만능줄기세포(Pluripotent Stem Cells)에서 인간 혈관 오가노이드(Human Blood Vessel Organoids)의 생성

본원에서 수행된 모든 실험은 상업적으로 입수가능한 H9 인간 iPSC 라인을 사용하였다. 일반적인 상업적으로 및 비상업적으로 이용 가능한 인간 만능 줄기 세포주(즉, H9, NC8)도 이 프로토콜을 사용하여 인간 혈관 오가노이드의 생성에 대해 테스트되고 효과적인 것으로 입증되었습니다. 자세한 내용은 이전에 발표된 보고서 8,10을 참조하십시오. 1. 인간 혈관 오가노이드 생성을 위한 배지 및 시약 제형 집계 매체를 준비합니다.녹아웃 DMEM/F12 40mL(인간 ESC 및 iPSC 성장에 최적화된 L-글루타민 또는 HEPES 완충액이 없는 저삼투압 배지), 녹아웃 혈청 대체물(KOSR) 10mL, 0.85% NaCl 중 200mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 0.5mL, 비필수 아미노산(NEAA) 0.5mL, 베타-메르캅토에탄올 35μL(BME, 멸균 PBS 10mL에 2-메르캅토에탄올 100μL), 및 Y-27632 (1:200에서 Rho-관련된, 코일 코일 함유 단백질 키나아제[ROCK]14 [10 mM]의 세포-투과성 및 선택적 억제제) ( 재료 표 참조). N2B27(N2 및 B27 보충 염기성 배지)을 준비합니다.DMEM/F12 25mL, 신경기저 배지 25mL, B27 보충제 1mL, N2 보충제 0.5mL, 0.85% NaCl 중 200mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 250μL, 베타메르캅토에탄올 35μL를 혼합합니다( 재료 표 참조). 중배엽 유도 배지를 준비합니다.N2B27 배지에 ChiR(12μM, 중배엽 유도를 자극하는 GSK3a/b 억제제) 및 BMP-4(30ng/mL, 중배엽 계통을 유도하는 MSX2 활성제)를 보충합니다.참고: 스톡(ChiR): 10mM(1:833 또는 1.2μL/mL N2B27 사용). 스톡 (BMP-4) : 100 μg / mL (1 : 3333 또는 0.3 μL / mL N2B27 사용) ( 재료 표 참조). 혈관 유도 배지를 준비하십시오.N2B27 배지에 VEGFA(100ng/mL) 및 포스콜린(2μM)을 보충합니다( 재료 표 참조). 세포외 기질(ECM)을 준비합니다.12웰 플레이트의 웰 1개에 ECM 1mL를 사용합니다(30-50개의 응집체 매립용). 각 웰에 사용된 ECM 용액 1mL 중 0.5mL를 사용하여 ECM 기초 역할을 할 하단 층 “층 1″을 만들고 최상층 “층 2″에 0.5mL와 응집체를 더합니다. 이 접근법을 사용하면 ECM 현탁액을 통해 인간 혈관 네트워크가 모든 방향으로 싹을 틔울 수 있는 충분한 공간과 지지를 제공합니다.참고: 전체적으로 ECM 1mL에는 정제된 소 콜라겐 유형 I 500μL, Engelbreth-Holm-Swarm 마우스 육종 세포에서 분비되는 가용화된 기저막 기질 250μL( 재료 표 참조) 및 염기성 기질 용액 250μL(단계 1.5.2). 신선하게 준비하고 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 보관하십시오. 4개의 12-웰 플레이트(48웰)에 대한 염기성 매트릭스 용액을 제조하기 위해, 5.627 mL의 0.1 N NaOH, 2.498 mL의 10x DMEM, 473 μL의 HEPES, 368 μL의 7.5% 중탄산나트륨, 233 μL의 0.85% NaCl 중 200 mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드, 및 3.451 mL의 Ham’s F-12를 혼합한다( 재료 표 참조).알림: 남은 염기성 매트릭스 용액은 뚜껑이 있는 50mL 고투명 폴리프로필렌 원뿔형 튜브에 넣고 4°C에서 보관하여 최대 2개월 동안 사용할 수 있습니다. 발아 매체를 준비하십시오.구체적으로 인간 조혈 세포의 발달을 지원하기 위해 50mL의 유연한 무혈청 배지(SFM), 1.3mL의 유연 무혈청 배지 영양 보충제, 15% 소 태아 혈청(FBS), 페니실린-스트렙토마이신 250μL, 0.85% NaCl 중 200mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드 500μL, VEGFA(100ng/mL) 및 FGF2(100ng/mL)를 공식화합니다( 재료 표 참조). 차단 버퍼를 준비합니다.소 혈청 알부민 0.5g, 소 태아 혈청 1.5mL, 트윈 20 250μL, 트리톤 X-100 250μL, 데옥시콜산나트륨(1% wt/vol stock) 500μL, 1x 인산염 완충 식염수 47.5mL를 섞습니다( 재료 표 참조). 모든 구성 요소가 잘 통합되고 용액이 깨끗해질 때까지 위아래로 피펫을 사용합니다. 2. 인간 만능줄기세포 및 유도만능줄기세포의 유지 및 배양 줄기 세포 배양 배지와 함께 LDEV 없는 환원 성장 인자 기저막 매트릭스(1:50 희석)로 코팅된 6웰 조직 배양 플레이트를 사용하여 세포 배양을 수행합니다( 재료 표 참조). 세포가 ~70% 밀도에 도달하면 1mL의 포유류 세포 해리 효소( 재료 표 참조)를 사용하여 37°C에서 3-4분 동안 계대시킵니다.참고: 1:6의 비율로 세포를 분할하면 세포 생존율이 향상되고 대부분의 인간 줄기 세포주에서 2-4일 이내에 합류성을 달성합니다. 세포 생존율을 증가시키기 위해, ROCK 억제제 Y-27632-보충된(10 mM, 1:1,000) 배양 배지를 계대 후 24시간 동안 사용한다. 70%의 밀도에 도달할 때까지 매일 배양 배지를 교체하십시오.참고: 현재 연구의 경우 70% 밀도에서 6웰 세포 배양 플레이트의 한 웰에는 약 100만 개의 H9 hPSC가 포함되어 있습니다. 3. Day 0 – 단세포 현탁액에서 만능 응집체 생성 참고: 6웰 배양 플레이트의 두 웰에서 70%의 밀도는 약 175hBVO를 생성합니다. 피펫 또는 진공 시스템을 사용하여 배양 배지를 흡인하고 1mL의 세포 해리 시약( 재료 표 참조)으로 교체하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 세포가 세포 해리 시약 아래에 있는 동안 6웰 초저부착 배양 플레이트에서 원하는 웰 수에 필요한 15mL 원뿔형 튜브에 필요한 부피의 응집 배지(단계 1.1)를 준비합니다( 재료 표 참조). 1 mL의 세포 해리 시약을 흡인하고, 1 mL의 응집 배지에 세포를 현탁시킨다. 샘플을 계수하기 전에 부드러운 업-다운 피펫팅으로 단일 세포 현탁액을 만듭니다.주의: hPSC는 기계적 응력에 매우 민감하며 공격적인 피펫팅을 견딜 수 없습니다. 현미경 하에서 자동화된 세포 계수 장치(10 ) 또는 표준화된 시스템을 사용하여 세포를 계수한다. 실험에 필요한 셀 번호를 계산합니다.참고: 세포주에 따라 200,000 세포/웰에서 300,000 세포/웰이 응집체 형성에 이상적인 것으로 간주됩니다(즉, 4웰 = 총 800,000 – 1,200,000 세포). 적절한 부피의 세포 현탁액을 15mL 고투명 폴리프로필렌 원뿔형 튜브의 응집 배지에 추가합니다. 균질한 세포 분포를 보장하기 위해 희석된 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 희석된 세포 현탁액 3 mL를 6-웰 초저부착 배양 플레이트의 각 원하는 웰에 피펫팅한다. 플레이트를 인큐베이터(37°C, 5%CO2, >90% 습도)에 넣고 가능한 한 인큐베이터 도어를 열고 닫지 마십시오.알림: 이 초기 단계는 저녁이나 인큐베이터 교통량이 적을 때 완료하는 것이 가장 좋습니다. 약간의 진동도 응집체의 크기와 모양에 영향을 미쳐 결과를 손상시킬 수 있습니다. 4. 1일차 – 응집체의 중배엽 유도 파종 후 24시간 후에 2-10개의 세포로 구성된 작은 응집체가 현미경으로 보이는지 확인합니다. 응집체를 수집하고, 배지를 중배엽 유도 배지로 변경하기 전에 이들이 침전되도록 한다(단계 1.3). 6웰 초저부착 배양 플레이트의 웰당 15mL 고투명 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 1개를 설정합니다. 원형 운동(예: 오비탈 셰이커)을 사용하여 각 웰의 중앙에 응집체를 모으고, 1mL 피펫을 사용하여 각 웰에서 응집체와 주변 배지를 부드럽게 수집하고, 해당 15mL 고투명 폴리프로필렌 원뿔형 튜브에 넣고, 응집체가 실온에서 침전되도록 합니다. 수집이 완료되면 타이머를 1시간으로 설정하는데, 이는 대부분의 세포주/응집체가 이 단계에서 침전되는 데 필요한 시간입니다.알림: 시간이 1시간 미만이면 15mL 원뿔형 튜브의 바닥에 가라앉지 않았을 수 있는 응집체가 손실될 수 있습니다. 한 시간이 지나면 조심스럽게 피펫 또는 고감도 흡인 펌프로 상청액을 흡인하십시오. 응집체가 15mL 원뿔형 튜브의 바닥에서 방해받지 않고 유지되는지 확인합니다. 각 15mL 원뿔형 튜브의 응집체를 2mL의 중배엽 유도 배지에 재현탁하고 6웰 초저부착 배양 플레이트의 해당 웰에 다시 넣습니다. 플레이트를 다시 인큐베이터(37°C)에 넣고 4일까지 방치합니다.알림: 응집체가 서로 부착되어 성장하는 경우 1mL 피펫을 사용하여 하루에 한 번 응집체의 각 웰을 위아래로 부드럽게 피펫하여 응집체의 크기를 비슷하게 유지합니다. 5. 4일차 – 응집체의 혈관 유도 및 프라이밍 응집체를 수집하고, 배지를 혈관 유도 배지로 변경하기 전에 이들이 침전되도록 한다(단계 1.4). 6-웰 초저부착 배양 플레이트의 웰당 1개의 15mL 원뿔형 튜브를 설정합니다. 원형 운동(예: 오비탈 셰이커)을 사용하여 각 웰의 중앙에 응집체를 모으고, 1mL 피펫을 사용하여 각 웰에서 응집체와 주변 배지를 부드럽게 수집하고, 해당 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 수집이 완료되면 응집체가 침전될 수 있도록 타이머를 30분으로 설정합니다.참고: 이 단계에서 대부분의 세포주에는 30분의 시간이 필요합니다. 시간이 30분 미만이면 15mL 코니컬 튜브의 바닥에 가라앉지 않았을 수 있는 응집체가 손실될 위험이 있습니다. 30분 후 조심스럽게 피펫 또는 고감도 흡인 펌프로 상층액을 흡인합니다. 응집체가 15mL 원뿔형 튜브의 바닥에서 방해받지 않고 유지되는지 확인합니다. 각 15mL 원뿔형 튜브의 응집체를 2mL의 혈관 유도 배지에 재현탁하고 6웰 초저부착 배양 플레이트의 해당 웰에 다시 넣습니다. 플레이트를 다시 인큐베이터(37°C)에 넣고 6일까지 그대로 두십시오.참고: 1mL 피펫을 사용하여 하루에 한 번 각 응집체 웰을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 응집체의 크기를 비슷하게 유지하고 서로 자라거나 부착되는 것을 방지합니다. 6. 6일차 – 골재 포매 및 혈관 새싹 유도 얼음 위에서 작업하는 동안 ECM 용액의 원하는 최종 부피를 준비합니다(단계 1.5).참고: 다음은 12웰 플레이트(30-50 응집체)의 한 웰에 대한 프로토콜이며 필요에 따라 조정할 수 있습니다.12웰 플레이트 중 하나의 웰에 대해 0.5mL의 ECM을 하단 레이어로 적용하고 0.5mL의 ECM과 응집체를 상단 레이어에 사용합니다. 이것은 효과적인 3D 골재 발아에 필요한 ECM “샌드위치”를 생성합니다. 500 μL의 ECM을 12-웰 플레이트의 한 웰에 피펫팅합니다. 기포가 형성되지 않고 우물 바닥과 측면 메니스커스가 완전히 코팅되었는지 확인하십시오. 이것은 ECM 샌드위치의 레이어 1을 포함합니다. 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 다시 놓습니다.참고: 효과적인 중합을 위해서는 2시간의 시간이 필요합니다. 시간이 짧아지면 ECM 무결성이 손상될 위험이 있습니다. 층 1 중합이 끝날 무렵, 원을 그리며 각 웰의 중앙에 응집체를 모으고, 1mL 피펫을 사용하여 각 웰에서 응집체와 주변 배지를 부드럽게 수집하고, 해당 15mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 응집체가 10-15분 동안 침전되도록 하고 상층액을 흡인합니다. 15mL 원뿔형 튜브에 응집체를 얼음 위에 5분 동안 놓습니다. 냉각하는 동안, 현재 중합 된 층 1을 갖는 12 웰 플레이트를 인큐베이터로부터 꺼낸다.참고: 응집체를 냉각하면 층 2 ECM의 조기 중합을 방지하는 데 도움이 됩니다. 기포 형성을 방지하기 위해 신속하고 신중하게 작업하고, 500μL의 ECM에 응집체를 재현탁하고, 이미 중합된 층 1 위에 ECM 응집체 현탁액을 피펫팅합니다. 층 1을 만지지 않도록 주의하면서 200μL 피펫 팁을 사용하여 층 2와 응집체를 웰 주위에 부드럽게 분배합니다. 플레이트를 37°C에서 2시간 동안 다시 놓습니다.참고: 효과적인 ECM 중합을 위해서는 2시간의 배양 시간이 필요합니다. 시간이 짧을수록 ECM 무결성이 손상될 위험이 있으며 레이어 1과 레이어 2 사이의 강한 접착을 방지할 수 있습니다. 혈관 분화를 유도하기 위해 미리 가온된(37°C) 발아 배지 1mL(단계 1.6)를 추가합니다. 발아 혈관은 매립 후 1일에서 3일 사이에 나타나야 합니다. 3 일 후에 배지를 교체 한 다음 격일로 교체하십시오.알림: 발아 매체는 미리 예열되어야 합니다. 그렇지 않으면 레이어 분리가 발생할 수 있으며 ECM 무결성에 영향을 줄 수 있습니다. 7. 11일차 – BVO의 분리 및 성숙 무균 상태에서 작업하려면 무균 주걱의 둥근 끝을 사용하여 혈관 네트워크를 포함하는 ECM 발아 매트릭스를 풉니다. 이 단계에서 젤은 자유 부동 디스크와 유사해야합니다.멸균 집게와 멸균 주걱의 둥근 끝을 사용하여 젤 디스크 (혈관 네트워크 포함)를 10cm 배양 접시의 뚜껑으로 조심스럽게 옮깁니다. 원하는 배율과 초점으로 조정된 실체현미경 아래에 뚜껑과 젤을 놓고 멸균 바늘을 사용하여 단일 혈관 네트워크를 절단하여 이 과정에서 얻은 혈관화되지 않은 ECM의 양을 제한합니다.참고: 세포는 시간이 지남에 따라 주변 ECM을 자연적으로 분해합니다. 그러나 각 오가노이드로 절단되는 양을 줄이면 이미지 품질과 독립형 혈관 네트워크 무결성이 향상됩니다. 모든 오가노이드가 겔에서 분리되면 3mL의 발아 배지가 있는 초저부착 6웰 플레이트의 한 웰로 부드럽게 다시 옮깁니다. 이 단계에서 오가노이드는 밤새 방치하거나 즉시 7.4단계로 진행할 수 있습니다. 1mL 피펫을 사용하여 단일 오가노이드를 6웰 플레이트에서 초저 부착 96웰 플레이트의 웰로 옮깁니다. 일단 옮겨지면, 200 μL의 미리 데워진(37°C) 발아 배지를 96-웰 플레이트의 각 웰에 추가한다.참고: 12웰 플레이트의 혈관 오가노이드 웰 1웰은 96웰 플레이트의 30-40웰을 채워야 합니다. 96웰 플레이트에서 분리한 후 4-6일이 지나면 오가노이드가 둥글고 건강한 형태를 갖는지 확인합니다. 이 단계에서 오가노이드는 고정될 준비가 되어 염색을 위해 준비됩니다. 8. 15일차 – BVO의 고정, 차단 및 염색 절단된 1mL 팁을 사용하여 오가노이드를 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 옮깁니다. BVO의 흡인을 피하기 위해 200μL 또는 1,000μL 피펫을 사용하여 미세원심분리기 튜브에 남아 있는 발아 배지를 제거한 다음 PBS에 4% PFA 1mL를 1시간 동안 추가합니다.알림: 실온에서 오비탈 셰이커(125rpm)에 고정하는 것이 좋습니다. 최대 60개의 BVO/미세 원심분리기 튜브가 허용됩니다. 더 이상 BVO는 고정 및 세척 효능을 손상시킵니다.주의 : PFA는 유해한 화학 물질입니다. 흄 후드에서 주의해서 사용하고 제조업체의 사용 지침과 적절한 폐기 방법을 따르십시오. 새로 고정된 BVO를 0.25% PBS-트윈으로 매번 15분 동안 3회 세척합니다. 오가노이드의 직경이 1mm보다 큰 경우 실온에서 30-60분 동안 PBS에서 1% Triton X-100으로 BVO를 투과시킵니다. 모든 0.25% PBS-트윈을 흡인하고, 1 mL의 블로킹 완충액을 첨가한다 (단계 1.7).참고: 항체에 의존적이기는 하지만 오비탈 셰이커(125rpm)에서 실온에서 2시간 동안 염색 과정에서 비특이적 항체 결합을 감소시키기에 충분합니다. 오가노이드는 4°C의 블로킹 완충액에 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다. 블로킹 완충액을 제거하고, 블로킹 버퍼 1mL에 희석된 1차 항체(1:100)를 첨가한다. 오비탈 셰이커(12rpm)에서 4°C에서 밤새 유지하여 오가노이드가 1차 항체 용액에 잠긴 상태를 유지하도록 합니다.참고: 하룻밤 1차 항체 배양은 이 연구에 사용된 항체에 적합합니다. 필요한 1차 및 2차 항체 및 이들의 각각의 희석액은 물질 표에 제공된다. 하룻밤 동안 1차 항체 인큐베이션에 이어, 1차 항체 용액을 제거하고 0.25% PBS-트윈으로 매번 15분 동안 3x 세척하였다. 블로킹 완충액 1mL에 희석된 2차 항체(1:250)와 DAPI(1:1,000)를 첨가하고 실온 또는 4°C에서 밤새 2시간 동안 배양합니다.참고: 샘플이 올바르게 준비되면(위에서 설명한 대로) 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양하는 것이 본 연구에 사용된 항체에 적합합니다. 인큐베이션 후, 2차 항체 용액을 제거하고, 0.25% PBS-Tween으로 매회 15분 동안 3x 세척하였다.참고: 염색 후 오가노이드는 최대 2주 동안 PBS에 보관할 수 있습니다. 9. 혈관 오가노이드(BVO)의 장착 마운팅 스페이서를 원하는 이미징 커버슬립에 붙입니다( 재료 표 참조). 절단된 1mm 피펫 팁을 사용하여 1mL 피펫을 사용하여 단일 오가노이드를 스페이서 웰로 옮기고 나머지 PBS를 흡인합니다. 75°C로 가열된 150-200μL의 투명 용액( 재료 표 참조)으로 웰을 채우고 오가노이드를 완전히 잠급니다.알림: samples는 따뜻해진 청소 용액에 노출된 후 1시간 이내에 투명해져야 합니다.오가노이드가 투명해지도록 덮개를 씌운 상자에 넣어 실온에서 6시간 내지 하룻밤 동안 실온에 두어 1시간 청소 시간이 충분하지 않은 경우 하룻밤 동안 두십시오. 샘플을 밤새 방치하는 경우 건조를 방지하기 위해 충분한 세척 용액이 있는지 확인하십시오. 세척 후 100-200 μL 피펫 팁으로 세척 용액을 조심스럽게 흡입합니다. 오가노이드를 스페이서 웰의 중앙으로 부드럽게 움직이고 웰이 가득 찰 때까지 마운팅 젤 방울( 재료 표 참조)을 추가합니다(제어된 가열 블록에서 75°C로 예열). 두 번째 커버슬립을 마운팅 스페이서 위에 부드럽게 놓아 s를 밀봉합니다.amp하단과 상단 커버슬립 사이의 공간에 s. 마운팅 젤을 4°C의 어두운 곳에서 밤새 경화시킵니다.알림: 경화 후 탑코트 매니큐어를 사용하여 장착된 샘플을 추가로 밀봉할 수 있습니다.