استكشاف انحرافات كروموسومات X في خلايا المبيض باستخدام التهجين الفلوري في الموقع
Summary
تقدم هذه المقالة طريقتين تعتمدان على التهجين الفلوري في الموقع لتحديد محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض في أنسجة قشرة المبيض غير المطعمة والمطعمة من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X.
Abstract
يتعامل ملايين الأشخاص في جميع أنحاء العالم مع القضايا المتعلقة بالخصوبة. قد يكون انخفاض الخصوبة ، أو حتى العقم ، بسبب العديد من الأسباب المختلفة ، بما في ذلك الاضطرابات الوراثية ، والتي تعد تشوهات الكروموسومات هي الأكثر شيوعا. التهجين الفلوري في الموقع (FISH) هو طريقة معروفة ومستخدمة بشكل متكرر للكشف عن انحرافات الكروموسومات في البشر. يستخدم FISH بشكل رئيسي لتحليل تشوهات الكروموسومات في الحيوانات المنوية للذكور مع انحرافات الكروموسومات العددية أو الهيكلية. علاوة على ذلك ، يتم تطبيق هذه التقنية بشكل متكرر على الإناث للكشف عن انحرافات كروموسومات X المعروفة بأنها تسبب خلل تكوين المبيض. ومع ذلك ، لا تزال المعلومات حول محتوى الكروموسومات X لخلايا المبيض من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومية X في الخلايا الليمفاوية و / أو الخلايا الشدقية غير متوفرة.
الهدف من هذه الدراسة هو تطوير الأبحاث الأساسية المتعلقة بانحرافات كروموسومات X في الإناث ، من خلال تقديم طريقتين تعتمدان على FISH لتحديد محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض. أولا ، يتم وصف طريقة لتحديد محتوى الكروموسومات X لخلايا المبيض المعزولة (البويضات والخلايا الحبيبية والخلايا اللحمية) في أنسجة قشرة المبيض غير المطعمة من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X. الطريقة الثانية موجهة إلى تقييم تأثير انحرافات الكروموسومات على تكوين الجريبات من خلال تحديد محتوى الكروموسومات X لخلايا المبيض من الجريبات الثانوية والغارية المشكلة حديثا في أنسجة المبيض ، من الإناث المصابات بانحرافات كروموسومية X بعد التطعيم طويل الأمد في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. يمكن أن تكون كلتا الطريقتين مفيدتين في الأبحاث المستقبلية لاكتساب نظرة ثاقبة على القدرة الإنجابية للإناث المصابات بانحرافات كروموسومات X.
Introduction
العقم هو مشكلة صحية في الجهاز التناسلي الذكري أو الأنثوي ، ويؤثر على ما يقرب من 186 مليون فرد في سن الإنجابفي جميع أنحاء العالم 1. في ما لا يقل عن 35 ٪ من الأزواج المصابين بالعقم ، يحدث العقم بسبب اضطراب في الجهاز التناسلي للأنثى2. هناك العديد من العوامل التي يمكن أن تسبب العقم عند النساء ، مثل العوامل الوراثية ، وتشوهات الجهاز التناسلي ، وضعف الغدد الصماء ، والأمراض الالتهابية ، والعلاج علاجي المنشأ3.
توجد تشوهات وراثية في حوالي 10٪ من الإناث المصابات بالعقم 4,5. من بين جميع التشوهات الوراثية ، تعد انحرافات كروموسوم X السبب الأكثر شيوعا لخلل تكوين المبيض2. أفادت العديد من الدراسات أن انحرافات كروموسومات X لدى الإناث المصابات بمتلازمة تيرنر (TS) أو متلازمة ثلاثية إكس ترتبط بفشل المبيض المبكر بسبب الفقدان المتسارع للخلايا الجرثومية أو ضعف تكوين البويضة6،7،8.
يمكن تقسيم انحرافات كروموسوم X إلى: 1) انحرافات عددية ، حيث يختلف عدد الكروموسومات X ولكن الكروموسومات X سليمة. و 2) الانحرافات الهيكلية ، حيث اكتسب كروموسوم X أو فقد المادة الوراثية 3,9. الانحرافات العددية للكروموسوم X أكثر شيوعا من التشوهات الهيكلية وغالبا ما تكون ناجمة عن أخطاء تلقائية أثناء انقسام الخلايا 3,9. عندما يحدث مثل هذا الخطأ أثناء الانقسام الميوزي، فقد يؤدي إلى نشوء جاميتات اختلال الصيغة الصبغية، وفي النهاية إلى نسل به انحرافات كروموسومية في جميع الخلايا. عندما تنشأ عيوب الكروموسوم في الخلايا الجسدية نتيجة للأخطاء التي تحدث أثناء الانقسام في المراحل المبكرة من التولد ، فقد يؤدي ذلك إلى الفسيفساء. في هؤلاء الأفراد ، توجد كل من الخلايا ذات المحتوى الكروموسومي X الطبيعي والخلايا ذات الانحرافات الكروموسومية X.
في ثمانينيات القرن العشرين ، تم تطوير تقنية وراثية خلوية تسمى التهجين الفلوري في الموقع (FISH) لتصور وتحديد تسلسلات الحمض النووي المحددة على الطور الطوري والطور البينيالكروموسومات 10،11. تستخدم هذه التقنية مجسات الحمض النووي الموسومة بالفلورسنت للارتباط بتسلسل معين في الكروموسوم ، والذي يمكن تصوره بعد ذلك باستخدام مجهر مضان.
في الوقت الحاضر ، يستخدم FISH على نطاق واسع كأداة تشخيصية سريرية ويعتبر المعيار الذهبي في الكشف عن انحرافات الكروموسومات10. في مجال الطب التناسلي ، تم استخدام تحليل FISH على الحيوانات المنوية لاكتساب نظرة ثاقبة على محتوى الكروموسومات X للحيوانات المنوية في الذكور مع انحرافات كروموسومية عددية أو هيكلية في الخلايا الجسدية12،13،14. أظهرت هذه الدراسات أن الذكور الذين يعانون من انحرافات كروموسومية كانوا أكثر عرضة لتكرار أعلى من الحيوانات المنوية اختلال الصيغة الصبغية الموجودة في السائل المنوي مقارنة بالذكور الذين لديهم أنماط نووية طبيعية12،13،14.
على عكس الحيوانات المنوية ، لا يعرف سوى القليل جدا عن المحتوى الكروموسومي X لخلايا المبيض (بما في ذلك البويضات والخلايا الحبيبية / الثيكا والخلايا اللحمية) لدى الأفراد الذين يعانون من انحراف كروموسومي ، وكذلك العواقب المحتملة لاختلال الصيغة الصبغية لهذه الخلايا على إمكاناتها الإنجابية. أحد الأسباب المهمة لندرة المعلومات حول النمط النووي لخلايا المبيض مقارنة بالحيوانات المنوية هو حقيقة أن النساء يجب أن يخضعن لإجراء جراحي مثل ثقب الجريب أو الجراحة للحصول على البويضات أو أنسجة قشرة المبيض. لذلك ، يصعب الحصول على الأمشاج الأنثوية لأغراض البحث.
حاليا ، يتم إجراء دراسة تدخل قائمة على الملاحظة في هولندا لاستكشاف فعالية حفظ أنسجة المبيض بالتبريد لدى الإناث الشابات المصابات ب TS15. كان جزء واحد من نسيج قشرة المبيض للمريض متاحا لتحديد محتوى كروموسومات X لخلايا المبيض16,17. كجزء من الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة تعتمد على FISH لأنسجة قشرة المبيض المنفصلة لتحديد ما إذا كانت الانحرافات الكروموسومية موجودة في خلايا المبيض في الإناث اللائي يحملن انحرافا كروموسوميا في الخلايا الجسدية غير المبيضية ، مثل الخلايا الليمفاوية أو الخلايا الشدقية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد تأثير اختلال الصيغة الصبغية في خلايا المبيض على تكوين الجريبات أيضا. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تعديل بروتوكول FISH المعمول به والذي يمكن من تحليل الأقسام النسيجية لأنسجة قشرة المبيض بعد تكوين الجريبات المستحث بشكل مصطنع أثناء زراعة الأجانب على المدى الطويل في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. في هذه الدراسة ، نقدم طريقتين تعتمدان على FISH لتحديد محتوى الكروموسومات X في خلايا المبيض في أنسجة قشرة المبيض غير المطعمة والمطعمة في الإناث المصابات بانحرافات كروموسوم X ، بهدف تحسين العلوم الأساسية حول هذا الموضوع.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليل FISH هو تقنية معروفة للكشف عن انحرافات كروموسومات X في الخلايا الليمفاوية أو الخلايا الشدقية لكل من الذكور والإناث10. وصفت العديد من الدراسات FISH على الأمشاج للذكور الذين يعانون من انحرافات كروموسومية X ، ولكن المعلومات التفصيلية التي حصلت عليها FISH على خلايا المبيض من الإن?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وينوه المؤلفون بمارجو فان براكيل ودومينيك سميتس وغيوم فان دي زاندي وباتريشيا فان كليف وميلان إنتزار على خبرتهم ومساعدتهم التقنية. مصادر التمويل: ميرك سيرونو (A16-1395) ، جودلايف ، وفيرينج.
Materials
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
- Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
- Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
- Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
- Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
- Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
- Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
- Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
- Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
- Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
- Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
- Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
- Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner’s syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
- Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
- Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
- Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
- Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
- Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).
