ováricas, como linfocitos o células bucales. Además, también se determinó el efecto de la aneuploidía en las células ováricas sobre la foliculogénesis. Con este fin, se modificó un protocolo FISH establecido que permite el análisis de secciones histológicas de tejido de la corteza ovárica después de la foliculogénesis inducida artificialmente durante el xenotrasplante a largo plazo en ratones inmunocomprometidos. En este estudio, presentamos dos métodos basados en FISH para determinar el contenido cromosómico X en células ováricas en tejido de corteza ovárica no injertado e injertado en mujeres con aberraciones cromosómicas X, con el objetivo de mejorar la ciencia básica sobre este tema.

Protocol

El protocolo del estudio TurnerFertility ha sido aprobado por el Comité Central de Investigación con Seres Humanos (NL57738.000.16). En este estudio, se obtuvo el tejido de la corteza ovárica de 93 mujeres con ST. Los materiales que requieren precauciones de seguridad se enumeran en la Tabla 1. Tabla 1: Precauciones de seguridad. Material</st…

Representative Results

FISH en células ováricas aisladas antes del injertoSe utilizó tejido criopreservado de la corteza ovárica de mujeres con TS 45,X/46,XX (paciente A) o 45,X/46,XX/47,XXX (paciente B) para ilustrar los resultados utilizando este protocolo. En el paciente A, el 50% de los linfocitos tenían un cariotipo 45,X y el 50% tenían 46,XX. En el paciente B, el 38% de los linfocitos fueron 45,X, el 28% 46,XX y el 34% 47,XXX. Se utilizaron sondas específicas del centrómero para el cromosoma X (verde) y el cr…

Discussion

El análisis FISH es una técnica bien conocida para detectar aberraciones cromosómicas X en linfocitos o células bucales tanto de hombres como de mujeres10. Varios estudios han descrito FISH en gametos de varones con aberraciones cromosómicas X, pero todavía falta información detallada obtenida por FISH en células ováricas de mujeres con aberraciones cromosómicas X14. Este artículo presenta nuevos métodos basados en FISH para determinar si la aneuploidía está p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef y Milan Intezar por su experiencia y asistencia técnica. Fuentes de financiación: Merck Serono (A16-1395), Goodlife y Ferring.

Materials

Acetic acid Biosolve BV 0001070602BS
Centrifuge 1200 Hettich Universal 4140
Collagenase I Sigma 131470
Coverslip VWR 0631-0146
DAPI Vector H-1200
DNase I Roche 10104159001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline  Lonza BE17-513Q
EDTA Merck 108421
Eosin-Y Sigma 1159350100
Ethanol EMSURE 1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technology 10100147
Fluorescence microscope for sections DM4 B Leica Microsystems 
Fluorescence microscope scope A1 Zeiss AXIO
Fluorescent labeled probes for dissociated cells Abbott Diagnostics CEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluorescent labeled probes for tissue sections Abbott Diagnostics CEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
Formaldehyde Sigma 252549
Glucose Merck 108337
Glue (Fixogum) Leica Microsystems LK071A
Hematoxylin Sigma 1159380025
Hybridization buffer Abott Diagnostics 32-804826/06J67-001
Hybridization Station  Dako S2451
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) Leica Biosystems
Image processing software on paraffine sections  Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunohitochemistry microscope slides Dako K802021-2
L15 Lonza 12-700Q
Liberase DH Roche 05 401 151 001
Light microscope Zeiss West Germany
Magnesium sulphate Merck A335586
Methanol Honeywell 14262-1L
Mounting medium Vectashield, Vector H-1000
Nonidet P40 Sigma 7385-1L
Paraffin Poth Hile 2712.20.10
Pepsin Sigma P7000-25G
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco 11530546
Plastic pipette CooperSurgical 7-72-4075/1
Potassium chloride  Merck 1049361000
Proteinase K Qiagen 19131
Rotation microtome HM 355S Thermo sceintific
Scalpel Dahlhausen 11.000.00.515
Slide for FISH on dissociated cells Thermo scientific J1810AM1JZ
Sodium bicarbonate Sigma 55761-500G
Standard Sodium Citrate (SSC) Fisher Scientific, Invitrogen 10515203
Stereomicroscope IX 70 Olympus
Target Retrieval Solution    Dako GV80511-2
Trypsin Sigma T4799
Tween-20 ThermoFisher 85113
Xylene BOOM 760518191000

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Cite This Article
Nadesapillai, S., van der Velden, J., Braat, D., Fleischer, K., Peek, R. Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (194), e64734, doi:10.3791/64734 (2023).

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