Microdissecção e Visualização por Microscopia Eletrônica de Varredura de Montagem Completa do Plexo Coroide de Camundongos

Barreiras apertadas separam o sistema nervoso central (SNC) da periferia, incluindo a barreira hematoencefálica (BHE) e a barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (LCR). Essas barreiras protegem o SNC contra insultos externos e garantem um microambiente equilibrado e controlado ^1,2,3. Embora a BHE tenha sido extensivamente estudada ao longo do tempo, a barreira sangue-LCR localizada no plexo coroide (CP) só ganhou crescente interesse de pesquisa durante a última década. Esta última barreira pode ser encontrada nos quatro ventrículos cerebrais (Figura 1A, B) e é caracterizada por uma única camada de células epiteliais do plexo coroide (ECP) ao redor de um estroma central, capilares vazados, fibroblastos e uma população de células linfoides e mieloides (Figura 1C)^4,5,6. As células CPE estão firmemente interconectadas por tight junctions, evitando assim o vazamento dos capilares sanguíneos fenestrados subjacentes para o LCR e o cérebro. Além disso, o transporte através das células CPE é regulado por uma série de sistemas de transporte para dentro e para fora que gerenciam o influxo de compostos benéficos (por exemplo, nutrientes e hormônios) do sangue para o LCR e o efluxo de moléculas nocivas (por exemplo, resíduos metabólicos, excesso de neurotransmissores) na outra direção ^1,6. Para poderem exercer sua função de transporte ativo, as células CPE contêm numerosas mitocôndrias em seu citoplasma⁷. Além disso, o PC é a principal fonte de LCR e atua como gatekeeper do cérebro pela presença de células inflamatórias^residentes1. Devido à sua localização única entre o sangue e o cérebro, o PC também está perfeitamente posicionado para realizar vigilância imunológica⁸.

Figura 1: Visão geral esquemática da localização e composição do plexo coroide (PC). (A,B) O tecido CP é encontrado nos dois ventrículos laterais, o terceiro e o quarto ventrículos de (A) cérebro humano e (B) de camundongo. (C) O tecido do PC consiste de uma única camada de células do epitélio cuboidal do CP (EPC) firmemente conectadas ao redor de capilares fenestrados, tecido conjuntivo frouxo e células linfoides e mieloides, e forma a barreira hemato-liquórica (adaptada e modificada da referência²³). Figura criada com Biorender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na última década, evidências crescentes, incluindo vários relatos de nosso grupo de pesquisa, têm revelado que a PC desempenha um papel central na saúde e^na doença9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Por exemplo, sabe-se que a barreira sangue-LCR do envelhecimento apresenta alterações morfológicas, entre outras, nos núcleos, microvilosidades e membrana basal ^1,19. Além disso, no contexto da doença de Alzheimer, a integridade global da barreira está comprometida e todas essas mudanças relacionadas à idade parecem ser ainda mais pronunciadas ^1,8,20. Além das alterações morfológicas, o transcriptoma, proteoma e secretoma da PC são alterados durante a doença ^12,21,22,23. Assim, o conhecimento avançado da PC é essencial para melhor compreender seu papel nas doenças neurológicas e potencialmente desenvolver novas estratégias terapêuticas.

Um método eficiente para a microdissecção precisa do PC para fora dos ventrículos cerebrais é o primeiro passo inestimável para permitir a investigação adequada desta minúscula estrutura cerebral. Devido à sua natureza altamente vascularizada (Figura 2B), o CP flutuando dentro das cavidades ventriculares do encéfalo pode ser identificado por meio de um microscópio binocular. No entanto, a perfusão transcárdica é frequentemente necessária para análise a jusante, dificultando a identificação e o isolamento adequados do tecido do PC (Figura 2C). Se as etapas adicionais de processamento permitirem (por exemplo, no caso de análise de RNA e proteínas), o CP pode ser visualizado via perfusão transcárdica com azul de bromofenol (Figura 2A). Várias publicações já descrevem o isolamento do PC do cérebro de ratos²⁴ e filhotes de camundongos²⁵. Aqui, uma técnica de isolamento por microdissecção é descrita para isolar o PC de camundongos adultos. É importante ressaltar que essa técnica de isolamento preserva a viabilidade, a função e a estrutura das células dentro do PC. O isolamento do CP flutuando no quarto e nos ventrículos laterais é descrito aqui. Em suma, os camundongos são anestesiados terminalmente e, se necessário, perfundidos transcardialmente. No entanto, deve-se notar que a perfusão pode danificar a estrutura das células dentro do PC. Consequentemente, se a amostra for analisada usando microscopia eletrônica de transmissão (MET), microscopia eletrônica de varredura de face serial block (SBF-SEM) ou MEV por feixe de íons focalizado (MEV-FIB), a perfusão não deve ser realizada. Em seguida, todo o cérebro é isolado, e fórceps são usados para hemissectar sagitalmente o cérebro. A partir daí, os CPs que flutuam nos ventrículos laterais podem ser identificados e dissecados, enquanto os CP do quarto ventrículo podem ser isolados do lado cerebelar do cérebro.

Figura 2: Visualização do plexo coroide (CP) do quarto e (D-F) ventrículo lateral (CP) após (A,D) perfusão com azul de bromofenol, (B,E) sem perfusão e (C,F) perfusão com PBS/heparina. As imagens são obtidas com estereomicroscópio (aumento de 8x-32x). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma vez que o PC é adequadamente dissecado para fora dos ventrículos cerebrais, todo um repertório de técnicas pode ser aplicado para obter maior compreensão sobre a função dessa estrutura. Por exemplo, citometria de fluxo ou sequenciamento de RNA de célula única podem ser realizados para quantificar e analisar fenotipicamente as células inflamatórias infiltrantes sob determinadas condições de doença^26,27. Além da composição celular, a composição molecular do CP pode ser analisada para avaliar a presença de citocinas e quimiocinas via ensaio imunoenzimático (ELISA), immunoblot, ou através da análise simultânea de múltiplas citocinas utilizando o arranjo de esferas de citocinas²⁸. Além disso, análises de transcriptoma, vascular, histologia de células imunes e secretoma podem ser realizadas nos explantes de CP^{microdissecados29}. Aqui, a microscopia eletrônica de varredura (MEV) em CP de montagem inteira é usada para obter uma visão geral da estrutura do CP. O MEV usa um feixe de elétrons focalizados para varrer a superfície e criar uma imagem da topografia e composição da superfície. Como o comprimento de onda dos elétrons é muito menor do que o da luz, a resolução do MEV está na faixa nanométrica e é superior à de um microscópio de luz. Consequentemente, estudos morfológicos em nível subcelular podem ser realizados via MEV. Resumidamente, o CP dissecado é imediatamente transferido para um fixador contendo glutaraldeído para uma fixação noturna, seguida de osmicação e coloração com acetato de uranila. As amostras são então tratadas com coloração de aspartato de chumbo, desidratadas e, finalmente, incluídas para aquisição de imagens.

Assim, este protocolo facilita o isolamento eficiente do PC dos ventrículos cerebrais de camundongos, o que pode ser posteriormente analisado usando uma variedade de técnicas a jusante para investigar sua estrutura e função.