Седиментационный анализ на основе конканавалина А для измерения связывания субстрата глюканфосфатаз
Summary
Этот метод описывает анализ седиментации in vitro на основе лектина для количественной оценки сродства связывания глюканфосфатазы и амилопектина. Этот анализ совместного седиментации надежен для измерения связывания субстрата глюканфосфатазы и может применяться к различным солюбилизированным глюкановым субстратам.
Abstract
Глюканфосфатазы принадлежат к более крупному семейству фосфатаз двойной специфичности (DSP), которые дефосфорилируют субстраты глюканов, такие как гликоген у животных и крахмал у растений. Кристаллические структуры глюканфосфатазы с модельными глюкановыми субстратами показывают отчетливые интерфейсы связывания глюканов, состоящие из DSP и углеводсвязывающих доменов. Однако количественные измерения взаимодействия глюкан-глюканфосфатазы с физиологически значимыми субстратами имеют основополагающее значение для биологического понимания семейства ферментов глюканфосфатазы и регуляции энергетического обмена. В этой рукописи сообщается об анализе седиментации in vitro на основе конканавалина А (ConA), предназначенном для определения аффинности связывания субстрата глюканфосфатаз с различными глюкановыми субстратами. В качестве доказательства концепции была определена константа диссоциации (KD) глюканфосфатазы Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) и амилопектина. Характеристика мутантов SEX4 и других членов семейства ферментов глюканфосфатазы еще раз демонстрирует полезность этого анализа для оценки дифференциального связывания белок-углеводных взаимодействий. Эти данные демонстрируют пригодность этого анализа для характеристики широкого спектра белков, взаимодействующих с крахмалом и гликогеном.
Introduction
Глюканфосфатазы являются членами функционально разнообразного подсемейства фосфатаз двойной специфичности (DSP) в суперсемействе белковой тирозинфосфатазы (PTP)1. Они были обнаружены в большинстве форм жизни, включая широко расходящиеся фотосинтезирующие организмы, людей, позвоночных и некоторых беспозвоночных и простейших 2,3,4. Растения содержат три известные глюканфосфатазы: избыток крахмала4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) и Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Растения, в которых отсутствует глюканфосфатаза, демонстрируют пониженные скорости преходящей деградации крахмала и накопления крахмала в листьях 8,9. Лафорин является членом-основателем семейства глюканфосфатаз, которые дефосфорилируют гликоген у позвоночных и человека 3,10. Мутации лафорина приводят к нейродегенеративной болезни Лафора, фатальной аутосомно-рецессивной форме эпилепсии11. Глюканфосфатазы необходимы для метаболизма гликогена и крахмала и стали важными ферментами для модуляции содержания крахмала в растениях и лечения нейродегенеративной болезни Лафора12,13. Недавние рентгеновские кристаллографические исследования глюканфосфатаз с модельными глюкановыми субстратами пролили свет на связывание субстрата и каталитический механизм дефосфорилирования глюкана14,15,16,17. Однако нынешнее понимание того, как глюканфосфатазы связываются со своими физиологическими субстратами, является неполным.
Крахмал представляет собой нерастворимый полимер глюкозы, состоящий из 80-90% амилопектина и 10-20% амилозы18. Субстратами для растительных глюканфосфатаз являются фосфорилированные молекулы углеводов, такие как гранулы гликогена и крахмала. Фосфорилированные остатки глюкозила присутствуют в соотношении 1:600 фосфат к глюкозильному остатку. Интересно, что фосфаты присутствуют только на молекулах амилопектина19. Основная растительная глюканфосфатаза SEX4 действует на гранулы крахмала, дефосфорилируя молекулы амилопектина. Рентгеновская кристаллическая структура SEX4 в сочетании с структурно-ориентированными исследованиями мутагенеза продемонстрировала уникальную специфичность субстрата SEX4 для различных положений в структуре глюкана15. Недавно мы показали, что биологически значимая активность SEX4 может наблюдаться только при воздействии на его солюбилизированные амилопектиновые субстраты20. Однако понимание взаимодействий глюкан-SEX4 оказалось трудным из-за структурной сложности субстрата, более широкой специфики связывания и низкого сродства связывания между белком и его субстратами. Эти проблемы препятствовали возможности использования методов, обычно используемых в белково-лигандных взаимодействиях, таких как изотермическая титрационная калориметрия (ITC), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и анализы на основе иммуноферментного анализа (ИФА).
Интересно, что большая часть нашего понимания углеводно-белковых взаимодействий пришла из изучения лектинов. Конканавалин А (ConA) представляет собой семейство белков лектина бобовых, первоначально извлеченных из бобов. ConA связывает углеводы с высокой специфичностью, что выгодно для его использования в нацеливании и доставке лекарств. Широко изучено связывание ConA с различными субстратами, содержащими невосстанавливающие α-D-маннозил и α-D-глюкозил19,20. Коммерчески доступные гранулы сефарозы, связанные с ConA, обычно используются для очистки гликопротеинов и гликолипидов21. ConA связывается с этими глюканами через гидроксильные группы C3, C4 и C6 остатков глюкозы. Шарики ConA-сефарозы также успешно использовались для измерения связывания взаимодействия гликоген-белок и крахмал-белок22,23. В этом исследовании мы использовали шарики ConA-сефарозы для разработки анализа связывания для измерения специфичности связывания взаимодействия глюканфосфатазы и амилопектина.
Ранее для оценки способности связывания субстрата глюканфосфатазы использовался седиментационный анализна основе ConA 14,20,24. В этом исследовании та же стратегия была использована для разработки нового метода определения аффинности связывания глюкан-глюканфосфатазы и углеводных взаимодействий. Этот метод также имеет преимущество для исследования различных солюбилизированных углеводно-белковых взаимодействий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование демонстрирует успешную разработку нового седиментационного анализа in vitro , который позволяет определить аффинность связывания взаимодействий глюкан-глюканфосфатазы. В дизайне анализа используется специфическое связывание лектина ConA с глюканами через гид?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано премией Национального научного фонда MCB-2012074. Авторы благодарят доктора Крейга В. Вандера Кооя из Университета Флориды за ценные дискуссии и поддержку. Авторы также благодарят доктора Мэтью С. Джентри с факультета биохимии и молекулярной биологии Университета Флориды за его поддержку. Мы хотели бы поблагодарить доктора Сару Лагалвар, председателя программы неврологии колледжа Скидмор, за то, что она позволила нам использовать сканер блоттинга LICOR C-digit для визуализации вестерн-блоттинга.
Materials
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
References
- Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
- Gentry, M. S., et al. The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease. The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).
- Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).
- Gentry, M. S., Pace, R. M. Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism. BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).
- Niittyla, T., et al. Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).
- Kotting, O., et al. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).
- Comparot-Moss, S., et al. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves. Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).
- Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).
- Kotting, O., et al. Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase. Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).
- Tagliabracci, V. S., et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).
- Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).
- Brewer, M. K., et al. Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion. Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).
- Santelia, D., Zeeman, S. C. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).
- Raththagala, M., et al. Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease. Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).
- Meekins, D. A., et al. Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).
- Vander Kooi, C. W., et al. Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).
- Meekins, D. A., et al. Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation. The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth. Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).
- Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. Phosphorus in rice and other starches. Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).
- Mak, C. A., et al. Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4. Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H. Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).
- Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction. Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).
- Meekins, D. A., et al. Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates. The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).
- Wilkens, C., et al. Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose. FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).
- Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).
- Doyle, M. L. Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).
