Gli osteoclasti sono cellule chiave che riassorbono le ossa nel corpo. Questo protocollo descrive un metodo affidabile per la differenziazione in vitro degli osteoclasti dai monociti del sangue periferico umano. Questo metodo può essere utilizzato come uno strumento importante per comprendere ulteriormente la biologia degli osteoclasti nell’omeostasi e nelle malattie.
Gli osteoclasti (OC) sono cellule che riassorbono l’osso e svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo scheletrico e nel rimodellamento osseo adulto. Diversi disturbi ossei sono causati da una maggiore differenziazione e attivazione degli OC, quindi l’inibizione di questa patobiologia è un principio terapeutico chiave. Due fattori chiave guidano la differenziazione degli OC dai precursori mieloidi: il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e l’attivatore del recettore del ligando kappa-B del fattore nucleare (RANKL). I monociti CD14+ circolanti umani sono noti da tempo per differenziarsi in OC in vitro. Tuttavia, il tempo di esposizione e la concentrazione di RANKL influenzano l’efficienza di differenziazione. In effetti, sono stati descritti protocolli per la generazione di OC umani in vitro , ma spesso si traducono in un processo di differenziazione scarso e lungo. Qui viene fornito un protocollo robusto e standardizzato per generare OC umani maturi funzionalmente attivi in modo tempestivo. I monociti CD14+ sono arricchiti da cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) e innescati con M-CSF per sovraregolare RANK. La successiva esposizione a RANKL genera OC in modo dipendente dalla dose e dal tempo. Gli OC sono identificati e quantificati mediante colorazione con fosfatasi resistente agli acidi tartrati (TRAP) e analisi al microscopio ottico. La colorazione a immunofluorescenza dei nuclei e della F-actina viene utilizzata per identificare OC funzionalmente attivi. Inoltre, gli OC maturi OSCAR+CD14− sono ulteriormente arricchiti attraverso la selezione delle cellule di citometria a flusso e la funzionalità OC quantificata mediante saggi di riassorbimento minerale (o dentina/osso) e formazione di anelli di actina. Infine, un noto inibitore OC, il rotenone, viene utilizzato su OC maturi, dimostrando che la produzione di adenosina trifosfato (ATP) è essenziale per l’integrità dell’anello di actina e la funzione OC. In conclusione, in questo lavoro viene stabilito un robusto saggio per differenziare un numero elevato di OC, che in combinazione con la colorazione dell’anello di actina e un test ATP fornisce un utile modello in vitro per valutare la funzione OC e per lo screening di nuovi composti terapeutici in grado di modulare il processo di differenziazione.
Gli osteoclasti (OC) sono cellule giganti multinucleate di linea ematopoietica con una capacità unica di riassorbire l’osso. Sono responsabili dello sviluppo e del continuo rimodellamento dello scheletro 1,2. Nelle fasi scheletriche dello sviluppo, gli OC e i macrofagi residenti nei tessuti derivano da progenitori eritro-mieloidi e colonizzano la nicchia ossea e i tessuti degli organi. In condizioni fisiologiche, i progenitori eritromieloidi sono necessari per il normale sviluppo osseo e l’eruzione dei denti, mentre l’afflusso di monociti circolanti nella nicchia ossea fornisce il mantenimento postnatale degli OC, della massa ossea e della cavità del midollo osseo3. In condizioni patologiche, i monociti vengono reclutati in siti di infiammazione attiva e possono contribuire alla distruzione ossea patologica 4,5.
I pazienti con diverse forme di artrite sperimentano infiammazione articolare, che porta alla progressiva distruzione articolare causata da OCs6. Ad esempio, nell’artrite reumatoide (RA), gli OC iperattivati sono responsabili dell’erosione ossea patologica e della distruzione articolare 7,8 e i trattamenti attuali spesso non migliorano o arrestano il danno osseo 9,10,11. Alterazioni dei monociti circolanti sia in termini di distribuzione della popolazione che di firme trascrittomiche ed epigenetiche sono state riportate nei pazienti con AR12,13,14. Inoltre, è stato riportato che le risposte alterate dei monociti alla stimolazione infiammatoria influenzano l’osteoclastogenesi nei pazienti con AR con malattia attiva15,16,17.
La differenziazione delle OC è un complesso processo a più fasi che comprende l’impegno delle cellule precursori mieloidi nella differenziazione in precursori OC. Durante l’osteoclastogenesi, gli OC diventano giganti e multinucleati attraverso la fusione cellula-cellula, citochinesi incompleta e un processo di riciclaggio nucleare descritto come fissione e fusione18,19,20. La capacità di differenziare gli OC in vitro ha permesso progressi significativi nella comprensione della biologia ossea21. Gli OC si differenziano dai precursori dopo esposizione al fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e all’attivatore del recettore del ligando kappa-B del fattore nucleare (RANKL). Quest’ultimo è essenziale per il normale sviluppo e funzione delle OC in vitro e in vivo, anche in condizioni infiammatorie 6,22,23. RANKL è presentato da osteoblasti e osteociti, nonché da cellule T attivate e fibroblasti nella sinovia infiammata RA 2,24,25. Durante il processo di differenziazione OC, i monociti esposti a M-CSF sovraregolano l’attivatore del recettore dell’espressione del fattore nucleare kappa-B (RANK) sulla loro membrana cellulare e, sotto successiva stimolazione con RANKL, si differenziano in pre-OC mononucleati positivi alla fosfatasi acida resistente ai tartrati (TRAP) e quindi in OC multinucleati15,26. Gli OC producono diversi enzimi, il principale tra questi è TRAP, che consente la degradazione delle fosfoproteine all’interno dell’osso27. Un regolatore e marcatore della differenziazione OC è il recettore associato all’OC (OSCAR). È sovraregolata precocemente nelle cellule precursori che si impegnano nella linea OC28. Gli OC multinucleati giganti maturi possono degradare (riassorbire) la matrice scheletrica generando una grande zona di tenuta, che è costituita da un anello di actina che circonda un bordo arruffato21,29,30. La capacità di riassorbimento osseo degli OC richiede la riorganizzazione del citoscheletro e la conseguente polarizzazione e formazione di una membrana contorta, che è il cosiddetto bordo arruffato. Il bordo arruffato è circondato da una grande fascia circolare di una struttura ricca di F-actina, che è l’anello di actina o zona di sigillatura. L’integrità dell’anello di actina è essenziale per gli OC per riassorbire l’osso sia in vitro che in vivo, e la formazione difettosa del bordo arruffato è associata a una minore espressione vacuolare di adenosina trifosfatasi (V-ATPasi)31,32,33. Inoltre, gli OC sono cellule ricche di mitocondri e l’adenosina trifosfato (ATP) si associa a strutture simili ai mitocondri negli OC localizzati sul bordo arruffato31,32,33. Il rotenone agisce come un forte inibitore del complesso mitocondriale I e influisce sulla produzione di ATP. Rotenone ha anche dimostrato di inibire la differenziazione OC e la funzione34.
Questo protocollo descrive un metodo efficiente e ottimizzato di osteoclastogenesi in vitro da campioni di sangue periferico umano. Nel sangue periferico umano, i monociti CD14+ sono la principale fonte di OCs15,35,36. In questo protocollo, la cinetica di esposizione e le concentrazioni di M-CSF e RANKL sono state regolate per un’osteoclastogenesi ottimale. Le cellule mononucleate vengono prima separate dagli eritrociti e dai granulociti presenti nel sangue intero per gradiente di densità; vengono quindi arricchiti per i monociti CD14+ utilizzando la selezione positiva mediante sfere magnetiche. I monociti CD14+ isolati vengono quindi incubati durante la notte con M-CSF. Questo prepara i monociti a sovraregolare l’espressione di RANK15,26. La successiva aggiunta di RANKL induce osteoclastogenesi e multinucleazione in modo dipendente dal tempo. Gli OC a riassorbimento attivo mostrano la distribuzione caratteristica degli anelli F-actina sul bordo della membrana cellulare30,32 e la colorazione per TRAP. Gli OC maturi vengono analizzati quantificando le cellule multinucleate TRAP+ (più di tre nuclei). La capacità funzionale degli OC maturi può essere valutata dal loro riassorbimento, dall’integrità dell’anello di actina e dalla produzione di ATP. Inoltre, gli OC CD14− OSCAR+ differenziati possono essere arricchiti e utilizzati per valutare gli effetti di alcuni composti sulla funzionalità OC attraverso il riassorbimento minerale (o dentinale) e l’organizzazione F-actina. Inoltre, in questo lavoro, un noto inibitore OC, rotenone, viene utilizzato come esempio di un composto che influenza la funzionalità degli OC. La ridotta attività di riassorbimento OC sotto rotenone è associata a una ridotta produzione di ATP e alla frammentazione dell’anello di actina. In conclusione, questo protocollo stabilisce un saggio robusto che può essere utilizzato come metodo di riferimento per studiare diversi aspetti biologici del differenziamento e della funzione OC in vitro.
Questa metodologia può essere utilizzata per valutare (1) il potenziale dei monociti circolanti di differenziarsi in OC in salute e malattie, nonché (2) l’impatto dei candidati terapeutici sulla differenziazione e sulla funzione OC. Questo robusto protocollo di osteoclastogenesi consente di determinare l’efficacia e i meccanismi delle terapie mirate all’osso sia sulla differenziazione OC dalle cellule precursori che sulla funzione delle OC mature.
La facile coltura e l’isolamento di un gran numero di OC funzionali in vitro sono importanti per far progredire la comprensione della biologia ossea e delle malattie mediate da OC. Classicamente, gli OC sono stati generati in co-colture con osteoblasti o cellule stromali e cellule ematopoietiche dalla milza o dal midollo osseo38,39. Un significativo passo avanti nella comprensione dell’osteoclastogenesi è stata l’identificazione di RANKL come il principale regolatore della formazione, differenziazione e sopravvivenza dell’OC40. I primi protocolli dei sistemi di coltura dipendenti da RANKL utilizzavano PBMC per la generazione di OC21,41,42. Tuttavia, queste colture miste sono lunghe e presentano molti fattori confondenti che limitano la capacità di testare gli effetti diretti sulla differenziazione e sulla funzione OC. Questo protocollo descrive un modello in vitro efficiente e affidabile di osteoclastogenesi da monociti CD14+ periferici umani in cui l’osteoclastogenesi ottimale può essere ottenuta entro 7 giorni (Figura 1 e Figura 2), che è considerevolmente più veloce rispetto ad altri protocolli43,44,45,46. Le principali caratteristiche distintive di questo protocollo sono (1) l’uso di monociti CD14+ purificati, (2) l’adescamento dei monociti con M-CSF prima dell’esposizione a RANKL, (3) la durata della coltura (<7 giorni) e (4) il rilevamento affidabile dell'inibizione della formazione di OC (colorazione TRAP) e della funzione (riassorbimento, produzione di ATP, riorganizzazione dell'anello di actina) con inibitori.
Durante l’ottimizzazione della metodologia sono stati identificati diversi punti critici. È stato osservato che la differenziazione in vitro degli OC dipende in gran parte dalla densità di semina dei monociti CD14+. Pertanto, in questo protocollo, le cellule sono seminate ad alta densità (1 x 105 cellule / pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, in 100 μL di mezzo), poiché è essenziale che le cellule siano in grado di interagire tra loro e di essere in prossimità di fondersi e diventare OC maturi. Allo stesso modo, la semina di cellule a una densità troppo elevata limita la loro differenziazione e crescita a causa delle limitazioni medie e della mancanza dello spazio richiesto. Inoltre, per ottenere il massimo successo con questo protocollo, è importante eseguire attentamente la separazione del gradiente di densità e garantire che la popolazione arricchita di cellule CD14+ sia il più pura possibile. Ad esempio, fasi di lavaggio inadeguate provocano una mancanza di rimozione delle piastrine, che di conseguenza inibisce la differenziazione OC47,48. Allo stesso modo, la presenza di contaminazione minore delle cellule T in preparati CD14+ isolati stimolati con M-CSF da solo può provocare la differenziazione OC, potenzialmente attraverso la secrezione di RANKL da parte delle cellule T49. Pertanto, è importante includere un controllo M-CSF per ogni esperimento. Si raccomanda inoltre un controllo di purezza di routine, soprattutto quando si utilizza un nuovo kit di isolamento, per garantire la purezza del campione.
I numeri OC ottimali (intervallo: ~200-1.600 OC/pozzetto) sono ottenuti utilizzando mezzo α-MEM arricchito con nucleosidi e L-glutammina. Altri terreni di coltura convenzionali, tra cui il terreno di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) e il terreno di coltura 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI), influenzano la resa OC. La fonte di FBS può anche influenzare l’osteoclastogenesi. Diversi lotti di FBS possono portare a una riduzione dell’osteoclastogenesi derivata da RANK-L, nonché alla comparsa di un basso numero di cellule multinucleate TRAP+ nei controlli M-CSF (Figura 3 supplementare). Pertanto, per ottenere risultati coerenti, si consiglia di testare nuovi lotti FBS prima dell’uso e di continuare con lo stesso lotto durante gli esperimenti per ridurre al minimo le variazioni nel processo di differenziazione. Inoltre, la variabilità da donatore a donatore, in termini di numero totale di OC differenziati ottenuti al punto temporale finale, costituisce una limitazione quando si utilizza questo protocollo per confrontare, ad esempio, donatori sani con pazienti. In questi casi, è imperativo utilizzare esattamente le stesse condizioni e lo stesso lotto di mezzo, FBS e altri reagenti.
Un altro passo necessario per la differenziazione e la maturazione ottimale dell’OC è l’adescamento dei monociti con M-CSF prima dell’aggiunta di RANKL. L’esposizione delle cellule a M-CSF 18-24 ore prima di RANKL prepara i monociti a sovraregolare l’espressione di RANK15,26. L’aggiunta di RANKL in questo momento garantisce una differenziazione OC ottimale in modo dose-dipendente. Il grado di differenziazione OC varia da donatore a donatore; tuttavia, 25 ng/mL RANKL sono di solito sufficienti per differenziare un numero elevato di OC nella maggior parte dei donatori. Inoltre, 25 ng/mL RANKL possono essere utilizzati nei saggi per lo screening iniziale dei composti, in quanto facilita la valutazione degli effetti potenzianti e inibitori dei composti in esame. Altri sistemi di coltura hanno utilizzato tempi di pre-incubazione M-CSF più lunghi prima dell’aggiunta di RANKL, ma ciò si traduce in un tempo di coltura più lungo per l’osteoclastogenesi50. Inoltre, lasciare i monociti innescati per incubare durante la notte consente loro di attaccarsi alla piastra, anche se non in uno stato completamente aderente. Pertanto, quando RANKL viene introdotto per la prima volta, il terreno deve essere cambiato a metà con molta attenzione piuttosto che completamente cambiato per prevenire il distacco e la perdita dei monociti innescati. Il terreno deve anche essere rinfrescato ogni 3-4 giorni per evitare l’esaurimento del mezzo e prevenire la morte cellulare. Inoltre, a causa del basso volume utilizzato in questo test (100 μL/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti), è della massima importanza disporre di una struttura di pozzetti vuoti riempiti con una soluzione acquosa (cioè H2O o PBS distillato sterile) attorno ai pozzetti di analisi. Ciò impedisce l’evaporazione media e gli effetti dei bordi.
Infine, per i saggi metabolici (ad esempio, i saggi ATP), è imperativo che le cellule siano vitali per evitare un’enorme deviazione standard tra le repliche (Figura 5). Un’elevata vitalità delle cellule è importante anche per la selezione delle cellule e per l’ulteriore coltura degli OC selezionati (Figura 4). Questo metodo, tuttavia, ha diverse limitazioni. Gli OC completamente maturi sono molto aderenti e difficili da staccare dalle piastre. Gli OC più grandi sono spesso impossibili da staccare, il che può portare a una minore resa cellulare. Pertanto, le cellule devono essere contate dopo la selezione e prima della placcatura alla concentrazione richiesta. Inoltre, nel presente protocollo, viene utilizzato un metodo non enzimatico (accutasi) per staccare gli OC per prevenire alterazioni della membrana nella colorazione superficiale a valle per la citometria a flusso. Anche l’uso di raschiatori cellulari (sia con terminazioni morbide che dure) è stato testato e ha portato a un’elevata morte cellulare. Il distacco enzimatico con soluzioni di tripsina/EDTA allo 0,05% può essere utilizzato per una maggiore resa di OC distaccati quando l’integrità della membrana non è richiesta per applicazioni a valle. Inoltre, per evitare che gli OC si aggreghino, l’uso di un’alta concentrazione di EDTA in tutti i tamponi dopo il distacco della cellula, nonché un appropriato filtraggio prima dell’acquisizione della citometria a flusso, sono altamente raccomandati. È importante notare che le colture OC sono una popolazione eterogenea di cellule costituite da OC maturi, precursori OC e macrofagi. I macrofagi possono essere facilmente distinti dagli OC, sebbene sia i pre-OC mononucleati che gli OC multinucleari esprimano OSCAR e non possano essere distinti con il presente metodo (Figura 4). In effetti, quest’ultima questione costituisce il principale limite di questo metodo. Inoltre, una bassa espressione di OSCAR è presente anche nelle colture M-CSF (Figura 4B) e potrebbe indicare macrofagi che sono pronti per l’impegno del lignaggio OC. È importante impostare il gate per le celle OSCAR+ in base al segnale di colorazione FMO, come mostrato nella Figura 4B.
In sintesi, questo protocollo descrive un metodo ottimizzato e robusto per la produzione efficiente di OC attivi e funzionalmente maturi da monociti umani primari circolanti. Il punto di forza di questo protocollo è la sua capacità di generare OC in una breve durata di tempo e produrre un numero elevato di OC differenziati. Questo metodo apre la strada allo studio dei meccanismi di base alla base della differenziazione e della funzione OC.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano con gratitudine la Flow Core Facility e la Glasgow Imaging Facility (GIF) all’interno della School of Infection and Immunity per il loro supporto e assistenza in questo lavoro.
µ-Slide 18 well chamber slides | ibidi | 81816 | |
8-well glass chamber slides | Ibidi | 80807 | |
96-well TC plate | Corning | 3596 | |
96-well osteo assay stripwell plate | Corning | 3989 | |
Acetate solution | Sigma Aldrich | 386-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Acetone | VWR | 20066.330 | |
Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit | SIGMA-ALDRICH | 387A-1KT | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Theremo Fisher – Invitrogen | A12379 | AF488 |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher – Invitrogen | A22287 | AF647 |
Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose | Fisher Scientific | 11321867 | 2DG, 98% |
Alpha minimum essential medium | gibco | 22571-020 | |
ATPlite 1step | PerkinElmer | 6016731 | Luminiscence ATP detection assay system |
BD FACSAria III cell sorter | BD Biosciences | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom | Greiner bio-one | 655083 | White-bottom plates |
Citrate solution | Sigma Aldrich | 91-5 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
Corning osteo assay surface multiple well plate | Sigma-Aldrich | CLS3989 | |
Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell | Corning | CLS3989-2EA | |
DAPI | Theremo Fisher | D3571 | |
EasySep human CD14 positive selection kit | STEMCELL Technologies | 17858 | |
EasySep red blood cell lysis buffer (10x) | StemCell Technologies | 20110 | |
eBioscience fixable viability dye eFluor 780 | Theremo Fisher – Invitrogen | 65-0865-14 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E7889-100ML | |
EVOS FL auto imaging system | Thermo Fisher | A32678 | |
Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap | Fisher Scientific | 10314791 | |
Falcon tubes 15 mL | Corning | 430790 | |
Falcon tubes 50 mL | Corning | 430828 | |
Fast Garnet GBC base solution | Sigma Aldrich | 387-2 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Fetal bovine serum | gibco | 10500-064 | FBS |
Ficoll-Paque Plus | cytiva | 17144003 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F-8775 | |
Human sRANK ligand | PEPROTECH | 310-01-100UG | Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) |
ImageJ Image analysis software | Image J | version 2.9.0 | |
L-glutamine | gibco | 25030-024 | |
Lithium heparin tubes (9 mL) | VACUETTE | 455084 | |
Macrophage colony-stimulating factor | PEPROTECH | 300-25-100UG | M-CSF |
Napthol AS-BI phosphoric acid solution | Sigma Aldrich | 387-1 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Neubauer hemacytometer counting chamber | Camlab | SKU 1127885 | |
Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes | Sigma-Aldrich | Q4876-5MG | |
OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit | Miltenyi Biotec | 130-107-661 and 130-107-617 | Clone REA494 |
PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody | Biolegend | 325618 | Clone HCD14 |
Penicilin/streptomycin | SIGMA | P0781 | |
PHERAstar machine and software | BMG LABTECH | ||
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x) | gibco | 14190-094 | |
REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-443 | |
Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044-1L | |
Sodium nitrite solution | Sigma Aldrich | 91-4 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Tartrate solution | Sigma Aldrich | 387-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML |