חקר סטיות X כרומוזומליות בתאי שחלה באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו
Summary
מאמר זה מציג שתי שיטות המבוססות על הכלאה פלואורסצנטית באתרו כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה ברקמת קליפת השחלות הלא מושתלת ומושתלת מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X.
Abstract
מיליוני אנשים ברחבי העולם מתמודדים עם נושאים הקשורים לפוריות. ירידה בפוריות, או אפילו אי פוריות, עשויה לנבוע מסיבות רבות ושונות, כולל הפרעות גנטיות, אשר הפרעות כרומוזומליות הן הנפוצות ביותר. הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) היא שיטה ידועה ונפוצה לאיתור סטיות כרומוזומליות בבני אדם. FISH משמש בעיקר לניתוח הפרעות כרומוזומליות בזרעונים של זכרים עם סטיות כרומוזומליות מספריות או מבניות. יתר על כן, טכניקה זו מיושמת לעתים קרובות גם אצל נשים כדי לזהות סטיות כרומוזומליות X הידועות כגורמות לדיסגנזה שחלתית. עם זאת, מידע על התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X בלימפוציטים ו / או תאים buccal עדיין חסר.
מטרת מחקר זה היא לקדם מחקר בסיסי לגבי סטיות כרומוזומליות X בנקבות, על ידי הצגת שתי שיטות המבוססות על FISH לזיהוי התוכן הכרומוזומלי X של תאי השחלה. ראשית, מתוארת שיטה לקביעת התוכן הכרומוזומלי X של תאי שחלה מבודדים (ביציות, תאי גרנולוזה ותאי סטרומה) ברקמת קליפת השחלות שלא הושתלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X. השיטה השנייה מכוונת להערכת ההשפעה של סטיות כרומוזומליות על פוליקולוגנזה על ידי קביעת התוכן הכרומוזומלי X של תאי שחלה של זקיקים משניים ואנטרליים שזה עתה נוצרו ברקמת השחלה, מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X לאחר השתלה ארוכת טווח בעכברים מדוכאי חיסון. שתי השיטות יכולות להיות מועילות במחקר עתידי כדי לקבל תובנה לגבי פוטנציאל הרבייה של נקבות עם סטיות כרומוזומליות X.
Introduction
אי פוריות היא בעיה בריאותית של מערכת הרבייה הגברית או הנשית, המשפיעה על כ -186 מיליון אנשים בגיל הפוריות ברחבי העולם1. לפחות 35% מהזוגות העקרים, אי פוריות נגרמת על ידי הפרעה של מערכת הרבייה הנשית2. ישנם גורמים רבים שיכולים לגרום לאי פוריות נשית, כגון גורמים גנטיים, הפרעות בדרכי המין, תפקוד אנדוקריני, מחלות דלקתיות וטיפול יאטרוגני3.
הפרעות גנטיות קיימות בכ -10% מהנקבות העקרים 4,5. מכל ההפרעות הגנטיות, סטיות כרומוזום X הן הגורם השכיח ביותר לדיסגנזה שחלתית2. מספר מחקרים דיווחו כי סטיות כרומוזומליות X אצל נשים עם תסמונת טרנר (TS) או תסמונת X משולש קשורות לאי ספיקת שחלות מוקדמת עקב אובדן מואץ של תאי נבט או פגיעה באוגנזה 6,7,8.
ניתן לחלק סטיות של כרומוזום X ל: 1) סטיות מספריות, שבהן מספר כרומוזומי X שונה אך כרומוזומי X שלמים; ו-2) סטיות מבניות, שבהן כרומוזום X צבר או איבד חומר גנטי 3,9. סטיות מספריות של כרומוזום X שכיחות יותר מהפרעות מבניות ונגרמות לעיתים קרובות על ידי טעויות ספונטניות במהלך חלוקת התא 3,9. כאשר שגיאה כזו מתרחשת במהלך מיוזה, היא עלולה להוביל לגמטות אנאופלואידיות ובסופו של דבר לצאצאים עם סטיות כרומוזומליות בכל התאים. כאשר פגמים כרומוזומים מתעוררים בתאים סומטיים כתוצאה מטעויות המתרחשות במהלך מיטוזה בשלבים המוקדמים של האונטוגנזה, הדבר עלול להוביל למוזאיקה. אצל אנשים אלה, שני תאים עם תוכן כרומוזומלי X נורמלי ותאים עם סטיות כרומוזומליות X נמצאים.
בשנות ה-80 של המאה ה-20 פותחה שיטה ציטוגנטית הנקראת הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לדמיין ולאתר רצפים ספציפיים של חומצות גרעין על כרומוזומים מטא-פאזיים ובין-פאזיים10,11. טכניקה זו משתמשת בבדיקות DNA עם תווית פלואורסצנטית כדי להיקשר לרצף מסוים בכרומוזום, אשר לאחר מכן ניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
כיום, FISH נמצא בשימוש נרחב ככלי אבחון קליני ונחשב לתקן הזהב באיתור סטיות כרומוזומליות10. בתחום רפואת הרבייה, ניתוח FISH על זרע שימש כדי לקבל תובנה לגבי התוכן כרומוזומלי X של זרעונים אצל גברים עם סטיות כרומוזומליות מספריות או מבניות בתאים סומטיים12,13,14. מחקרים אלה הראו כי גברים עם סטיות כרומוזומליות היו בסיכון גבוה יותר להיות בעלי תדירות גבוהה יותר של זרעונים אנאופלואידים נוכחים בזרע שלהם בהשוואה לזכרים עם קריוטיפים נורמליים12,13,14.
בניגוד לזרעונים, מעט מאוד ידוע על התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה (כולל ביציות, תאי גרנולוסה/תקה ותאי סטרומה) אצל אנשים עם סטייה כרומוזומלית, כמו גם על ההשלכות האפשריות של אנופלואידיות של תאים אלה על פוטנציאל הרבייה שלהם. סיבה חשובה למידע המועט על הקריוטיפ של תאי השחלות בהשוואה לזרעונים היא העובדה שנשים צריכות לעבור הליך פולשני כגון ניקוב זקיק או ניתוח להשגת ביציות או רקמת קליפת השחלות. לכן, קשה להשיג גמטות נקביות למטרות מחקר.
כיום, מחקר התערבות תצפית מבוצע בהולנד כדי לחקור את היעילות של שימור בהקפאה של רקמת השחלות בנשים צעירות עם TS15. מקטע אחד של רקמת קליפת השחלות של המטופלת היה זמין לזיהוי התוכן כרומוזומלי X של תאי השחלה16,17. במסגרת המחקר פותחה שיטה חדשנית המבוססת על FISH של רקמת קליפת השחלות המנותקת כדי לקבוע אם קיימות סטיות כרומוזומליות בתאי שחלה בנקבות הנושאות סטייה כרומוזומלית בתאים סומטיים שאינם שחלתיים, כגון לימפוציטים או תאים בוקאליים. בנוסף, נקבעה גם השפעת האנאופלואידיות בתאי השחלה על פוליקולוגנזה. לשם כך שונה פרוטוקול FISH מבוסס המאפשר ניתוח של מקטעים היסטולוגיים ברקמת קליפת השחלות לאחר פוליקולוגנזה מלאכותית במהלך השתלת קסנו ארוכת טווח בעכברים מדוכאי חיסון. במחקר זה אנו מציגים שתי שיטות המבוססות על FISH לקביעת התוכן הכרומוזומלי X בתאי שחלה ברקמת קליפת השחלות הלא מושתלת ומושתלת בנקבות עם סטיות כרומוזומליות X, במטרה לשפר את המדע הבסיסי בנושא זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח FISH הוא טכניקה ידועה לזיהוי סטיות כרומוזומליות X בלימפוציטים או תאי buccal של זכרים ונקבותכאחד 10. מספר מחקרים תיארו FISH על גמטות של זכרים עם סטיות כרומוזומליות X, אך מידע מפורט שהתקבל על ידי FISH על תאי שחלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X עדיין חסר14. מאמר זה מציג שיט?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למרג’ו ואן בראקל, דומיניק סמיטס, גיום ואן דה זנדה, פטרישיה ואן קליף ומילאן אינטזאר על מומחיותם ועזרתם הטכנית. מקורות מימון: Merck Serono (A16-1395), Goodlife ו-Ferring.
Materials
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
- Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
- Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
- Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
- Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
- Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
- Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
- Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
- Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
- Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
- Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
- Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
- Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner’s syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
- Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
- Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
- Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
- Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
- Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).
