Glukan Fosfatazların Substrat Bağlanmasını Ölçmek için Konkanavalin A Bazlı Sedimantasyon Testi
Summary
Bu yöntem, glukan fosfataz ve amilopektinin bağlanma afinitesini ölçmek için lektin bazlı in vitro sedimantasyon testini tanımlar. Bu ko-sedimantasyon testi, glukan fosfataz substrat bağlanmasını ölçmek için güvenilirdir ve çeşitli çözünür glukan substratlarına uygulanabilir.
Abstract
Glukan fosfatazlar, hayvanlarda glikojen ve bitkilerde nişasta gibi glukan substratlarını defosforile eden daha büyük çift özgüllük fosfataz (DSP) ailesine aittir. Glukan fosfatazın model glukan substratları ile kristal yapıları, DSP ve karbonhidrat bağlama alanlarından yapılmış farklı glukan bağlayıcı arayüzler ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, fizyolojik olarak ilgili substratlarla glukan-glukan fosfataz etkileşimlerinin kantitatif ölçümleri, glukan fosfataz enzim ailesinin biyolojik olarak anlaşılması ve enerji metabolizmasının düzenlenmesi için temeldir. Bu makalede, glukan fosfatazların farklı glukan substratlarına karşı substrat bağlanma afinitesini tespit etmek için tasarlanmış bir Concanavalin A (ConA) bazlı in vitro sedimantasyon testi bildirilmiştir. Kavramın bir kanıtı olarak, glukan fosfataz Arabidopsis thaliana Nişasta Fazlalığı4 (SEX4) ve amilopektinin ayrışma sabiti (KD) belirlendi. SEX4 mutantlarının ve glukan fosfataz enzim ailesinin diğer üyelerinin karakterizasyonu, protein-karbonhidrat etkileşimlerinin diferansiyel bağlanmasını değerlendirmek için bu tahlilin yararlılığını göstermektedir. Bu veriler, bu tahlilin çok çeşitli nişasta ve glikojen etkileşen proteinleri karakterize etmeye uygunluğunu göstermektedir.
Introduction
Glukan fosfatazlar, protein tirozin fosfataz (PTP) üst ailesi1 içindeki çift özgüllüklü fosfatazların (DSP’ler) fonksiyonel olarak farklı bir alt ailesinin üyeleridir. Geniş ölçüde farklı fotosentetik organizmalar, insanlar, omurgalılar ve bazı omurgasızlar ve protistler de dahil olmak üzere çoğu yaşam formunda bulunmuştur 2,3,4. Bitkiler bilinen üç glukan fosfataz içerir: Nişasta Fazlalığı4 (SEX4), Seks Dörtlüsü 1 (LSF1) ve Seks Dörtlüsü (LSF2) Gibi5,6,7. Glukan fosfatazları olmayan bitkiler, geçici nişasta bozunma ve yapraklarda nişasta birikimi oranlarının azaldığını göstermektedir 8,9. Laforin, omurgalılarda ve insanlarda glikojen defosforilleri defosforile eden glukan fosfataz ailesinin kurucu üyesidir 3,10. Laforinin mutasyonları, epilepsinin ölümcül otozomal resesif bir formu olan nörodejeneratif Lafora hastalığı ile sonuçlanır11. Glukan fosfatazlar glikojen ve nişasta metabolizması için gereklidir ve bitkilerde nişasta içeriğini modüle etmek ve nörodejeneratif Lafora hastalığının tedavisinde önemli enzimler olarak ortaya çıkmıştır12,13. Model glukan substratlı glukan fosfatazlar üzerine yapılan son X-ışını kristalografi çalışmaları, substrat bağlanmasına ve glukan defosforilasyonunun katalitik mekanizmasına ışık tutmuştur14,15,16,17. Bununla birlikte, glukan fosfatazların fizyolojik substratlarına nasıl bağlandığına dair mevcut anlayış eksiktir.
Nişasta,% 80-90 amilopektin ve% 10-20 amilozdan yapılmış çözünmez bir glikoz polimeridir18. Bitki glukan fosfatazları için substratlar, glikojen ve nişasta granülleri gibi fosforile karbonhidrat molekülleridir. Fosforile glukozil kalıntıları 1:600 fosfat:glukozil kalıntı oranında bulunur. İlginç bir şekilde, fosfatlar sadece amilopektin molekülleri19’da bulunur. Ana bitki glukan fosfataz SEX4, amilopektin moleküllerini defosforile etmek için nişasta granülü üzerinde hareket eder. SEX4’ün X-ışını kristal yapısı, yapı kılavuzlu mutajenez çalışmaları ile birleştiğinde, bir glukan yapısı15 içindeki farklı pozisyonlar için SEX4’ün benzersiz substrat özelliklerini göstermiştir. Son zamanlarda, SEX4’ün biyolojik olarak ilgili aktivitesinin sadece çözünür amilopektin substratları20 üzerinde hareket ederken gözlemlenebileceğini gösterdik. Bununla birlikte, glukan-SEX4 etkileşimlerini anlamanın, substratın yapısal karmaşıklığı, daha geniş bağlanma özgüllükleri ve protein ile substratları arasındaki düşük bağlanma afiniteleri nedeniyle zor olduğu kanıtlanmıştır. Bu sorunlar, izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC), nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tabanlı testler gibi protein-ligand etkileşimlerinde yaygın olarak kullanılan yöntemleri kullanma yeteneğini engellemiştir.
İlginçtir ki, karbonhidrat-protein etkileşimleri hakkındaki anlayışımızın çoğu, lektinleri incelemekten gelmiştir. Concanavalin A (ConA), orijinal olarak jack fasulyesinden ekstrakte edilen bir baklagil lektin protein ailesidir. ConA, karbonhidratları yüksek özgüllükle bağlar, bu da ilaç hedefleme ve dağıtım uygulamalarında kullanımı için avantajlıdır. ConA’nın indirgeyici olmayan α-D-mannosil ve α-D-glukozil içeren çeşitli substratlara bağlanması kapsamlı bir şekilde incelenmiştir19,20. Ticari olarak temin edilebilen ConA’ya bağlı Sefaroz boncukları, glikoproteinleri ve glikolipidleri saflaştırmak için yaygın olarak kullanılır21. ConA, glikoz kalıntılarının C3, C4 ve C6 hidroksil grupları aracılığıyla bu glukanlara bağlanır. ConA-Sefaroz boncukları ayrıca glikojen-protein ve nişasta-protein etkileşimlerinin bağlanmasını ölçmek için başarıyla kullanılmıştır22,23. Bu çalışmada, glukan fosfataz-amilopektin etkileşimlerinin bağlanma özelliklerini ölçmek için bağlayıcı bir tahlil geliştirmek için ConA-Sefaroz boncuklarını kullandık.
Daha önce, glukan fosfataz substrat bağlanma kabiliyetini 14,20,24 değerlendirmek için ConA bazlı bir sedimantasyon testi kullanılmıştır. Bu çalışmada, aynı strateji, glukan-glukan fosfataz ve karbonhidrat etkileşimlerinin bağlanma afinitesini belirlemek için yeni bir yöntem geliştirmek için kullanılmıştır. Bu yöntem aynı zamanda çeşitli çözünür karbonhidrat-protein etkileşimlerini araştırmak için bir avantaja sahiptir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, glukan-glukan fosfataz etkileşimlerinin bağlanma afinitesinin belirlenmesine izin veren yeni bir in vitro sedimantasyon testinin başarılı bir şekilde geliştirildiğini göstermektedir. Tahlil tasarımı, lektin ConA’nın glikozun hidroksil kalıntıları yoluyla glukanlara spesifik olarak bağlanmasından yararlanarak, çözünür karbonhidrat substratlarını Sefaroz boncuklarına dolaylı olarak yakalar. Bu, bağlı ve bağlanmamış protein fraksiyonlarının santrifüjleme …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı ödülü MCB-2012074 tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, Florida Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Bölümü’nden Dr. Craig W. Vander Kooi’ye değerli tartışmalar ve destekler için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Florida Üniversitesi Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Bölümü’nden Dr. Matthew S. Gentry’ye desteği için teşekkür eder. Skidmore College Neuroscience programının başkanı Dr. Sara Lagalwar’a, batı leke görüntülemesi için LICOR C basamaklı leke tarayıcısını kullanmamıza izin verdiği için teşekkür ederiz.
Materials
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
References
- Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
- Gentry, M. S., et al. The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease. The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).
- Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).
- Gentry, M. S., Pace, R. M. Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism. BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).
- Niittyla, T., et al. Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).
- Kotting, O., et al. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).
- Comparot-Moss, S., et al. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves. Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).
- Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).
- Kotting, O., et al. Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase. Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).
- Tagliabracci, V. S., et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).
- Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).
- Brewer, M. K., et al. Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion. Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).
- Santelia, D., Zeeman, S. C. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).
- Raththagala, M., et al. Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease. Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).
- Meekins, D. A., et al. Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).
- Vander Kooi, C. W., et al. Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).
- Meekins, D. A., et al. Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation. The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth. Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).
- Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. Phosphorus in rice and other starches. Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).
- Mak, C. A., et al. Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4. Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H. Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).
- Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction. Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).
- Meekins, D. A., et al. Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates. The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).
- Wilkens, C., et al. Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose. FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).
- Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).
- Doyle, M. L. Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).
