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Biochemistry

Processamento de células-tronco mesenquimais humanas para aplicações clínicas usando um fluxo de trabalho semi-automatizado fechado

Published: March 17, 2023
doi:
10.3791/64707
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1Bioprocessing Technology Institute (BTI),Agency for Science, Technology and Research (A STAR), 2Thermo Fisher Scientific, 3Thermo Fisher Scientific

Summary

Apresentamos aqui um protocolo para colheita de células aderentes de frascos multicamadas de forma semi-automatizada fechada usando um sistema de centrifugação em contrafluxo. Este protocolo pode ser aplicado para a colheita de células aderentes e em suspensão de outras plataformas de expansão celular com poucas modificações nas etapas existentes.

Abstract

As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) estão sendo exploradas atualmente como uma modalidade terapêutica baseada em células promissora para várias doenças, com mais aprovações de mercado para uso clínico esperadas nos próximos anos. Para facilitar essa transição, é fundamental abordar os gargalos de escala, reprodutibilidade de lote a lote, custo, conformidade regulatória e controle de qualidade. Esses desafios podem ser resolvidos fechando o processo e adotando plataformas automatizadas de fabricação. Neste estudo, desenvolvemos um processo fechado e semi-automatizado para passagem e colheita de hMSCs derivadas da geleia de Wharton (WJ) (WJ-hMSCs) de frascos multicamadas usando centrifugação em contrafluxo. As WJ-hMSCs foram expandidas usando meio livre de xeno livre de soro (SFM XF) compatível com a regulamentação, e mostraram proliferação celular comparável (duplicação populacional) e morfologia às WJ-hMSCs expandidas em meios clássicos contendo soro. Nosso protocolo fechado de colheita semi-automatizada demonstrou alta recuperação celular (~98%) e viabilidade (~99%). As células lavadas e concentradas por centrifugação em contrafluxo mantiveram a expressão do marcador de superfície WJ-hMSC, unidades formadoras de colônias (UFC-F), potencial de diferenciação de trilinhagens e perfis de secreção de citocinas. O protocolo semi-automatizado de colheita de células desenvolvido no estudo pode ser facilmente aplicado para o processamento em pequena a média escala de várias células aderentes e de suspensão, conectando-se diretamente a diferentes plataformas de expansão celular para realizar redução de volume, lavagem e colheita com um baixo volume de produção.

Introduction

As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) são uma grande candidata para aplicações clínicas, tanto na engenharia tecidual quanto em terapias celulares, dado seu potencial terapêutico e alto potencial de autorrenovação para crescer in vitro, que são fundamentais para gerar dosagens clinicamente relevantes de células 1,2,3. De acordo com ClinicalTrials.gov, existem mais de 1.000 ensaios clínicos atualmente em investigação para várias condições da doença4. Dado o cenário de crescente interesse no uso de hMSCs, mais ensaios clínicos e aprovações no mercado são iminentes em um futuro próximo 5,6. No entanto, a fabricação de hMSCs tem muitos desafios inerentes em termos de variabilidade lote a lote, o uso de matérias-primas de alto risco, preocupações com relação à contaminação devido a muitos processos abertos e manuais, já que a fabricação envolve múltiplas operações unitárias, custos de mão de obra mais altos, o custo de expansão ou ampliação e obstáculos regulatórios 6,7,8,9,10, 11,12. Estas questões continuam a ser um obstáculo significativo ao acesso actual e futuro ao mercado.

O desenvolvimento de soluções de fabricação fechadas, modulares e automatizadas e o uso de reagentes auxiliares de baixo risco resolveriam esses desafios. Isso também garantiria a qualidade consistente do produto, diminuiria a probabilidade de falhas de lote devido a erro humano, reduziria os custos de mão de obra e melhoraria a padronização do processo e a conformidade regulatória, como em termos de registro digital de lotes 8,12,13,14. Para ser capaz de obter uma dosagem clinicamente relevante de células, seja ela autóloga ou alogênica, a fabricação simplificada que envolve expansão celular a montante e processamento a jusante de forma fechada e automatizada é crucial.

Para expansão hMSC upstream, os dois métodos de fabricação mais comuns atualmente empregados são scale-out (monocamada 2D) e scale-up (sistema de suspensão baseado em microtransportador 3D)15,16,17,18. O método mais tradicional e amplamente adotado para expansão de hMSC é a cultura 2D baseada em monocamadas, devido ao baixo custo de produção e facilidade de instalação19.

Frascos multicamadas compostos por bandejas de superfície plana empilhadas dentro de um recipiente de cultura são comumente utilizados para expandir a produção de hMSC. Esses sistemas normalmente vêm em recipientes de cultura de 1 camada a 40 camadas20 e são manuseados manualmente dentro de gabinetes de biossegurança. As etapas de processamento durante a passagem celular e colheita envolvem a dispensação e decantação manual do meio de expansão, reagente de dissociação e tampão de lavagem por pipetagem ou inclinação física de todo o recipiente. Além disso, o manuseio de várias unidades é desafiador e demorado devido ao seu tamanho e peso.

Posteriormente, a pós-colheita de frascos multicamadas, a centrifugação para troca de meios, a lavagem celular e a redução de volume são etapas essenciais em todo o fluxo de trabalho de fabricação de células21. A centrifugação convencional de bancada é um processo principalmente aberto e manual que envolve uma infinidade de etapas, como transferir a suspensão da célula para tubos tampados ou garrafas dentro de um gabinete de biossegurança, girar as células, aspirar manualmente o sobrenadante, ressuspensão celular com o tampão e lavagens repetidas das células. Isso aumenta drasticamente tanto o risco de contaminação pela abertura e fechamento das tampas quanto as chances de perda do pellet celular durante o processo de aspiração/pipetagem manual22. No contexto do manuseio de sistemas de cultura multicamadas para células baseadas em aderentes, como hMSCs, o operador precisaria passar por um processo trabalhoso de transporte entre a centrífuga e o gabinete de biossegurança repetidamente e manusear uma unidade pesada ao mesmo tempo. Essas etapas manuais são trabalhosas, oferecem riscos em termos de erros humanos e contaminação e devem ser conduzidas em um ambiente de sala limpa Classe B, o que é dispendioso23. Além disso, o processo de centrifugação manual convencional não é escalável e pode causar cisalhamento e tensão celular; Assim, maximizar a recuperação celular, a viabilidade e a eficiência de wash-out de impurezas residuais são outros grandes desafios22. A fabricação comercial de terapias celulares em escala cGMP requer soluções de automação modulares e fechadas para reduzir o risco de contaminação, garantir a qualidade consistente do produto, reduzir os custos de mão de obra e produção e aumentar a confiabilidade do processo24,25. Os frascos multicamadas podem ser manuseados como um sistema fechado por ter um filtro estéril de 0,2 μm em uma das portas para facilitar a troca gasosa estéril e uma segunda porta conectada assepticamente através de conectores ou soldada por tubo diretamente a um instrumento automatizado de processamento de células para colheita de células. Trabalhamos para fechar e automatizar a maioria das etapas de passagem e colheita do WJ-hMSC, avaliando uma centrífuga de contrafluxo fechada inovadora destinada à fabricação de produtos baseados em células, genes ou tecidos. Essa centrífuga de contrafluxo também tem flexibilidade para realizar uma variedade de aplicações de processamento celular, como separação celular baseada em tamanho, troca meio/tampão, concentração e colheita para uma variedade de tipos celulares 8,26,27,28. O instrumento usa um kit fechado de uso único que pode ser conectado estéril usando soldagem de tubo ou conectores assépticos para transferir sacos ou pode ser conectado diretamente a qualquer plataforma de expansão de escolha.

Neste estudo, projetamos um conjunto de tubos personalizado para permitir conexões estéreis fechadas entre o kit de centrifugação contrafluxo de uso único e o frasco multicamadas. Otimizamos um protocolo para separar, lavar e colher enzimaticamente as CTMs WJ do frasco multicamadas de forma totalmente fechada e semi-automatizada em uma única execução. As WJ-hMSCs colhidas foram caracterizadas quanto à pureza (análise de marcadores de superfície) e potência (UFC-F, diferenciação de trilinhagens e perfis de secreção de citocinas) para garantir que o produto final atendesse aos atributos críticos de qualidade (CQAs) para liberação do lote.

Protocol

1. Preparação dos meios de cultura e revestimento dos recipientes de cultura Preparação da mídiaComposição do meio contendo soro clássico: Preparar o meio contendo soro clássico misturando αMEM (445 mL), soro fetal bovino (SFB) (50 mL) e 100x penicilina-estreptomicina (5 mL). Prepare o meio SFM XF completo.Fazer um frasco de 500 mL adicionando assepticamente 5 mL de suplemento SFM XF (100x) e 5 mL de 100x L-alanil-L-glutamina (ver Tabelas de Materiais) ao meio basal SFM XF (500 mL). Fazer um saco de mídia de 2 L adicionando assepticamente 20 mL de suplemento personalizado MSC SFM XF (100x) e 20 mL de 100x L-alanil-L-glutamina (ver Tabelas de Materiais) ao saco médio basal SFM XF (2 L) conectando uma seringa de 50 mL à porta apropriada do saco.NOTA: Antes de usar em cultura, adicione fatores de crescimento ou citocinas (não fornecidas com o meio) ao meio SF XF completo: PDGF-BB (20 ng/mL), FGF básico (4 ng/mL) e TGFβ (0,5 ng/mL). Revestimento dos vasos de cultura celular com vitronectina para uso com meio sem soroDescongelar um estoque de vitronectina (VTN-N; 0,9 mg/mL) a 4 °C. Use solução salina tamponada estéril de Dulbecco sem cálcio e magnésio (DPBS) para diluir o N-VTN descongelado para uma concentração de trabalho de 5 μg/mL.NOTA: Diluir o N-VTN imediatamente antes da utilização e não conservar a solução de vitronectina diluída. Adicionar 1 mL/10 cm2 da solução diluída de VTN-N ao vaso de cultura correspondente; A concentração final é de 0,5 μg/cm2. Por exemplo, adicionar 7,5 mL de solução diluída de N-VTN a um balão T-75 (75 cm2); adicionar 17,5 mL de solução diluída de N-VTN a um balão T-175 (175 cm2); adicionar 250 ml de solução diluída de N-VTN a um balão multicamadas padrão de quatro camadas (2,528 cm2); e adicionar 630 mL de solução diluída de N-VTN a um balão multicamadas de 10 camadas (6.320 cm2). Em condições estéreis, incubar os vasos por 1 h à temperatura ambiente (TR).NOTA: O recipiente de cultura revestido pode ser armazenado em 4 °C por até 1 semana. Embrulhe o recipiente de cultura com filme de laboratório para evitar que ele seque. Antes de usar, pré-aqueça o recipiente de cultura à temperatura ambiente por pelo menos 1 h. Aspirar a solução de VTN-N, descartar e adicionar imediatamente um volume suficiente de meio de cultura para evitar que a superfície do vaso revestido seque.NOTA: Não é necessário enxaguar o vaso de cultura após a remoção do VTN-N. 2. Expansão WJ-hMSC Descongelar rapidamente WJ-hMSCs (p2) colocando o criovial em banho-maria a 37 °C; Agite lentamente o frasco para injetáveis até que o conteúdo comece a descongelar. Após o descongelamento, semear as WJ-hMSCs a 5.000 células/cm2 em frasco T-175 (sem revestimento de VTN-N) e incubar no meio soro clássico a 37 °C em atmosfera umidificada de 5% de CO2 para expansão celular. Após duas passagens (p4), depositar as células expandidas no meio de criopreservação desejado como um banco de células em funcionamento (WCB). Realizar a contagem de células usando um contador de células automatizado seguindo o método de viabilidade e contagem de células para determinar a contagem total de células, a viabilidade celular e o tamanho da célula29. A partir de p4, cultivar as WJ-hMSCs a 5.000 células/cm2 em frascos T-75 em meio contendo soro clássico ou meio SFM XF (utilizar frascos revestidos com VTN-N com meio SFM XF). Manter as células em ambos os meios de cultura por um total de três passagens (12 dias), e medir a expansão celular (aumento de dobras) em cada passagem dividindo o número de células viáveis contadas no final da cultura de cada passagem pelo número de células viáveis no início da cultura (dia de semeadura celular). 3. Expansão scale-out do trem de sementes Expansão WJ-hMSC em frasco T-175Descongelar rapidamente as CTMs-WJ em p4 colocando o criovial em banho-maria a 37 °C; Agite lentamente o frasco para injetáveis até que a solução comece a descongelar. Semeando 5.000 células/cm2 em um frasco T-175 revestido com VTN-N. Permitir que as células cresçam numa incubadora a 37 °C com 5% de CO2. Substitua o meio de cultura gasto a cada 2-3 dias por meio SFM XF completo pré-aquecido recém-preparado para um ótimo desempenho e crescimento celular. Manuseio dos frascos multicamadas (Figura 1A, B)Todas as conexões assépticas precisam ser feitas em um ambiente estéril. Desembale o balão multicamadas dentro de um armário de segurança biológica. Conecte o filtro de ar pré-esterilizado (0,2 μm) a uma porta para permitir que a pressão seja liberada durante a transferência de fluido usando a centrífuga de contrafluxo. Encaixe o conector de frasco multicamadas do conjunto de tubos personalizados na outra porta (Figura 1B). Solde a linha de PVC do conjunto de tubos personalizados ao saco de transferência de PVC de 2 L contendo meio SFM XF completo.NOTA: Misture completamente o saco médio antes de adicioná-lo ao sistema multicamadas por fluxo de gravidade. Certifique-se de que o saco de transferência de PVC está pendurado mais alto do que o balão de várias camadas. Colocar o balão multicamadas em seu lado longo, com o filtro de ar na parte superior (Figura 1B). Abra a braçadeira no tubo de PVC para iniciar o enchimento do balão multicamadas. Certifique-se de que o meio esteja nivelado entre as bandejas durante o enchimento. Uma vez que o meio tenha sido totalmente nivelado em todas as bandejas, vire o frasco de várias camadas em seu lado curto com as portas na vertical. Feche a braçadeira na linha de PVC e remova o saco de transferência substituindo a conexão da tubulação pela tampa de fechamento azul MPC.NOTA: Não remova o filtro de ar, pois isso permite a troca gasosa durante a expansão da célula. Virar o balão multicamadas para a posição de incubação.NOTA: O filtro e a conexão de tubulação devem estar voltados para cima. Esvaziar o balão multicamadas, ligando-o a um frasco aspirador; Coloque-o acima do frasco aspirador e o líquido fluirá para fora.NOTA: Incline o balão multicamadas de lado para drenar completamente o meio gasto por gravidade. Alternativamente, o meio gasto pode ser despejado em uma garrafa de resíduos usando um conjunto de tubulação personalizado. Repita os passos 3.2.5-3.2.11 para repor o meio fresco. Subcultivo de WJ-hMSCs em frasco multicamadas (T-175 > 4 camadas > 10 camadas)Reagente de dissociação de células pré-aquecidas (TrypLE) e meio SFM XF completo dentro de uma incubadora a 37 °C antes do uso. Aspirar o meio gasto do frasco T-175 e descartar. Lave a monocamada celular com DPBS pré-aquecido, aspirar e descartar. Adicionar TrypLE a cada balão, assegurar a cobertura completa da monocamada celular e incubar durante 5-10 minutos a 37 °C. Transfira a suspensão para um tubo cônico estéril de 50 mL. Centrifugar o tubo a 100-200 x g por 5 min na RT. Aspirar e descartar o DPBS, e ter cuidado para não perturbar a pastilha celular. Ressuspender o pellet de células em um volume mínimo (10 mL) de meio SFM XF completo pré-aquecido para contagem celular. Preencher um recipiente de cultura de quatro camadas revestido com VTN-N com cerca de 800 mL de meio SFM XF completo, conforme mencionado na seção 2 acima. Adicionar 5.000 células/cm2 (ou seja, 1,26 x 107 células viáveis/frasco). Gire suavemente a suspensão da célula para garantir uma distribuição uniforme. Incubar numa estufa a 37 °C com 5% de CO2 numa atmosfera humidificada. Substitua o meio de cultura gasto a cada 2-3 dias por meio SFM XF completo fresco e pré-aquecido para um crescimento celular ideal até que as células atinjam 60%-80% de confluência ou estejam prontas para serem subcultivadas no frasco multicamadas de 10 camadas. Encher um balão multicamadas de 10 camadas revestido com VTN-N com cerca de 2 L de meio SFM XF completo, conforme mencionado na secção 2. Adicionar 5.000 células/cm2 (ou seja, 3,1 x 107 células/frasco). Gire suavemente a suspensão da célula para garantir uma distribuição uniforme. Incubar numa estufa a 37 °C com 5% de CO2 numa atmosfera humidificada. Substitua o meio de cultura gasto a cada 2-3 dias por meio SFM XF completo fresco e pré-aquecido para um crescimento celular ideal até que as células atinjam 60%-80% de confluência ou estejam prontas para serem colhidas. 4. Dissociação e colheita semi-automatizada WJ-hMSC fechada usando centrifugação em contrafluxo fechado Montagem do kit de centrifugação de contrafluxo de uso únicoConecte o kit de uso único com os sacos de transferência de PVC de uso único por meio de solda tubular, semelhante à configuração mostrada na Figura 1A.NOTA: A taxa de fluxo padrão do kit de uso único é de 30-165 mL/min. Anexe um frasco multicamadas de 10 camadas contendo WJ-hMSCs confluentes ao conjunto de tubulação personalizado dentro de um gabinete de biossegurança. Transfira o recipiente de cultura de 10 camadas anexado com o conjunto de tubulação personalizado para uma bancada e solde na Linha E (3/32 em PVC ID) do kit de uso único, conforme mostrado na Figura 1B. Certifique-se de soldar uma porta de amostra estéril na Linha G do kit de uso único de alto fluxo. Em seguida, conecte a linha H de colheita a um Luer estéril equipado com uma seringa de 50 mL.NOTA: Em todas as etapas acima, certifique-se de que as braçadeiras manuais estejam fechadas para fixar o fluido em cada saco do kit. Configurando a execução do instrumentoLigue o instrumento ” ON” ligando o botão de alternância na parte traseira do instrumento. Conecte o laptop à porta USB-C do instrumento usando o cabo USB-C fornecido (Figura 1B). Execute o software de interface gráfica do usuário (GUI) centrífuga de contrafluxo na área de trabalho ou no menu Iniciar. Depois de entrar, carregue o protocolo clicando no botão Selecionar um protocolo na página principal de boas-vindas.NOTA: O protocolo de colheita por centrifugação em contrafluxo (Tabela 1) foi criado utilizando o software Construtor de Protocolos e armazenado localmente. Pressione o botão azul de destravamento no instrumento e abra a porta de vidro. Carregue o kit de uso único montado no sistema de centrifugação de contrafluxo. Comece pendurando os sacos suspensos em ganchos de cabide em uma ordem que melhor os alinhe com as portas do tubo nas tiras do sensor de bolhas, com o frasco multicamadas de 10 camadas colocado em um ângulo, como mostrado na Figura 1B. Alinhe o kit com os dois botões de localização do kit, estique a tubulação da bomba ao redor da bomba peristáltica e pressione o conector em forma de lâmpada branca no lugar.NOTA: Certifique-se de que a tubulação sobre o sensor de pressão está corretamente colocada na esteira da tubulação. Conecte a câmara centrífuga levantando a alavanca de prata do suporte da câmara centrífuga de contrafluxo e prendendo-a devolvendo a alavanca à sua posição vertical. Pressione a tubulação de cada porta do kit nas trilhas ao longo das tiras do sensor de bolhas.NOTA: Certifique-se de que as bolsas não estão emaranhadas para que o processo de protocolo possa ser facilmente seguido. Feche a porta pressionando a trava da porta.NOTA: O braço de fixação da bomba fechará, a câmara centrífuga girará e as válvulas fecharão. Sem fechar a porta, o sistema não poderá iniciar e executar o protocolo. Pressione o botão Iniciar na GUI. Uma lista de verificação aparecerá; Os quatro primeiros itens são verificações de instrumentos, e os dois últimos itens são verificações do usuário (certifique-se de que as malas e conexões correspondam à imagem do kit e verifique se as braçadeiras manuais estão abertas).NOTA: Para verificações de instrumentos, Xs vermelhos em vez de marcas de seleção azuis são mostrados se algo não estiver certo. Pressione Confirmar para mostrar a tela de entradas de protocolo. Defina o valor da caixa de diálogo de entrada de dados (Volume de colheita) como 45 mL e pressione Confirmar.Observação : a tela de entrada de protocolo será solicitada se quaisquer entradas de dados variáveis são definidas no protocolo criado pelo usuário. O volume de colheita é definido como uma variável neste protocolo, e o usuário pode optar por testar diferentes volumes dependendo dos requisitos finais de densidade celular. O volume mínimo de colheita que o sistema permite é de 5 mL. O sistema permite que no máximo apenas quatro variáveis de dados sejam definidas para cada protocolo. Executando o protocoloClique em Iniciar na GUI e pressione o botão verde Iniciar no instrumento para iniciar a execução do protocolo (consulte a Tabela 1).NOTA: O sistema iniciará as etapas de acordo com o protocolo começando com a sequência de priming, substituindo o ar no sistema por um buffer. Uma vez concluído o priming (Tabela 1, etapa 8), certifique-se de que o meio gasto seja completamente bombeado para o saco de lixo.NOTA: Quando o frasco multicamadas de 10 camadas estiver vazio, o sistema solicitará ao usuário na GUI para confirmar se o recipiente está vazio. Pressione o botão “Skip” no instrumento se o recipiente estiver vazio; caso contrário, pressione o botão verde “Reproduzir/Pausar” para continuar a drenar quaisquer fluidos residuais do recipiente. Em pausa, as etapas 15, 19 e 22 (Tabela 1), certifique-se de levantar o balão multicamadas e agitar para distribuir o tampão igualmente por todas as bandejas. Depois de concluído, coloque o frasco multicamadas de 10 camadas de volta em sua posição original de tração para as próximas etapas.NOTA: Para o passo 19 da Tabela 1 apenas, após agitação, certifique-se de colocar o frasco multicamadas plano e incubar por 10-15 min no RT para dissociar as células. Nas etapas 20 e 23 (Tabela 1), certifique-se de que as células tripsinizadas sejam transferidas completamente para a bolsa intermediária. Misturar bem o saco intermediário manualmente no passo 25 (Tabela 1). Na etapa 26 (Tabela 1), utilizar uma seringa Luer de 2 mL para coletar amostras através do portal de amostragem.NOTA: Recomenda-se amostrar pelo menos três vezes para contagens de células precisas. Nas etapas 29 e 30 (Tabela 1), verificar a formação estável do leito celular fluidizado; deve ser semelhante ao leito celular fluidizado, como mostra a Figura 1C.NOTA: Se o leito celular fluidizado estável não for formado de forma semelhante à mostrada na Figura 1C, a otimização da relação entre a força g e a taxa de fluxo (G/F) é crítica para obter um leito celular fluidizado estável (alta recuperação celular) na câmara durante as etapas de carregamento e lavagem da célula. A relação G/F depende do tamanho das células e da densidade do meio. Uma alta relação G/F é necessária para uma amostra de alta densidade/tampão de lavagem, enquanto uma baixa relação G/F pode ser usada para uma amostra de baixa densidade/tampão de lavagem. A execução é concluída na etapa Rampa para Parada (etapa 35 na Tabela 1), e todos os valores de pinça no sistema de centrifugação de contrafluxo serão fechados automaticamente.NOTA: Por fim, certifique-se de que as abraçadeiras manuais estejam fechadas para fixar o fluido em cada saco do kit antes de abrir a porta. Após a conclusão da execução do protocolo, pressione o botão azul de desbloqueio no instrumento e abra a porta de vidro. Retire o kit de uso único com o concentrado colhido do instrumento. Sele assepticamente a linha de colheita usando um selador de tubo de transporte manual. Transfira cuidadosamente a seringa selada preenchida com a colheita de células concentradas para o gabinete de segurança biológica para contagem de células e criopreservação. Retire a câmara novamente usando a alavanca, puxe o conector da lâmpada para fora de seu encaixe e levante cuidadosamente o kit e descarte em um saco de risco biológico. Limpe o instrumento usando lenços umedecidos a etanol e certifique-se de fechar a porta. Feche o aplicativo GUI primeiro antes de desligar o interruptor na parte traseira do instrumento.OBS: O protocolo de colheita celular foi testado em triplicatas biológicas (n = 3). 5. Avaliação dos atributos críticos de qualidade (CQA) Marcadores de superfície de identidade celular (CD73, CD90 e CD105) e marcadores não estromais (CD34 e CD45)Diluir a suspensão de células WJ-hMSC colhidas para uma concentração de 1 x 106 células viáveis/mL adicionando um volume apropriado de tampão de citometria de fluxo (DPBS com BSA 1% ou FBS 2%). Adicionar 100 μL da suspensão celular a cada tubo de microcentrífuga ou placa de 96 poços. Certifique-se de que um mínimo de 0,1 x 106 células estão presentes por 100 μL de suspensão celular. Adicionar o anticorpo conjugado a fluoróforos à amostra em uma diluição apropriada, conforme recomendado pelo fornecedor de anticorpos. Incubar por 20 min no escuro. Após a incubação, adicionar 100 μL de tampão de citometria de fluxo para lavar as amostras por centrifugação a 380 x g por 3 min. Descarte o sobrenadante, deixando a pelota para trás. Ressuspender o pellet celular em 200 μL de tampão de citometria de fluxo e ser submetido à análise por citometria de fluxo30. Ensaio fibroblástico de unidades formadoras de colônias (UFC-F)Diluir a suspensão celular até uma concentração de 1.000 células viáveis/mL de meio de cultura completo. Placa de ~500 células por poço em uma placa de cultura de tecido de 6 poços em meio de cultura completo. Incubar por 10-14 dias a 37 °C em CO2 umidificado a 5%, lavar com PBS e corar com violeta de cristal a 0,5% em metanol por 30 min em TR. Enumere as colônias em cada poço. Calcular a eficiência CFU-F: Divida o número de colônias formadas pelo número de semeadura original para obter a eficiência percentual de formação de colônias, e expresse-a como uma porcentagem. Potencial de diferenciação de trilinhagensSemente 5 x 103 células/cm2 em meio de diferenciação da osteogênese e adipogênese em placas de12 poços conforme protocolo do fabricante. Para condrogênese, preparar 1,6 x 107 células viáveis/mL e gerar microculturas de massa semeando gotículas de 5 μL da solução celular nos centros dos poços de placas de 96 poços, conforme protocolo do fabricante. Durante a diferenciação, faça mudanças completas do meio a cada 3-4 dias. Após 14 dias (para adipogênese) ou 21 dias (para osteogênese e condrogênese), monitorar as culturas para diferenciação usando colorações biológicas específicas de linhagem conforme protocolo do fabricante. Para diferenciação adipogênica, corar as culturas com solução de Oil Red O a 0,5%. Para osteogênese, realizar coloração utilizando solução de Alizarin Red S a 2%. Para diferenciação condrogênica, corar os pellets de micromassa com 1% de Alcian Blue. Perfil de secreção de citocinasDescongelar as células criopreservadas colhidas manualmente ou com o sistema de centrifugação em contrafluxo e semear 5.000 células/cm2 em frasco T-175 com meio SFM XF. Após 4 dias, coletar o meio de cultura gasto e armazená-lo a -80 °C até a análise. Quantifique a expressão de citocinas usando um kit de painel de 19 plexos de perfis de expressão de citocinas em um leitor multiplex. Realizar os imunoensaios multiplex conforme recomendações do fabricante.

Representative Results

O banco de células mestras (MCB) WJ-hMSC pós-descongelamento foi mantido por três passagens sucessivas (p1-p4) em meio clássico contendo soro para produzir bancos de células de trabalho (WCBs) suficientes para os experimentos. Os WCBs p4 foram descongelados e expandidos em meio contendo soro e SFM XF por mais três passagens (p4-p7) em frascos T-175. As CTMs WJ adaptaram-se bem quando expandidas em meio SFM XF e foram capazes de manter proliferação estável semelhante à do meio contendo soro (Figura 2A). No entanto, as células expandidas no meio SFM XF exibiram morfologia fusiforme semelhante a fibroblastos ligeiramente mais longa, resultando em um tamanho celular ligeiramente maior (Figura 2B) de uma média de ~17 μm em comparação com ~15 μm em meio contendo soro. Em ambas as condições médias ao longo das três passagens, as WJ-hMSCs atingiram consistentemente sua densidade celular máxima de ~2,3 x 104 células/cm2 e um tempo de duplicação populacional de ~34 h (Figura 2C,D). Para expansão em larga escala de WJ-hMSC em sistema fechado, foi realizada uma expansão em trem de sementes de WJ-hMSCs primeiro em um frasco de 4 camadas e, posteriormente, em um frasco multicamadas de 10 camadas. Em torno de 80%-90% de confluência após 4 dias de cultivo, colhemos 9,6 x 107 ± 0,9 x 107 e 2,3 x 10 8 ± 0,2 x 108 células para as pilhas de 4 e 10 camadas, respectivamente. Uma maior densidade celular de 3,6 x 10 4-3,8 x 104 células/cm 2 foi alcançada em comparação com os frascos T-175, o que significa que as pilhas permitiram melhor expansão celular em até sete vezes. Além disso, as WJ-hMSCs expandidas em recipientes de cultura de 10 camadas foram colhidas diretamente usando centrifugação em contrafluxo. A conexão estéril ao kit de uso único foi fácil de estabelecer para transferência direta de fluidos a uma taxa de fluxo máxima de 165 mL/min usando a bomba peristáltica do instrumento. O processo semi-automatizado de colheita de células foi obtido primeiramente pela colheita das células usando dissociação enzimática, carregando as células na câmara de contrafluxo para redução de volume e concentração e, em seguida, lavando com tampão de lavagem, que era em torno de 3x o volume da câmara de centrifugação de contrafluxo. Em seguida, as células lavadas foram então concentradas e colhidas até o volume de colheita desejado preestabelecido no protocolo. As etapas de processamento usadas para o processamento de células semi-automatizadas foram projetadas para emular o fluxo de trabalho de colheita manual. Obtivemos uma redução de 10 vezes no volume, resultando na geração de concentrações celulares de até 5,3 milhões de células/mL. O protocolo foi capaz de alcançar alta recuperação celular em ~98% e alta viabilidade celular em ~99% consistentemente para todos os três ensaios independentes (Figura 3A-C). Realizamos extensos ensaios de caracterização celular para determinar os atributos críticos de qualidade da colheita celular usando centrifugação em contrafluxo em comparação com a centrifugação manual. Para testar a identidade das WJ-hMSCs, marcadores de superfície celular foram analisados por citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 4A, as WJ-hMSCs colhidas usando ambos os métodos apresentaram perfis característicos de marcadores de superfície de acordo com as normas da ISCT, expressão positiva de CD73, CD90 e CD105, bem como expressão negativa de CD34 e CD45. Em seguida, para avaliar o potencial clonogênico das WJ-hMSCs, foram realizados ensaios de UFC-F. Como mostrado na Figura 4B, as células colhidas da centrifugação em contrafluxo apresentaram um potencial CFU-F semelhante em comparação com as células colhidas por centrifugação manual (21% ± 1% vs. 20% ± 1%, respectivamente). Além disso, como mostrado na Figura 4C, as células colhidas por centrifugação pós-contrafluxo mantiveram a capacidade de diferenciação em adipócitos, osteoblastos e condrócitos semelhante às células do método de centrifugação manual. Por fim, investigamos 18 diferentes perfis de secreção de citocinas das células usando imunoensaios multiplex. Como mostrado na Figura 4D, as células lavadas e concentradas por centrifugação pós-contrafluxo mantiveram o perfil de secreção de citocinas, e os perfis foram comparáveis aos da amostra colhida antes da lavagem/concentração das células (centrifugação pré-contrafluxo). Em geral, demonstramos uma expansão eficiente de hMSC em um sistema de cultura SFM XF, e as células lavadas e concentradas usando o sistema de centrifugação em contrafluxo fechado e automatizado produziram alta recuperação e viabilidade celular pós-lavagem e puderam manter seu fenótipo e funcionalidade. O processo semi-automatizado fechado desenvolvido neste estudo pode fornecer consistência na qualidade do produto em termos de recuperação final do WJ-MSC, como evidenciado a partir de três execuções independentes. Figura 1: Configuração e montagem do kit de uso único de alto fluxo para a colheita, lavagem e concentração de hMSCs . (A) Diagrama do kit após os sacos terem sido conectados em linha com a respectiva tubulação. (B) O balão multicamadas de 10 camadas conectado ao kit de uso único de alto fluxo com o conjunto de tubulação personalizado. (C) Visualização do leito celular fluidizado estável formado na câmara de contrafluxo através da função de câmera habilitada na interface gráfica do usuário do software de centrifugação contrafluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Comparação da morfologia celular e expansão das hMSCs em meio contendo soro e meio SFM XF. (A) A morfologia celular representativa das hMSCs em meio sorológico clássico e meio SFM XF. As células expandidas por SFM XF exibiram uma morfologia mais longa, fusiforme e característica semelhante a fibroblastos, enquanto as células crescidas em meio contendo soro exibiram uma morfologia mais achatada. (B) O tamanho médio das CTM entre o meio contendo soro e o meio SFM XF, medido por um contador automático de células (n = 3). É claro ver que as células expandidas por SFM XF eram geralmente maiores do que as células expandidas pelo soro em diferentes passagens. O rendimento celular total em diferentes passagens (n= 3) (C) em termos de células por área de superfície de cultura e (D) níveis de duplicação populacional. Níveis semelhantes de rendimento celular foram obtidos entre o meio SFM XF e o meio contendo soro em diferentes passagens. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Caracterização das células processadas pelo sistema de centrifugação em contrafluxo . (A) Total de células viáveis antes e após a lavagem e concentração. (B) Uma redução de 10x no volume foi obtida após o processamento de centrifugação em contrafluxo. (C) Recuperação total e viabilidade das células. Os dados são calculados em média em três repetições biológicas (n = 3) de lavagens e concentrações de corridas. Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Análise crítica dos atributos de qualidade . (A) Dados representativos da citometria de fluxo. (B) Imagens representativas mostrando o total de UFC. (C) Imagens microscópicas representativas da diferenciação da trilinhagem. (D) Resultados da análise da expressão de citocinas antes e após o processamento das células no sistema de centrifugação em contrafluxo (n = 3). Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Tabela 1: Sequência da colheita das hMSC por protocolo de tripsinização, lavagem e concentração no sistema de centrifugação em contrafluxo, incluindo as etapas iniciais de condicionamento osmótico. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

Neste trabalho, mostramos a capacidade de fechar e semi-automatizar a dissociação de hMSC e lavar e colher na bancada usando um instrumento de centrifugação contrafluxo. Uma das etapas críticas em todo o fluxo de trabalho é garantir que as tubulações estejam conectadas de acordo com o protocolo predefinido definido no construtor de protocolos do sistema de centrifugação de contrafluxo. A configuração e operação são simples, e o tempo necessário para processar cerca de 2 L de cultura de um frasco de 10 camadas desde a montagem do kit até a colheita celular foi de cerca de 60 min. Uma das etapas limitantes desse fluxo de trabalho é a transferência de fluido do frasco multicamadas para os sacos de transferência conectados ao instrumento de centrifugação em contrafluxo. O kit de uso único de alto fluxo só pode ser executado a uma vazão máxima de 165 mL/min, e isso pode ser um desafio para o processamento, por exemplo, de um frasco de 40 camadas. Para acelerar o processo de transferência de fluidos, bombas externas de alta vazão podem ser usadas para transferir o conteúdo tripsinizado para um saco de transferência primeiro, seguido de lavar/concentrar e colher as células do saco de transferência usando o sistema de centrifugação em contrafluxo. Além disso, este protocolo também pode ser aplicado para células de passagem de frascos multicamadas de 4 camadas para 10 camadas. Mais a montante, o sistema de centrifugação em contrafluxo também pode ser otimizado para a lavagem de hMSCs descongeladas e colheita direta e formulação média em frascos multicamadas para iniciar o trem de sementes. Deve-se notar que o número mínimo de células necessárias para formar o leito fluidizado na câmara de centrifugação em contrafluxo é de aproximadamente 30 milhões de células, e o volume máximo recomendado para processar por lote é de 20 L.

Atualmente, a fixação do conjunto de tubos personalizados ao frasco multicamadas no gabinete de biossegurança e a autoclavagem das partes dos componentes não são desejáveis em uma configuração de GMPc. Como alternativa, um conjunto de tubos esterilizado por gama personalizado poderia ser terceirizado para fornecedores. Os fornecedores que fornecem frascos multicamadas também oferecem a opção de pré-encaixar os frascos com os conjuntos de tubulação desejados, incluindo um filtro de 0,2 μm e esterilização gama de todo o equipamento. Isso garantiria que os frascos de várias camadas e a tubulação anexada fossem realmente fechados, o que significa que o processo poderia ser concluído na bancada em uma configuração de sala limpa Classe C.

Este processo utilizando o sistema de centrifugação em contrafluxo não se limita a células cultivadas com base aderente em um vaso multicamadas e pode ser adaptado a plataformas de expansão de células dinâmicas (tanque agitado ou biorreatores de ondas) e estáticas (permeáveis a gás). Especificamente, para hMSCs expandidas em culturas de microcarreadores 3D, os protocolos podem ser otimizados no sistema de centrifugação de contrafluxo para colher, lavar e formular as hMSCs dissociadas de microportadores.

Em geral, o crescente interesse no desenvolvimento de terapias celulares translacionais com maior robustez e confiabilidade do processo levou ao desenvolvimento de plataformas de processamento celular fechadas e automatizadas. Esses sistemas são imperativos, pois reduzem o número de etapas de manuseio, evitam possíveis contaminações por conexões estéreis e reduzem os custos de fabricação, reduzindo a mão de obra e aumentando o uso efetivo do espaço da sala limpa21. Em consonância com isso, muitos dos desenvolvedores de produtos de terapia celular que estão buscando aprovação regulatória para traduzir suas terapias estão cientes da importância de fechar o processo e implementar a automação total ou semi-automação já na fase de desenvolvimento do processo 14,31,32.

Com o uso de meio SFM XF de fácil regulamentação e juntamente com reagentes auxiliares em conformidade com 21 CFR GMP Parte 11 e diretrizes internacionais de qualidade, esse processo semi-automatizado seria prontamente adequado para fabricação clínica. Mostramos a reprodutibilidade do processo fechado e a manutenção da qualidade das CTMs-WJ. Melhorar a eficiência e a segurança da cultura de células baseadas em aderentes em frascos multicamadas beneficiaria não apenas o campo da terapia hMSC, mas também empresas no banco de linhagens celulares e produção de vírus aderentes.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer o apoio do financiamento do Fundo de Alinhamento da Indústria (IAF-PP) (H18/01/a0/021 e H18/AH/a0/001) da A*STAR, Cingapura.

Materials

2L PVC transfer bag TerumoBCT BB*B200TM
Alcian blue solution, pH 2.5 Merck 101647
Alizarin-Red Staining Solution Merck TMS-008-C
APC anti-human CD73 Antibody Biolegend 344015
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend 400121
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader Bio-Rad
Counterflow Centrifugation System Thermo Fisher Scientific A47679 Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System
Crystal Violet Sigma-aldrich C0775
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific A1286001
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific A1285601 no calcium, no magnesium
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) Thermo Fisher Scientific A27940
CTS TrypLE Select Enzyme Thermo Fisher Scientific A1285901
Custom tubing assembly Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) N/A Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet
Emflon II capsule (0.2um filter) Pall KM5V002P2G100
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12662029 Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions
FGF-basic Thermo Fisher Scientific PHG0024
FITC anti-human CD105 Antibody Biolegend 323203
FITC anti-human CD45 Antibody Biolegend 304005
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody Biolegend 328107
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend 400109
Hi-Flow Single Use Kit Thermo Fisher Scientific A46575 Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min
Multi-layered systems  Thermo Fisher Scientific 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) Nunc Standard Cell Factory Systems
NucleoCounter NC-3000 Chemometec NC-3000
Oil red O staining solution Merck 102419
PDGF-BB Thermo Fisher Scientific PHG0045
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
PerCP anti-human CD34 Antibody Biolegend 343519
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400147
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays Thermo Fisher Scientific Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A 
Sample port Thermo Fisher Scientific A50111 Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher Scientific A10070-01
StemPro Chondrocyte Differentiation Thermo Fisher Scientific A10071-01
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) Thermo Fisher Scientific ME20236L1 Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher Scientific A10072-01
T175 Nunc EasYFlask Thermo Fisher Scientific 159910
T75 Nunc EasYFlask Thermo Fisher Scientific 156472
TGFβ1 Thermo Fisher Scientific PHG9204
WJ MSCs  PromoCell (#C12971; Germany) Human mesenchymal stem cells
αMEM media Thermo Fisher Scientific 12571063 With nucleosides
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Lam, A. T. L., Jayaraman, P., Becker, A., Lim, R., Teo, K. L., Ng, J., Oh, S. Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow. J. Vis. Exp. (193), e64707, doi:10.3791/64707 (2023).
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