Summary

Седиментационный анализ на основе конканавалина А для измерения связывания субстрата глюканфосфатаз

Published: December 23, 2022
doi:

Summary

Этот метод описывает анализ седиментации in vitro на основе лектина для количественной оценки сродства связывания глюканфосфатазы и амилопектина. Этот анализ совместного седиментации надежен для измерения связывания субстрата глюканфосфатазы и может применяться к различным солюбилизированным глюкановым субстратам.

Abstract

Глюканфосфатазы принадлежат к более крупному семейству фосфатаз двойной специфичности (DSP), которые дефосфорилируют субстраты глюканов, такие как гликоген у животных и крахмал у растений. Кристаллические структуры глюканфосфатазы с модельными глюкановыми субстратами показывают отчетливые интерфейсы связывания глюканов, состоящие из DSP и углеводсвязывающих доменов. Однако количественные измерения взаимодействия глюкан-глюканфосфатазы с физиологически значимыми субстратами имеют основополагающее значение для биологического понимания семейства ферментов глюканфосфатазы и регуляции энергетического обмена. В этой рукописи сообщается об анализе седиментации in vitro на основе конканавалина А (ConA), предназначенном для определения аффинности связывания субстрата глюканфосфатаз с различными глюкановыми субстратами. В качестве доказательства концепции была определена константа диссоциации (KD) глюканфосфатазы Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) и амилопектина. Характеристика мутантов SEX4 и других членов семейства ферментов глюканфосфатазы еще раз демонстрирует полезность этого анализа для оценки дифференциального связывания белок-углеводных взаимодействий. Эти данные демонстрируют пригодность этого анализа для характеристики широкого спектра белков, взаимодействующих с крахмалом и гликогеном.

Introduction

Глюканфосфатазы являются членами функционально разнообразного подсемейства фосфатаз двойной специфичности (DSP) в суперсемействе белковой тирозинфосфатазы (PTP)1. Они были обнаружены в большинстве форм жизни, включая широко расходящиеся фотосинтезирующие организмы, людей, позвоночных и некоторых беспозвоночных и простейших 2,3,4. Растения содержат три известные глюканфосфатазы: избыток крахмала4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) и Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Растения, в которых отсутствует глюканфосфатаза, демонстрируют пониженные скорости преходящей деградации крахмала и накопления крахмала в листьях 8,9. Лафорин является членом-основателем семейства глюканфосфатаз, которые дефосфорилируют гликоген у позвоночных и человека 3,10. Мутации лафорина приводят к нейродегенеративной болезни Лафора, фатальной аутосомно-рецессивной форме эпилепсии11. Глюканфосфатазы необходимы для метаболизма гликогена и крахмала и стали важными ферментами для модуляции содержания крахмала в растениях и лечения нейродегенеративной болезни Лафора12,13. Недавние рентгеновские кристаллографические исследования глюканфосфатаз с модельными глюкановыми субстратами пролили свет на связывание субстрата и каталитический механизм дефосфорилирования глюкана14,15,16,17. Однако нынешнее понимание того, как глюканфосфатазы связываются со своими физиологическими субстратами, является неполным.

Крахмал представляет собой нерастворимый полимер глюкозы, состоящий из 80-90% амилопектина и 10-20% амилозы18. Субстратами для растительных глюканфосфатаз являются фосфорилированные молекулы углеводов, такие как гранулы гликогена и крахмала. Фосфорилированные остатки глюкозила присутствуют в соотношении 1:600 фосфат к глюкозильному остатку. Интересно, что фосфаты присутствуют только на молекулах амилопектина19. Основная растительная глюканфосфатаза SEX4 действует на гранулы крахмала, дефосфорилируя молекулы амилопектина. Рентгеновская кристаллическая структура SEX4 в сочетании с структурно-ориентированными исследованиями мутагенеза продемонстрировала уникальную специфичность субстрата SEX4 для различных положений в структуре глюкана15. Недавно мы показали, что биологически значимая активность SEX4 может наблюдаться только при воздействии на его солюбилизированные амилопектиновые субстраты20. Однако понимание взаимодействий глюкан-SEX4 оказалось трудным из-за структурной сложности субстрата, более широкой специфики связывания и низкого сродства связывания между белком и его субстратами. Эти проблемы препятствовали возможности использования методов, обычно используемых в белково-лигандных взаимодействиях, таких как изотермическая титрационная калориметрия (ITC), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и анализы на основе иммуноферментного анализа (ИФА).

Интересно, что большая часть нашего понимания углеводно-белковых взаимодействий пришла из изучения лектинов. Конканавалин А (ConA) представляет собой семейство белков лектина бобовых, первоначально извлеченных из бобов. ConA связывает углеводы с высокой специфичностью, что выгодно для его использования в нацеливании и доставке лекарств. Широко изучено связывание ConA с различными субстратами, содержащими невосстанавливающие α-D-маннозил и α-D-глюкозил19,20. Коммерчески доступные гранулы сефарозы, связанные с ConA, обычно используются для очистки гликопротеинов и гликолипидов21. ConA связывается с этими глюканами через гидроксильные группы C3, C4 и C6 остатков глюкозы. Шарики ConA-сефарозы также успешно использовались для измерения связывания взаимодействия гликоген-белок и крахмал-белок22,23. В этом исследовании мы использовали шарики ConA-сефарозы для разработки анализа связывания для измерения специфичности связывания взаимодействия глюканфосфатазы и амилопектина.

Ранее для оценки способности связывания субстрата глюканфосфатазы использовался седиментационный анализна основе ConA 14,20,24. В этом исследовании та же стратегия была использована для разработки нового метода определения аффинности связывания глюкан-глюканфосфатазы и углеводных взаимодействий. Этот метод также имеет преимущество для исследования различных солюбилизированных углеводно-белковых взаимодействий.

Protocol

1. Приготовление шариков ConA-Sepharose Сделайте 250 мл связывающего буфера, содержащего 67 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl2 и0,2 мМ CaCl2. Отрегулируйте рН с помощью 1 М раствора NaOH. Пипетка 250 мкл суспензии шариков ConA-сефарозы в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугир?…

Representative Results

Одной из ключевых особенностей семейства белков глюканфосфатазы является их способность связываться с глюкановыми субстратами. Во-первых, связывающая способность SEX4 с шариками ConA-сефарозы: амилопектина была проанализирована с использованием SDS-PAGE (рис. 2A). Бычий сывор?…

Discussion

Это исследование демонстрирует успешную разработку нового седиментационного анализа in vitro , который позволяет определить аффинность связывания взаимодействий глюкан-глюканфосфатазы. В дизайне анализа используется специфическое связывание лектина ConA с глюканами через гид?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано премией Национального научного фонда MCB-2012074. Авторы благодарят доктора Крейга В. Вандера Кооя из Университета Флориды за ценные дискуссии и поддержку. Авторы также благодарят доктора Мэтью С. Джентри с факультета биохимии и молекулярной биологии Университета Флориды за его поддержку. Мы хотели бы поблагодарить доктора Сару Лагалвар, председателя программы неврологии колледжа Скидмор, за то, что она позволила нам использовать сканер блоттинга LICOR C-digit для визуализации вестерн-блоттинга.

Materials

6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP Therm Fisher Scientific MA1-21315-HRP
Biorad gel electrophoresis and Western blot kit Biorad  1703930
Calcium chloride Sigma-Aldrich 208291
C-Digit blot scanner LICOR 3600-00 Blot scanner
Complete protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836170001
Concanavalin A-sepharose beads Sigma-Aldrich C9017 This product contains  in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol 
Centrifuge Eppendorf  5425R
Glycine Fisher Scientific BP381-5
GraphPad Prism 8.0 software GraphPad  Version 8.0 Data analysis software 
HEPES Sigma-Aldrich H8651
Image Studio LICOR 3600-501 Acquisition Software
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M2670
Methanol Fisher Scientific A452SK-4
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific PI28312
Potato amylopectin Sigma-Aldrich A8515
Precast SDSPAGE Gels Genscript M00653S
Tris base Fisher Scientific BP154-1
Tween 20 Fisher Scientific MP1TWEEN201
Westernsure premium chemiluminescence substrate  LI-COR  926-95000

References

  1. Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
  2. Gentry, M. S., et al. The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease. The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).
  3. Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).
  4. Gentry, M. S., Pace, R. M. Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism. BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).
  5. Niittyla, T., et al. Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).
  6. Kotting, O., et al. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).
  7. Comparot-Moss, S., et al. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves. Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).
  8. Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).
  9. Kotting, O., et al. Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase. Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).
  10. Tagliabracci, V. S., et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).
  11. Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).
  12. Brewer, M. K., et al. Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion. Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).
  13. Santelia, D., Zeeman, S. C. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).
  14. Raththagala, M., et al. Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease. Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).
  15. Meekins, D. A., et al. Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).
  16. Vander Kooi, C. W., et al. Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).
  17. Meekins, D. A., et al. Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation. The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).
  18. Smith, A. M., Zeeman, S. C. Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth. Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).
  19. Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. Phosphorus in rice and other starches. Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).
  20. Mak, C. A., et al. Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4. Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).
  21. Campbell, K. P., MacLennan, D. H. Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).
  22. Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).
  23. Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction. Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).
  24. Meekins, D. A., et al. Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates. The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).
  25. Wilkens, C., et al. Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose. FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).
  26. Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).
  27. Doyle, M. L. Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).

Play Video

Cite This Article
Wolpaw, E. M., Frenett, M. L., Mak, C. A., Zwanger, S. M., Raththagala, M. Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases. J. Vis. Exp. (190), e64700, doi:10.3791/64700 (2022).

View Video