Estudiando la habituación en Stentor coeruleus
Summary
Introducimos un método para cuantificar la habituación de Stentor utilizando un aparato microcontrolador conectado a una placa que puede entregar pulsos mecánicos a una fuerza y frecuencia específicas. También incluimos métodos para ensamblar el aparato y configurar el experimento de una manera que minimice las perturbaciones externas.
Abstract
El aprendizaje generalmente se asocia con un sistema nervioso complejo, pero cada vez hay más evidencia de que la vida en todos los niveles, hasta las células individuales, puede mostrar comportamientos inteligentes. Tanto en sistemas naturales como artificiales, el aprendizaje es la actualización adaptativa de los parámetros del sistema basados en nueva información, y la inteligencia es una medida del proceso computacional que facilita el aprendizaje. Stentor coeruleus es un organismo unicelular que habita en estanques que exhibe habituación, una forma de aprendizaje en la que una respuesta conductual disminuye después de un estímulo repetido. El stentor se contrae en respuesta a la estimulación mecánica, que es una aparente respuesta de escape de los depredadores acuáticos. Sin embargo, las perturbaciones repetidas de baja fuerza inducen la habituación, demostrada por una reducción progresiva en la probabilidad de contracción. Aquí, presentamos un método para cuantificar la habituación de Stentor utilizando un aparato vinculado a una placa de microcontrolador que puede entregar pulsos mecánicos a una fuerza y frecuencia específicas, incluidos los métodos para construir el aparato y configurar el experimento de una manera que minimice las perturbaciones externas. En contraste con los enfoques descritos anteriormente para estimular mecánicamente Stentor, este dispositivo permite variar la fuerza de estimulación bajo control de computadora durante el curso de un solo experimento, lo que aumenta en gran medida la variedad de secuencias de entrada que se pueden aplicar. Comprender la habituación a nivel de una sola célula ayudará a caracterizar los paradigmas de aprendizaje que son independientes de los circuitos complejos.
Introduction
El aprendizaje generalmente se asocia con un sistema nervioso complejo, pero cada vez hay más evidencia de que la vida en todos los niveles, hasta las células individuales, puede mostrar comportamientos inteligentes. Tanto en sistemas naturales como artificiales, el aprendizaje es la actualización adaptativa de los parámetros del sistema basados en nueva información1, y la inteligencia es una medida del proceso computacional que facilita el aprendizaje2.
Stentor coeruleus es un organismo unicelular que habita en estanques que exhibe habituación, una forma de aprendizaje en la que una respuesta conductual disminuye después de un estímulo repetido3. Stentor se contrae en respuesta a la estimulación mecánica3, que es una aparente respuesta de escape de los depredadores acuáticos. Sin embargo, las perturbaciones repetidas de baja fuerza inducen habituación, demostrada por una reducción progresiva en la probabilidad de contracción3. El Stentor habituado todavía se contrae después de recibir estimulación mecánica de alta fuerza4 o estimulación fótica5. Estas observaciones, que se alinean con los criterios clásicos de Thompson y Spencer para la habituación en animales6, sugieren fuertemente que la disminución original de la respuesta contráctil se debe al aprendizaje en lugar de a la fatiga o al agotamiento de ATP. Como célula de vida libre, Stentor se puede estudiar sin mucha interferencia de las células circundantes, como sería el caso en un tejido multicelular. Varias características adicionales hacen de Stentor un sistema manejable para estudiar el aprendizaje: su gran tamaño (1 mm), su respuesta de habituación cuantificable3, la facilidad de inyección y micromanipulación7, el genoma completamente secuenciado8 y la disponibilidad de herramientas de interferencia de ARN (ARNi)9. El uso de este organismo modelo para explorar el aprendizaje celular sin un cerebro o sistema nervioso requiere un procedimiento reproducible para estimular las células Stentor y medir la respuesta.
Aquí, presentamos un método para cuantificar la habituación de Stentor utilizando un aparato vinculado a una placa de microcontrolador que puede entregar pulsos mecánicos a una fuerza y frecuencia específicas, incluidos los métodos para construir el aparato y configurar el experimento de una manera que minimice las perturbaciones externas (Figura 1). Comprender la habituación a nivel de una sola célula ayudará a caracterizar los paradigmas de aprendizaje que son independientes de los circuitos complejos.
Figura 1: Configuración del experimento de habituación. La placa de Petri que contiene Stentor se coloca encima de la regla metálica flexible del dispositivo de habituación. La armadura del dispositivo de habituación golpea la regla de metal a una fuerza y frecuencia especificadas, produciendo una onda de estímulo a través del campo de las células. La cámara de microscopio USB registra las respuestas del Stentor a la estimulación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Resumen del flujo de trabajo del experimento de habituación. La figura muestra los pasos básicos involucrados en el estudio de Stentor utilizando el dispositivo de habituación. La figura fue creada con BioRender.com. Adaptado de “Process Flowchart”, de BioRender.com (2022). Extraído de https://app.biorender.com/biorender-templates. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más críticos en el protocolo se relacionan con asegurar que el Stentor permanezca en condiciones óptimas para que ocurran las contracciones. La respuesta de contracción en el ensayo de habituación requiere que los Stentors estén anclados a una superficie usando su agarre pegajoso, ya que rara vez se contraen cuando nadan libremente. Sin embargo, la superficie inferior de la placa de Petri de 35 mm utilizada para experimentos de habituación no suele ser propicia para el anclaje a menos que esté recubierta con poliornitina. Además, el Stentor no puede estar expuesto a ninguna perturbación mecánica durante un mínimo de 2 h antes del inicio del experimento de habituación porque la escala de tiempo de olvido del Stentor es de 2-6 h3. Si Stentor recibe estimulación mecánica dentro de las 2 h posteriores a la hora de inicio del experimento de habituación, existe la posibilidad de que esta estimulación previa induzca un ligero nivel de habituación antes del experimento, reduciendo así la probabilidad de contracción después de que el dispositivo de habituación emita el primer pulso mecánico. Finalmente, durante la etapa de análisis, es importante contar solo el número de Stentor que se contraen después de un pulso, en lugar de cualquier contracción espontánea incidental que ocurra antes de la entrega del pulso, para obtener una lectura precisa de la fracción de células que se contrajeron en respuesta a la estimulación mecánica.
El protocolo se puede modificar fácilmente para estudiar diferentes tipos de dinámica de habituación cambiando la fuerza y la frecuencia de los pulsos mecánicos entregados por el dispositivo de habituación. Esto también brinda la oportunidad de explorar otros tipos de aprendizaje, como la sensibilización, que podrían ocurrir en Stentor. El código del programa de la placa del microcontrolador también se puede ajustar para entregar diferentes patrones de tomas mecánicas al Stentor.
Un problema potencial para solucionar con este protocolo es la baja frecuencia de anclaje de Stentor, que podría limitar el número de Stentor que se puede observar en el experimento de habituación. La frecuencia de anclaje a veces se reduce en cultivos de Stentor que no han sido alimentados recientemente o están contaminados. Para abordar este problema, se debe lavar un nuevo lote de Stentor para comenzar un nuevo cultivo y alimentarlos regularmente de acuerdo con el protocolo descrito en Lin et al.10.
Este protocolo está limitado en el sentido de que solo se puede probar una sola placa de Stentor a la vez, lo que resulta en mediciones de rendimiento relativamente bajo. Además, el software actual no permite la automatización del análisis de imágenes de una sola célula. La mayoría de los datos adquiridos son, por lo tanto, a nivel poblacional. Los modelos futuros del dispositivo de habituación y las herramientas de análisis de imágenes pueden facilitar experimentos unicelulares de alto rendimiento.
La habituación en Stentor se ha estudiado previamente utilizando métodos descritos por Wood3, pero este nuevo protocolo permite automatizar los experimentos. La automatización no solo permite al investigador entregar de manera reproducible pulsos mecánicos de una fuerza y frecuencia específicas, sino que también facilita los experimentos de habituación a largo plazo, ya que el dispositivo puede dejarse funcionando sin supervisión durante días. Además, el uso de un motor paso a paso en lugar del solenoide empleado en los experimentos de Wood3 reduce el riesgo de desmagnetización con el tiempo y también permite variar la fuerza del estímulo durante el curso de un solo experimento.
El estudio de la habituación celular puede revelar conocimientos clínicos para condiciones como el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) y el síndrome de Tourette en el que la habituación se ve afectada11. Los mecanismos de habituación del stentor también pueden revelar nuevos paradigmas de aprendizaje no sináptico independientes de los circuitos celulares complejos. Finalmente, las ideas sobre el aprendizaje de células individuales podrían inspirar métodos para reprogramar células dentro de tejidos multicelulares, otra vía potencial para combatir enfermedades.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Tatyana Makushok por sus innumerables discusiones sobre el aprendizaje de Stentor . Este trabajo fue financiado por la subvención MCB-2012647 de NSF y por la subvención R35 GM130327 de los NIH, así como por el premio I2CELL de la Fundación Fourmentin-Guilbert.
Materials
| 0.01% Poly-ornithine | Millipore Sigma | P4957 | Used to coat Petri plate |
| 35-mm Petri plate | Benz Microscope Optics Center Inc. | L331 | Contains Stentor during experiments |
| 6-well plate | StemCell Technologies | 38016 | Used to wash Stentor |
| Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1) | Thorlabs | MB424 | Used to construct habituation device |
| Big easy driver stepper motor driver board (x1) | Sparkfun | ROB-12859 | Used to construct habituation device |
| Construction rail, 1" x 5'' (x2) | Newport | Newport CR-1 | Used to construct habituation device |
| Laptop | Apple Store | https://www.apple.com/macbook-air-m1/ | Connect laptop to USB microscope to visualize experiments |
| Large right-angle bracket (x1) | Thorlabs | AP90RL | Used to construct habituation device |
| Microcontroller board | Arduino | A000066 | Used to control habituation device |
| Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead | Stepperonline.com | 5-17HS19-2004S1 | Used to construct habituation device |
| Pasteurized spring water | Carolina | 132458 | Media for Stentor experiments |
| Right-angle bracket (x3) | Thorlabs | AP90 | Used to construct habituation device |
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | Used to visualize Stentor during wash steps | |
| Stentor coeruleus | Carolina | 131598 | These are the cells used for habituation experiments |
| USB microscope | Celestron | 44308 | Used to visualize and record experiments |
| Webcam recorder | Apple Store | https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12 | Install this application to take videos of experiments |
References
- Dussutour, A. Learning in single cell organisms. Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).
- Sternberg, R. J. Intelligence. Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).
- Wood, D. C. Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus. Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).
- Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Cell learning. Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).
- Wood, D. C. Stimulus specific habituation in a protozoan. Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).
- Thompson, R. F., Spencer, W. A. Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior. Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).
- Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. Stentor coeruleus. Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).
- Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).
- McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).
