Osteoklasten sind wichtige knochenresorbierende Zellen im Körper. Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur in vitro Differenzierung von Osteoklasten aus humanen Monozyten im peripheren Blut. Diese Methode kann als wichtiges Werkzeug verwendet werden, um die Osteoklastenbiologie in der Homöostase und bei Krankheiten besser zu verstehen.
Osteoklasten (OCs) sind knochenresorbierende Zellen, die eine zentrale Rolle bei der Skelettentwicklung und dem Knochenumbau von Erwachsenen spielen. Mehrere Knochenerkrankungen werden durch eine verstärkte Differenzierung und Aktivierung von OCs verursacht, so dass die Hemmung dieser Pathobiologie ein zentrales therapeutisches Prinzip ist. Zwei Schlüsselfaktoren treiben die Differenzierung von OCs von myeloischen Vorläufern voran: der Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und der Rezeptoraktivator des nukleären Faktors kappa-B-Liganden (RANKL). Es ist seit langem bekannt, dass sich humane zirkulierende CD14+ -Monozyten in vitro in OCs differenzieren. Die Belichtungszeit und die Konzentration von RANKL beeinflussen jedoch die Differenzierungseffizienz. In der Tat wurden Protokolle für die Erzeugung von humanen OCs in vitro beschrieben, die jedoch oft zu einem schlechten und langwierigen Differenzierungsprozess führen. Hierin wird ein robustes und standardisiertes Protokoll zur zeitnahen Generierung funktionell aktiver, reifer humaner OCs bereitgestellt. CD14+ Monozyten werden aus humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) angereichert und mit M-CSF geprimt, um RANK hochzuregulieren. Eine anschließende Exposition gegenüber RANKL erzeugt dosis- und zeitabhängig OCs. OCs werden durch Färbung mit Tartratsäure-resistenter Phosphatase (TRAP) und lichtmikroskopischer Analyse identifiziert und quantifiziert. Die Immunfluoreszenzfärbung von Zellkernen und F-Aktin wird verwendet, um funktionell aktive OCs zu identifizieren. Darüber hinaus werden OSCAR+CD14− -reife OCs durch durchflusszytometrische Zellsortierung weiter angereichert und die OC-Funktionalität durch Mineral- (oder Dentin-/Knochen-) Resorptionsassays und Aktinringbildung quantifiziert. Schließlich wird ein bekannter OC-Inhibitor, Rotenon, bei reifen OCs eingesetzt, was zeigt, dass die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) für die Integrität des Aktinrings und die OC-Funktion unerlässlich ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit ein robuster Assay zur Differenzierung einer hohen Anzahl von OCs etabliert wird, der in Kombination mit Aktinringfärbung und einem ATP-Assay ein nützliches in vitro Modell darstellt, um die OC-Funktion zu bewerten und nach neuen therapeutischen Verbindungen zu suchen, die den Differenzierungsprozess modulieren können.
Osteoklasten (OCs) sind mehrkernige Riesenzellen hämatopoetischer Abstammung mit einer einzigartigen Fähigkeit, Knochen zu resorbieren. Sie sind verantwortlich für die Entwicklung und den kontinuierlichen Umbau des Skeletts 1,2. In den skelettalen Entwicklungsphasen leiten sich OCs und geweberesidente Makrophagen von erythromyeloischen Vorläuferzellen ab und besiedeln die Knochennische und das Organgewebe. Unter physiologischen Bedingungen sind erythromyeloische Vorläuferzellen für eine normale Knochenentwicklung und einen Zahndurchbruch erforderlich, während der Zustrom zirkulierender Blutmonozyten in die Knochennische für die postnatale Aufrechterhaltung der OCs, der Knochenmasse und der Knochenmarkhöhle sorgt3. Unter pathologischen Bedingungen werden Monozyten an Orte aktiver Entzündung rekrutiert und können zur pathologischen Knochenzerstörung beitragen 4,5.
Bei Patienten mit verschiedenen Formen von Arthritis kommt es zu einer Gelenkentzündung, die zu einer fortschreitenden Gelenkzerstörung führt, die durch OCs verursachtwird 6. Bei rheumatoider Arthritis (RA) beispielsweise sind überaktivierte OCs für pathologische Knochenerosion und Gelenkzerstörung verantwortlich7,8, und die derzeitigen Behandlungen verbessern oder stoppen die Knochenschädigung oft nicht9,10,11. Veränderungen der zirkulierenden Monozyten sowohl in Bezug auf die Populationsverteilung als auch auf die transkriptomischen und epigenetischen Signaturen wurden bei RA-Patienten berichtet12,13,14. Darüber hinaus wurde berichtet, dass veränderte Monozytenantworten auf Entzündungsstimulation die Osteoklastogenese bei RA-Patienten mit aktiver Erkrankung beeinflussen15,16,17.
Die Differenzierung von OCs ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, bei dem myeloische Vorläuferzellen an die Differenzierung in OC-Vorläuferzellen gebunden werden. Während der Osteoklastogenese werden OCs durch Zell-Zell-Fusion, unvollständige Zytokinese und einen Kernrecyclingprozess, der als Spaltung und Fusion bezeichnet wird, riesig und mehrkernig18,19,20. Die Fähigkeit, OCs in vitro zu differenzieren, hat zu bedeutenden Fortschritten im Verständnis der Knochenbiologie geführt21. OCs unterscheiden sich von Vorstufen durch Exposition gegenüber dem Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und dem Rezeptoraktivator des Kernfaktors kappa-B-Liganden (RANKL). Letzteres ist essentiell für die normale Entwicklung und Funktion von OCs in vitro und in vivo, auch unter entzündlichen Bedingungen6,22,23. RANKL wird durch Osteoblasten und Osteozyten sowie durch aktivierte T-Zellen und Fibroblasten in der entzündeten RA-Synoviapräsentiert 2,24,25. Während des OC-Differenzierungsprozesses regulieren Monozyten, die M-CSF ausgesetzt sind, den Rezeptoraktivator des nukleären Faktors kappa-B (RANK)-Expression auf ihrer Zellmembran hoch und differenzieren sich unter anschließender Stimulation mit RANKL in Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP)-positive mononukleäre prä-OCs und dann in mehrkernige OCs15,26. OCs produzieren mehrere Enzyme, das wichtigste unter ihnen ist TRAP, das den Abbau von Phosphoproteinen im Knochenermöglicht 27. Ein Regulator und Marker der OC-Differenzierung ist der OC-assoziierte Rezeptor (OSCAR). Es wird früh in Vorläuferzellen hochreguliert, die sich an die OC-Linie binden28. Reife riesige, mehrkernige OCs können die Skelettmatrix abbauen (resorbieren), indem sie eine große Versiegelungszone erzeugen, die aus einem Aktinring besteht, der einen gekräuselten Randumgibt 21,29,30. Die Knochenresorptionsfähigkeit von OCs erfordert eine Reorganisation des Zytoskeletts und die daraus resultierende Polarisation und Bildung einer gewundenen Membran, der sogenannten gekräuselten Grenze. Der gekräuselte Rand ist von einem großen kreisförmigen Band einer F-Aktin-reichen Struktur umgeben, das den Aktinring oder die Dichtungszone darstellt. Die Integrität des Aktinrings ist für OCs essentiell, um Knochen sowohl in vitro als auch in vivo zu resorbieren, und eine fehlerhafte Bildung von gekräuselten Rändern ist mit der Expression der niedervakuolären Adenosintriphosphatase (V-ATPase) assoziiert31,32,33. Darüber hinaus sind OCs mitochondrienreiche Zellen, und Adenosintriphosphat (ATP) assoziiert mit mitochondrialen Strukturen in OCs, die an der gekräuselten Grenze lokalisiert sind31,32,33. Rotenon wirkt als starker Inhibitor des mitochondrialen Komplexes I und beeinflusst die ATP-Produktion. Es wurde auch gezeigt, dass Rotenon die Differenzierung und Funktion von OC hemmt34.
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und optimierte Methode der in vitro Osteoklastogenese aus humanen peripheren Blutproben. Im peripheren Blut des Menschen sind CD14+-Monozyten die Hauptquelle für OCs15,35,36. In diesem Protokoll wurden die Kinetik der Exposition und die Konzentrationen von M-CSF und RANKL für eine optimale Osteoklastogenese angepasst. Mononukleäre Zellen werden zunächst durch einen Dichtegradienten von den im Vollblut vorhandenen Erythrozyten und Granulozyten getrennt; Sie werden dann durch positive Selektion durch magnetische Beads für CD14+-Monozyten angereichert. Die isolierten CD14+ Monozyten werden dann über Nacht mit M-CSF inkubiert. Dies bereitet die Monozyten darauf vor, die Expression von RANK15,26 hochzuregulieren. Die anschließende Zugabe von RANKL induziert zeitabhängig die Osteoklastogenese und Multinukleation. Aktiv resorbierende OCs zeigen die charakteristische Verteilung von F-Aktin-Ringen am Rand der Zellmembran30,32 und die Färbung für TRAP. Reife OCs werden durch Quantifizierung von mehrkernigen TRAP+-Zellen (mehr als drei Kerne) analysiert. Die funktionelle Leistungsfähigkeit reifer OCs kann anhand ihrer Resorption, Aktinringintegrität und ATP-Produktion beurteilt werden. Darüber hinaus können differenzierte CD14− OSCAR+ OCs angereichert und verwendet werden, um die Auswirkungen bestimmter Verbindungen auf die OC-Funktionalität über Mineral- (oder Dentin-) Resorption und F-Aktin-Organisation zu bewerten. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit ein bekannter OC-Inhibitor, Rotenon, als Beispiel für eine Verbindung verwendet, die die Funktionalität von OCs beeinflusst. Eine verminderte OC-Resorptionsaktivität unter Rotenon ist mit einer verminderten ATP-Produktion und Aktinringfragmentierung verbunden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll einen robusten Assay etabliert, der als Referenzmethode verwendet werden kann, um verschiedene biologische Aspekte der OC-Differenzierung und -Funktion in vitro zu untersuchen.
Diese Methodik kann verwendet werden, um (1) das Potenzial zirkulierender Monozyten zur Differenzierung in OCs in Gesundheit und Krankheiten sowie (2) den Einfluss von therapeutischen Kandidaten auf die OC-Differenzierung und -Funktion zu bewerten. Dieses robuste Osteoklastogenese-Protokoll ermöglicht die Bestimmung der Wirksamkeit und der Mechanismen knochenspezifischer Therapien sowohl auf die Differenzierung von OC aus Vorläuferzellen als auch auf die Funktion reifer OCs.
Die einfache Kultivierung und Isolierung einer großen Anzahl funktioneller OCs in vitro ist wichtig, um das Verständnis der Knochenbiologie und der OC-vermittelten Erkrankungen zu verbessern. Klassischerweise wurden OCs in Kokulturen mit Osteoblasten oder Stromazellen und hämatopoetischen Zellen aus der Milz oder dem Knochenmark erzeugt38,39. Ein bedeutender Durchbruch im Verständnis der Osteoklastogenese war die Identifizierung von RANKL als Hauptregulator der OC-Bildung, -Differenzierung und -Überleben40. Frühe Protokolle von RANKL-abhängigen Kultursystemen verwendeten PBMCs für die OC-Generation21,41,42. Diese Mischkulturen sind jedoch langwierig und weisen viele Störfaktoren auf, die die Möglichkeit einschränken, die direkten Auswirkungen auf die Differenzierung und Funktion von OC zu testen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes und zuverlässiges In-vitro-Modell der Osteoklastogenese aus humanen peripheren CD14+-Monozyten, bei dem eine optimale Osteoklastogenese innerhalb von 7 Tagen erreicht werden kann (Abbildung 1 und Abbildung 2), was im Vergleich zu einigen anderen Protokollen erheblich schneller ist 43,44,45,46. Die wichtigsten Unterscheidungsmerkmale dieses Protokolls sind (1) die Verwendung von gereinigten CD14+-Monozyten, (2) das Priming der Monozyten mit M-CSF vor der Exposition mit RANKL, (3) die Länge der Kultur (<7 Tage) und (4) der zuverlässige Nachweis der Hemmung der OC-Bildung (TRAP-Färbung) und der Funktion (Resorption, ATP-Produktion, Aktinringreorganisation) mit Inhibitoren.
Bei der Optimierung der Methodik wurden mehrere kritische Punkte identifiziert. Es konnte beobachtet werden, dass die in vitro Differenzierung von OCs stark von der Saming-Dichte der CD14+ Monozyten abhängt. Daher werden in diesem Protokoll die Zellen mit einer hohen Dichte ausgesät (1 x 105 Zellen/Well einer 96-Well-Platte, in 100 μl Medium), da es für die Zellen unerlässlich ist, miteinander interagieren zu können und sich in der Nähe zu befinden, um zu fusionieren und zu reifen OCs zu werden. In ähnlicher Weise schränkt die Aussaat von Zellen mit einer zu hohen Dichte ihre Differenzierung und ihr Wachstum aufgrund mittlerer Einschränkungen und des Mangels an benötigtem Platz ein. Um mit diesem Protokoll maximalen Erfolg zu erzielen, ist es außerdem wichtig, die Dichtegradiententrennung sorgfältig durchzuführen und sicherzustellen, dass die angereicherte Population von CD14+-Zellen so rein wie möglich ist. So führen z.B. unzureichende Waschschritte zu einer mangelnden Entfernung der Blutplättchen, was folglich die Differenzierung der OC hemmt47,48. In ähnlicher Weise kann das Vorhandensein einer geringfügigen T-Zell-Kontamination in isolierten CD14+-Präparaten, die allein mit M-CSF stimuliert werden, zu einer OC-Differenzierung führen, möglicherweise über die RANKL-Sekretion durch T-Zellen49. Daher ist es wichtig, für jedes Experiment eine M-CSF-Kontrolle einzubauen. Eine routinemäßige Reinheitsprüfung, insbesondere bei Verwendung eines neuen Isolationskits, wird ebenfalls empfohlen, um die Reinheit der Probe sicherzustellen.
Optimale OC-Zahlen (Bereich: ~200-1.600 OCs/Well) werden mit α-MEM-Medium erreicht, das mit Nukleosiden und L-Glutamin angereichert ist. Andere konventionelle Nährmedien, darunter das modifizierte Adlermedium (DMEM) von Dulbecco und das Medium 1640 des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), beeinflussen die OC-Ausbeute. Die Quelle von FBS kann auch die Osteoklastogenese beeinflussen. Unterschiedliche FBS-Chargen können zu einer reduzierten RANK-L-abgeleiteten Osteoklastogenese sowie zum Auftreten einer geringen Anzahl von mehrkernigen TRAP+ -Zellen in den M-CSF-Kontrollen führen (ergänzende Abbildung 3). Um konsistente Ergebnisse zu erzielen, wird daher empfohlen, neue FBS-Chargen vor der Verwendung zu testen und während der gesamten Experimente mit derselben Charge fortzufahren, um Schwankungen im Differenzierungsprozess zu minimieren. Darüber hinaus stellt die Variabilität von Spender zu Spender in Bezug auf die Gesamtzahl der differenzierten OCs, die zum Endzeitpunkt erhalten wurden, eine Einschränkung dar, wenn dieses Protokoll verwendet wird, um z. B. gesunde Spender mit Patienten zu vergleichen. In diesen Fällen ist es zwingend erforderlich, genau die gleichen Bedingungen und die gleiche Charge von Medium, FBS und anderen Reagenzien zu verwenden.
Ein weiterer notwendiger Schritt für eine optimale OC-Differenzierung und -Reifung ist das Priming der Monozyten mit M-CSF vor der RANKL-Zugabe. Die Exposition der Zellen bei M-CSF 18-24 h vor RANKL bereitet die Monozyten darauf vor, die RANK-Expression hochzuregulieren15,26. Die Zugabe von RANKL zu diesem Zeitpunkt sorgt für eine optimale OC-Differenzierung in dosisabhängiger Weise. Der Grad der OC-Differenzierung variiert von Spender zu Spender; 25 ng/ml RANKL sind jedoch in der Regel ausreichend, um bei den meisten Spendern eine hohe Anzahl von OCs zu differenzieren. Darüber hinaus kann 25 ng/ml RANKL in Assays für das erste Screening von Verbindungen verwendet werden, da es die Bewertung sowohl der verstärkenden als auch der hemmenden Wirkung der Testverbindungen erleichtert. Andere Kultursysteme haben längere M-CSF-Vorinkubationszeiten vor der RANKL-Zugabe verwendet, was jedoch zu einer längeren Kultivierungszeit für die Osteoklastogenese führt50. Wenn man die geprimten Monozyten über Nacht inkubieren lässt, können sie sich außerdem an die Platte anheften, wenn auch nicht in einem vollständig haftenden Zustand. Daher muss bei der erstmaligen Einführung von RANKL das Medium sehr vorsichtig halb gewechselt werden, anstatt es vollständig zu verändern, um die Ablösung und den Verlust der geprimten Monozyten zu verhindern. Das Medium muss auch alle 3-4 Tage aufgefrischt werden, um eine Erschöpfung des Mediums zu vermeiden und den Zelltod zu verhindern. Darüber hinaus ist es aufgrund des geringen Volumens, das in diesem Assay verwendet wird (100 μL/Well in einer 96-Well-Platte), von größter Bedeutung, einen Rahmen aus leeren Wells zu haben, die mit einer wässrigen Lösung (d. h. steril destilliertem H2O oder PBS) um die Assay-Wells herum gefüllt sind. Dadurch werden Mediumverdunstung und Kanteneffekte vermieden.
Schließlich ist es für metabolische Assays (z. B. ATP-Assays) unerlässlich, dass die Zellen lebensfähig sind, um eine große Standardabweichung zwischen den Replikaten zu vermeiden (Abbildung 5). Eine hohe Viabilität der Zellen ist auch für die Sortierung der Zellen und für die weitere Kultivierung der sortierten OCs wichtig (Abbildung 4). Diese Methode weist jedoch einige Einschränkungen auf. Voll ausgereifte OCs sind sehr haftend und lassen sich nur schwer von den Platten lösen. Die größeren OCs lassen sich oft nicht ablösen, was zu einer geringeren Zellausbeute führen kann. Daher müssen die Zellen nach der Sortierung und vor dem Ausplattieren in der erforderlichen Konzentration gezählt werden. Darüber hinaus wird im vorliegenden Protokoll eine nicht-enzymatische Methode (Accutase) zur Ablösung der OCs verwendet, um Membranveränderungen bei der nachgeschalteten Oberflächenfärbung für die Durchflusszytometrie zu verhindern. Die Verwendung von Zellschaber (sowohl mit weichen als auch mit harten Enden) wurde ebenfalls getestet und führte zu einem hohen Zelltod. Die enzymatische Ablösung mit 0,05%igen Trypsin/EDTA-Lösungen kann für eine höhere Ausbeute an abgelösten OCs verwendet werden, wenn die Membranintegrität für nachgeschaltete Anwendungen nicht erforderlich ist. Um zu verhindern, dass die OCs verklumpen, wird außerdem dringend empfohlen, nach der Zellablösung eine hohe Konzentration von EDTA in allen Puffern sowie eine geeignete Filterung vor der durchflusszytometrischen Erfassung zu verwenden. Es ist wichtig zu beachten, dass OC-Kulturen eine heterogene Population von Zellen sind, die aus reifen OCs, OC-Vorläufern und Makrophagen besteht. Makrophagen können leicht von OCs unterschieden werden, obwohl sowohl mononukleäre prä-OCs als auch multinukleäre OCs OSCAR exprimieren und mit der vorliegenden Methode nicht unterschieden werden können (Abbildung 4). Letzteres stellt in der Tat die Haupteinschränkung dieser Methode dar. Darüber hinaus ist eine geringe Expression von OSCAR auch in M-CSF-Kulturen vorhanden (Abbildung 4B) und könnte auf Makrophagen hindeuten, die für die OC-Linienbindung vorbereitet sind. Es ist wichtig, das Gate für OSCAR+ -Zellen basierend auf dem FMO-Färbesignal festzulegen, wie in Abbildung 4B dargestellt.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine optimierte und robuste Methode zur effizienten Herstellung aktiver und funktionell reifer OCs aus zirkulierenden primären humanen Monozyten. Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Fähigkeit, OCs in kurzer Zeit zu generieren und eine große Anzahl differenzierter OCs zu erhalten. Diese Methode eröffnet den Weg, um die grundlegenden Mechanismen zu untersuchen, die der Differenzierung und Funktion von OC zugrunde liegen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren danken der Flow Core Facility und der Glasgow Imaging Facility (GIF) innerhalb der School of Infection and Immunity für ihre Unterstützung und Hilfe bei dieser Arbeit.
µ-Slide 18 well chamber slides | ibidi | 81816 | |
8-well glass chamber slides | Ibidi | 80807 | |
96-well TC plate | Corning | 3596 | |
96-well osteo assay stripwell plate | Corning | 3989 | |
Acetate solution | Sigma Aldrich | 386-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Acetone | VWR | 20066.330 | |
Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit | SIGMA-ALDRICH | 387A-1KT | |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Theremo Fisher – Invitrogen | A12379 | AF488 |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher – Invitrogen | A22287 | AF647 |
Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose | Fisher Scientific | 11321867 | 2DG, 98% |
Alpha minimum essential medium | gibco | 22571-020 | |
ATPlite 1step | PerkinElmer | 6016731 | Luminiscence ATP detection assay system |
BD FACSAria III cell sorter | BD Biosciences | ||
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418-100G | |
Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom | Greiner bio-one | 655083 | White-bottom plates |
Citrate solution | Sigma Aldrich | 91-5 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes | Fisher Scientific | 352054 | |
Corning osteo assay surface multiple well plate | Sigma-Aldrich | CLS3989 | |
Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell | Corning | CLS3989-2EA | |
DAPI | Theremo Fisher | D3571 | |
EasySep human CD14 positive selection kit | STEMCELL Technologies | 17858 | |
EasySep red blood cell lysis buffer (10x) | StemCell Technologies | 20110 | |
eBioscience fixable viability dye eFluor 780 | Theremo Fisher – Invitrogen | 65-0865-14 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E7889-100ML | |
EVOS FL auto imaging system | Thermo Fisher | A32678 | |
Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap | Fisher Scientific | 10314791 | |
Falcon tubes 15 mL | Corning | 430790 | |
Falcon tubes 50 mL | Corning | 430828 | |
Fast Garnet GBC base solution | Sigma Aldrich | 387-2 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Fetal bovine serum | gibco | 10500-064 | FBS |
Ficoll-Paque Plus | cytiva | 17144003 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F-8775 | |
Human sRANK ligand | PEPROTECH | 310-01-100UG | Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) |
ImageJ Image analysis software | Image J | version 2.9.0 | |
L-glutamine | gibco | 25030-024 | |
Lithium heparin tubes (9 mL) | VACUETTE | 455084 | |
Macrophage colony-stimulating factor | PEPROTECH | 300-25-100UG | M-CSF |
Napthol AS-BI phosphoric acid solution | Sigma Aldrich | 387-1 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Neubauer hemacytometer counting chamber | Camlab | SKU 1127885 | |
Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes | Sigma-Aldrich | Q4876-5MG | |
OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit | Miltenyi Biotec | 130-107-661 and 130-107-617 | Clone REA494 |
PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody | Biolegend | 325618 | Clone HCD14 |
Penicilin/streptomycin | SIGMA | P0781 | |
PHERAstar machine and software | BMG LABTECH | ||
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x) | gibco | 14190-094 | |
REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-113-443 | |
Sodium hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | 425044-1L | |
Sodium nitrite solution | Sigma Aldrich | 91-4 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Tartrate solution | Sigma Aldrich | 387-3 | from kit Cat No. 387A-1KT |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML |