Concanavaline A-gebaseerde sedimentatietest om substraatbinding van glucaanfosfatasen te meten
Summary
Deze methode beschrijft een op lectine gebaseerde in vitro sedimentatietest om de bindingsaffiniteit van glucaanfosfatase en amylopectine te kwantificeren. Deze co-sedimentatietest is betrouwbaar voor het meten van glucaanfosfatasesubstraatbinding en kan worden toegepast op verschillende opgeloste glucaansubstraten.
Abstract
Glucaanfosfatasen behoren tot de grotere familie van dual specificity phosfatases (DSP) die glucaansubstraten defosforyleren, zoals glycogeen bij dieren en zetmeel in planten. De kristalstructuren van glucaanfosfatase met modelglucaansubstraten onthullen verschillende glucaanbindende interfaces gemaakt van DSP- en koolhydraatbindende domeinen. Kwantitatieve metingen van glucaan-glucaanfosfatase-interacties met fysiologisch relevante substraten zijn echter fundamenteel voor het biologische begrip van de glucaanfosfatasefamilie van enzymen en de regulatie van het energiemetabolisme. Dit manuscript rapporteert een op Concanavaline A (ConA) gebaseerde in vitro sedimentatietest die is ontworpen om de substraatbindingsaffiniteit van glucaanfosfatasen tegen verschillende glucaansubstraten te detecteren. Als proof of concept werd de dissociatieconstante (KD) van glucaanfosfatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) en amylopectine bepaald. De karakterisering van SEX4-mutanten en andere leden van de glucaanfosfatasefamilie van enzymen toont verder het nut van deze test aan om de differentiële binding van eiwit-koolhydraatinteracties te beoordelen. Deze gegevens tonen de geschiktheid van deze test aan om een breed scala aan zetmeel- en glycogeeninteragerende eiwitten te karakteriseren.
Introduction
Glucaanfosfatasen zijn leden van een functioneel diverse onderfamilie van duale specificiteitsfosfatasen (DSP’s) binnen de eiwit tyrosinefosfatase (PTP) superfamilie1. Ze zijn gevonden in de meeste levensvormen, waaronder sterk uiteenlopende fotosynthetische organismen, mensen, gewervelde dieren en sommige ongewervelde dieren en protisten 2,3,4. Planten bevatten drie bekende glucaanfosfatasen: Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) en Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Planten zonder glucaanfosfatasen vertonen een verminderde snelheid van tijdelijke zetmeelafbraak en ophoping van zetmeel in de bladeren 8,9. Laforin is de stichtende van de glucaanfosfatasefamilie die glycogeen defosforyleert bij gewervelde dieren en mensen 3,10. De mutaties van laforine resulteren in neurodegeneratieve ziekte van Lafora, een fatale autosomaal recessieve vorm van epilepsie11. Glucaanfosfatasen zijn nodig voor het glycogeen- en zetmeelmetabolisme en zijn naar voren gekomen als belangrijke enzymen voor het moduleren van het zetmeelgehalte in planten en de behandeling van neurodegeneratieve ziekte van Lafora12,13. Recente röntgenkristallografiestudies op glucaanfosfatasen met modelglucaansubstraten hebben licht geworpen op substraatbinding en het katalytische mechanisme van glucaandefosforylering14,15,16,17. Het huidige begrip van hoe glucaanfosfatasen binden aan hun fysiologische substraten is echter onvolledig.
Zetmeel is een onoplosbaar polymeer van glucose gemaakt van 80% -90% amylopectine en 10% -20% amylose18. De substraten voor plantaardige glucaanfosfatasen zijn gefosforyleerde koolhydraatmoleculen, zoals glycogeen- en zetmeelkorrels. De gefosforyleerde glucosylresiduen zijn aanwezig in een verhouding van 1:600 fosfaat:glucosylresidu. Interessant is dat de fosfaten alleen aanwezig zijn op de amylopectinemoleculen19. De belangrijkste plant glucaanfosfatase SEX4 werkt op de zetmeelkorrel om amylopectinemoleculen te defosforyleren. De röntgenkristalstructuur van SEX4 in combinatie met structuurgeleide mutagenesestudies heeft de unieke substraatspecificiteiten van SEX4 aangetoond voor verschillende posities binnen een glucaanstructuur15. We hebben onlangs aangetoond dat de biologisch relevante activiteit van SEX4 alleen kan worden waargenomen wanneer het inwerkt op de opgeloste amylopectinesubstraten20. Het begrijpen van glucaan-SEX4-interacties is echter moeilijk gebleken vanwege de structurele complexiteit van het substraat, bredere bindingsspecificaties en lage bindingsaffiniteiten tussen het eiwit en zijn substraten. Deze problemen hebben het vermogen belemmerd om methoden te gebruiken die vaak worden gebruikt in eiwit-ligandinteracties, zoals isothermische titratiecalorimetrie (ITC), nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) -gebaseerde assays.
Interessant is dat veel van ons begrip van koolhydraat-eiwitinteracties afkomstig is van het bestuderen van lectines. Concanavalin A (ConA) is een peulvrucht lectine familie van eiwitten oorspronkelijk geëxtraheerd uit de jack boon. ConA bindt koolhydraten met een hoge specificiteit, wat voordelig is voor het gebruik ervan in toepassingen voor het richten en afleveren van geneesmiddelen. De binding van ConA aan een verscheidenheid aan substraten die niet-reducerend α-D-mannosyl en α-D-glucosyl bevatten, is uitgebreid bestudeerd19,20. In de handel verkrijgbare ConA-gebonden Sepharose-kralen worden vaak gebruikt om glycoproteïnen en glycolipiden te zuiveren21. ConA bindt aan deze glucanen via C3-, C4- en C6-hydroxylgroepen van de glucoseresiduen. ConA-Sepharose kralen zijn ook met succes gebruikt om de binding van glycogeen-eiwit en zetmeel-eiwit interacties te meten22,23. In deze studie gebruikten we ConA-Sepharose-kralen om een bindingstest te ontwikkelen om de bindingsspecificiteiten van glucaanfosfatase-amylopectine-interacties te meten.
Eerder werd een op ConA gebaseerde sedimentatietest gebruikt om het bindingsvermogen van glucaanfosfatasesubstraat te beoordelen14,20,24. In deze studie werd dezelfde strategie gebruikt om een nieuwe methode te ontwikkelen om de bindingsaffiniteit van glucaan-glucaanfosfatase en koolhydraatinteracties te bepalen. Deze methode heeft ook een voordeel voor het onderzoeken van verschillende opgeloste koolhydraat-eiwitinteracties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie toont de succesvolle ontwikkeling van een nieuwe in vitro sedimentatietest waarmee de bindingsaffiniteit van glucaan-glucaanfosfatase-interacties kan worden bepaald. Het testontwerp maakt gebruik van de specifieke binding van lectine ConA aan glucanen via de hydroxylresiduen van glucose om indirect opgeloste koolhydraatsubstraten op Sepharose-kralen te vangen. Dit maakt de scheiding van gebonden en ongebonden eiwitfracties via centrifugatie en bepaling van de bindingsaffiniteit van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de National Science Foundation award MCB-2012074. De auteurs bedanken Dr. Craig W. Vander Kooi van de University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology voor waardevolle discussies en ondersteuning. De auteurs bedanken ook Dr. Matthew S. Gentry van de University of Florida Department of Biochemistry and Molecular Biology voor zijn steun. We willen Dr. Sara Lagalwar, voorzitter van het Skidmore College Neuroscience-programma, bedanken voor het feit dat ze ons in staat heeft gesteld om de LICOR C-digit blot-scanner te gebruiken voor western blot-beeldvorming.
Materials
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
References
- Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
- Gentry, M. S., et al. The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease. The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).
- Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).
- Gentry, M. S., Pace, R. M. Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism. BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).
- Niittyla, T., et al. Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).
- Kotting, O., et al. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).
- Comparot-Moss, S., et al. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves. Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).
- Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).
- Kotting, O., et al. Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase. Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).
- Tagliabracci, V. S., et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).
- Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).
- Brewer, M. K., et al. Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion. Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).
- Santelia, D., Zeeman, S. C. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).
- Raththagala, M., et al. Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease. Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).
- Meekins, D. A., et al. Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).
- Vander Kooi, C. W., et al. Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).
- Meekins, D. A., et al. Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation. The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth. Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).
- Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. Phosphorus in rice and other starches. Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).
- Mak, C. A., et al. Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4. Biochemistry. 60 (31), 2425-2435 (2021).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H. Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).
- Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction. Biochemistry. 15 (3), 704-713 (1976).
- Meekins, D. A., et al. Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates. The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).
- Wilkens, C., et al. Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose. FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).
- Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).
- Doyle, M. L. Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).
