Summary

Изучение Х-хромосомных аберраций в клетках яичников с использованием флуоресцентной гибридизации in situ

Published: April 07, 2023
doi:

Summary

В данной статье представлены два метода, основанные на флуоресцентной гибридизации in situ , для определения содержания Х-хромосомы клеток яичников в нетрансплантированной и пересаженной ткани коры яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями.

Abstract

Миллионы людей во всем мире сталкиваются с проблемами, связанными с рождаемостью. Снижение фертильности или даже бесплодие может быть вызвано множеством различных причин, включая генетические нарушения, из которых хромосомные аномалии являются наиболее распространенными. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является хорошо известным и часто используемым методом обнаружения хромосомных аберраций у людей. FISH в основном используется для анализа хромосомных аномалий в сперматозоидах самцов с числовыми или структурными хромосомными аберрациями. Кроме того, этот метод также часто применяется у женщин для обнаружения аберраций Х-хромосомы, которые, как известно, вызывают дисгенезию яичников. Однако информация о содержании Х-хромосомы клеток яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями в лимфоцитах и/или буккальных клетках по-прежнему отсутствует.

Целью данного исследования является продвижение фундаментальных исследований аберраций Х-хромосомной кислоты у женщин, путем представления двух методов, основанных на FISH, для идентификации содержания Х-хромосом в клетках яичников. Во-первых, описан способ определения содержания Х-хромосомы изолированных клеток яичников (ооцитов, гранулезных клеток и стромальных клеток) в нетрансплантированной ткани коры яичников у женщин с Х-хромосомными аберрациями. Второй метод направлен на оценку влияния хромосомных аберраций на фолликулогенез путем определения Х-хромосомного содержания клеток яичников новообразованных вторичных и антральных фолликулов в ткани яичника от самок с Х-хромосомными аберрациями после длительной трансплантации в мышей с ослабленным иммунитетом. Оба метода могут быть полезны в будущих исследованиях, чтобы получить представление о репродуктивном потенциале женщин с аберрациями Х-хромосомы.

Introduction

Бесплодие – это проблема мужской или женской репродуктивной системы, затрагивающая примерно 186 миллионов человек репродуктивного возраставо всем мире 1. Не менее чем у 35% бесплодных пар бесплодие вызвано расстройством женской репродуктивнойсистемы2. Существует множество факторов, которые могут вызвать женское бесплодие, такие как генетические факторы, аномалии половых путей, эндокринная дисфункция, воспалительные заболевания и ятрогенное лечение3.

Генетические аномалии присутствуют примерно у 10% бесплодных женщин 4,5. Из всех генетических аномалий аберрации Х-хромосомы являются наиболее частой причиной дисгенезии яичников2. В нескольких исследованиях сообщалось, что аберрации Х-хромосомы у женщин с синдромом Тернера (ТС) или синдромом тройной Х-хромомы связаны с преждевременной недостаточностью яичников из-за ускоренной потери половых клеток или нарушения оогенеза 6,7,8.

Аберрации Х-хромосомы можно разделить на: 1) числовые аберрации, при которых число Х-хромосом разное, но Х-хромосомы не повреждены; и 2) структурные аберрации, при которых Х-хромосома приобрела или потеряла генетический материал 3,9. Числовые аберрации Х-хромосомы встречаются чаще, чем структурные аномалии, и часто вызваны спонтанными ошибками при деленииклеток 3,9. Когда такая ошибка возникает во время мейоза, это может привести к анеуплоидным гаметам и, в конечном итоге, к потомству с хромосомными аберрациями во всех клетках. Когда хромосомные дефекты возникают в соматических клетках в результате ошибок, возникающих при митозе на ранних стадиях онтогенеза, это может привести к мозаицизму. У этих людей присутствуют как клетки с нормальным содержанием Х-хромосомы, так и клетки с аберрациями Х-хромосомы.

В 1980-х годах был разработан цитогенетический метод, называемый флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH), для визуализации и определения местоположения специфических последовательностей нуклеиновых кислот на метафазных и межфазных хромосомах10,11. Этот метод использует флуоресцентные меченные ДНК-зонды для связывания с определенной последовательностью в хромосоме, которую затем можно визуализировать с помощью флуоресцентного микроскопа.

В настоящее время FISH широко используется в качестве клинического диагностического инструмента и считается золотым стандартом в выявлении хромосомных аберраций10. В области репродуктивной медицины анализ спермы FISH был использован для получения представления о содержании Х-хромосом сперматозоидов у мужчин с числовыми или структурными хромосомными аберрациями в соматических клетках12,13,14. Эти исследования показали, что мужчины с хромосомными аберрациями с большей вероятностью имели более высокую частоту анеуплоидных сперматозоидов, присутствующих в сперме, по сравнению с мужчинами с нормальными кариотипами12,13,14.

В отличие от сперматозоидов, очень мало известно о содержании Х-хромосомы клеток яичников (включая ооциты, гранулезные/тека-клетки и стромальные клетки) у людей с хромосомной аберрацией, а также о возможных последствиях анеуплоидии этих клеток на их репродуктивный потенциал. Важной причиной скудности информации о кариотипе клеток яичников по сравнению со сперматозоидами является тот факт, что женщинам приходится проходить инвазивную процедуру, такую как пункция фолликулов или операция по получению ооцитов или ткани коры яичников. Поэтому женские гаметы трудно получить в исследовательских целях.

В настоящее время в Нидерландах проводится обсервационное интервенционное исследование для изучения эффективности криоконсервации ткани яичников у молодых женщин с TS15. Один фрагмент ткани коры яичников пациентки был доступен для идентификации Х-хромосомного содержимого клеток яичников16,17. В рамках исследования был разработан новый метод, основанный на FISH диссоциированной ткани коры яичников, чтобы определить, присутствуют ли хромосомные аберрации в клетках яичников у женщин, несущих хромосомную аберрацию в неяичниковых соматических клетках, таких как лимфоциты или буккальные клетки. Кроме того, было определено влияние анеуплоидии в клетках яичников на фолликулогенез. С этой целью был модифицирован установленный протокол FISH, который позволяет анализировать гистологические срезы ткани коры яичников после искусственно индуцированного фолликулогенеза во время длительной ксенотрансплантации у мышей с ослабленным иммунитетом. В этом исследовании мы представляем два метода, основанных на FISH, для определения содержания Х-хромосомы в клетках яичников в нетрансплантированной и пересаженной ткани коры яичников у женщин с аберрациями Х-хромосомы, с целью улучшения фундаментальной науки по этой теме.

Protocol

Протокол исследования TurnerFertility был одобрен Центральным комитетом по исследованиям с участием людей (NL57738.000.16). В этом исследовании была получена ткань коры яичников 93 женщин с ТС. Материалы, требующие мер предосторожности, перечислены в таблице 1. Таблица 1: М?…

Representative Results

FISH на изолированных клетках яичников перед прививкойКриоконсервированная ткань коры яичников у женщин с 45,X/46,XX (пациентка А) или 45,X/46,XX/47,XXX (пациентка Б) TS была использована для иллюстрации результатов с использованием этого протокола. У пациента А 50% лимфоцитов имели кариоти…

Discussion

Анализ FISH является хорошо известным методом обнаружения Х-хромосомных аберраций в лимфоцитах или буккальных клетках как мужчин, так и женщин10. В нескольких исследованиях была описана FISH на гаметах мужчин с Х-хромосомными аберрациями, но подробная информация, полученная FIS…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы выражают признательность Марьо ван Бракелю, Доминику Смитсу, Гийому ван де Занде, Патрисии ван Клиф и Милану Интезару за их опыт и техническую помощь. Источники финансирования: Merck Serono (A16-1395), Goodlife и Ferring.

Materials

Acetic acid Biosolve BV 0001070602BS
Centrifuge 1200 Hettich Universal 4140
Collagenase I Sigma 131470
Coverslip VWR 0631-0146
DAPI Vector H-1200
DNase I Roche 10104159001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline  Lonza BE17-513Q
EDTA Merck 108421
Eosin-Y Sigma 1159350100
Ethanol EMSURE 1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technology 10100147
Fluorescence microscope for sections DM4 B Leica Microsystems 
Fluorescence microscope scope A1 Zeiss AXIO
Fluorescent labeled probes for dissociated cells Abbott Diagnostics CEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluorescent labeled probes for tissue sections Abbott Diagnostics CEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
Formaldehyde Sigma 252549
Glucose Merck 108337
Glue (Fixogum) Leica Microsystems LK071A
Hematoxylin Sigma 1159380025
Hybridization buffer Abott Diagnostics 32-804826/06J67-001
Hybridization Station  Dako S2451
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) Leica Biosystems
Image processing software on paraffine sections  Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunohitochemistry microscope slides Dako K802021-2
L15 Lonza 12-700Q
Liberase DH Roche 05 401 151 001
Light microscope Zeiss West Germany
Magnesium sulphate Merck A335586
Methanol Honeywell 14262-1L
Mounting medium Vectashield, Vector H-1000
Nonidet P40 Sigma 7385-1L
Paraffin Poth Hile 2712.20.10
Pepsin Sigma P7000-25G
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco 11530546
Plastic pipette CooperSurgical 7-72-4075/1
Potassium chloride  Merck 1049361000
Proteinase K Qiagen 19131
Rotation microtome HM 355S Thermo sceintific
Scalpel Dahlhausen 11.000.00.515
Slide for FISH on dissociated cells Thermo scientific J1810AM1JZ
Sodium bicarbonate Sigma 55761-500G
Standard Sodium Citrate (SSC) Fisher Scientific, Invitrogen 10515203
Stereomicroscope IX 70 Olympus
Target Retrieval Solution    Dako GV80511-2
Trypsin Sigma T4799
Tween-20 ThermoFisher 85113
Xylene BOOM 760518191000

References

  1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
  3. Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
  4. Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
  5. Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
  6. Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
  7. Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
  8. Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
  9. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
  10. Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
  11. Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
  12. Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
  13. Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
  14. Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
  15. Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
  16. Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner’s syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
  17. Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
  18. Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
  19. Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
  20. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
  21. Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
  22. Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).

Play Video

Cite This Article
Nadesapillai, S., van der Velden, J., Braat, D., Fleischer, K., Peek, R. Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (194), e64734, doi:10.3791/64734 (2023).

View Video