ステントル・コエルレウスの馴化の研究

注:馴化実験ワークフローの概要を 図2に示します。 1.馴化装置の組み立て モータードライバーをモーターに接続します ( 図3を参照)。ドライバーボードからのAというラベルの付いた2本のワイヤーをモーターの青と赤のワイヤーに接続します。ドライバーボードのBというラベルの付いた2本のワイヤーをモーターの緑と黒のワイヤーに接続します。注意: モーターワイヤーを上にしてドライバーボードを上から見下ろすと、4本の入力線が青、赤、黒、緑の順にモーターリードに接続する必要があります。 図4に示すブレッドボード回路を構築し、LEDを正しい極性で接続するように特に注意します。 ドライバボードからのVcc(+5 V)を白いブレッドボードの上部レールに接続し、ドライバボードからのGndをブレッドボードの下部レールに接続します。 ブレッドボードのグランドをマイクロコントローラボードのグランドピンに接続します。緑色のLED、赤色のLED、スイッチ、ボタンの各ワイヤを、マイクロコントローラボードのデジタルピン8、9、10、および11に接続します。 マイクロコントローラボードのデジタルピン2と3をドライバボードのステップとディレクトリの配線に接続します。 マイクロコントローラボードのデジタルピン4、5、6、および7をドライバボードのワイヤに接続します。ピン4をMS1に接続し、ピン5をMS2に接続し、ピン6をMS3に接続し、ピン7をイネーブルに接続します。 ドライバ・ボードに12V電源で電源を供給します。12V電源を、モータードライバーボードに2本の赤いワイヤーで接続されている黒/緑のアダプタープラグに差し込みます。メモ: 12 V 電源をマイクロコントローラボードのプラグに差し込まないでください。 制御プログラム(https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino)をマイコンボードにダウンロードします。 USBケーブルを使用して、マイクロコントローラボードをコンピュータに接続し、コンピュータはマイクロコントローラボードの電源としても機能します。 ユーザー コントロールが機能していることを確認します。スライドスイッチが自動モードのオンとオフを切り替えることを確認します。自動モードでは、システムはユーザーが指定した一定の間隔でステップを実行します(以下を参照)。 自動モードがオンのときに緑色のLEDが点灯することを確認します。 モーターがパルスを印加する1秒前に赤いLEDが点滅することを確認してください。赤色のLEDは、システムが機械的なパルスを送達しようとしていることを示す警告灯です。 システムが自動モードであるかどうかに関係なく、ボタンを押すたびに1/16マイクロステップをトリガーする赤いボタンをテストします。 図3:馴化装置の構成要素。 機械を組み立てるには、ラベルの付いたすべての電子機器が必要です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:電子機器の回路図これはブレッドボード上の回路です。マイクロコントローラボードに接続するワイヤには、プロトコルに記載されているように番号が付けられています。D1とD2はそれぞれ赤と緑のLEDで、330個のΩ抵抗を介してグランドに接続されています。2つのスイッチは10KΩの抵抗でプルアップされます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2.慣れ実験のセットアップ ステンターを入手してください。 35 mmプレートを0.01%ポリオルニチン溶液でコーティングします。3 mLの0.01%ポリオルニチン溶液をプレートに加え、一晩放置します。 プレートを超純水で2回、低温殺菌湧水(PSW)で1回洗浄します(材料表)。 35 mmプレートに3.5 mLのPSWを追加します。 ステントーを6ウェルプレートで洗浄します(材料表)。最初のウェルに3 mLのPSWを追加し、2番目と3番目のウェルに5 mLのPSWを追加します。P1,000ピペットを使用して、培養皿から2 mLの ステントを 6ウェルプレートの最初のウェルに追加します。 実体顕微鏡(材料表)で個々のステントーを識別し、P20ピペットを使用して100個のステントーターを最初のウェルから2番目のウェルに移します。 実体顕微鏡で個々のス テント ーを識別し、P20ピペットを使用して100個の ステントー を2番目のウェルから3番目のウェルに移します。 P200ピペットを使用して、35 mmプレートの最終容量が4 mLになるように、6ウェルプレートの3番目のウェルから35 mmプレートに合計500 μLの 100 Stentor を移します。 白い紙(7 cm x 7 cm)を慣れ装置の金属製定規にテープで留めます。用紙の左端がアーマチュアに最も近い定規の端から2 cm離れていることを確認します。 両面テープを使用して、35 mmプレートの下部を、慣れ装置の定規の上にある2インチx2インチの紙の中心に接着します。 蓋を閉めた状態で、35 mmプレートを馴化装置に少なくとも2時間(これは一晩延長できます)放置します。この順応期間を通して、プレートを実験的な光条件に一致する周囲光条件に保ちます(つまり、細胞を明暗変動にさらさないでください)。さらに、プレートに偶発的な衝撃による機械的摂動が発生していないことを確認してください。 USB顕微鏡カメラ(材料表)を ステンターの35mmプレートの真上に中央に配置します。必要に応じて、ユニバーサルシリアルバス(USB)顕微鏡カメラの下にピペットチップボックスなどの支柱を置き、高さを調整します。あるいは、リングスタンドを使用して高さを調整することもできます。 Webcamレコーダーアプリケーションをラップトップ(材料表)にインストールし、それを使用して顕微鏡入力 を介して 細胞を視覚化します。ウェブカメラレコーダーアプリを開き、ドロップダウンメニューからUSB顕微鏡を選択します。USB顕微鏡カメラのピントを調整して、細胞がはっきりと見えるようにします。 USB顕微鏡カメラの位置を調整して、視野内のセル数を最大化します。 マイクロコントローラボードのシリアルモニタを開きます :ライン終了なし を選択し、9,600ボーに設定します。 マイクロコントローラボードプログラムで l コマンドを使用して、アーマチュアが定規にほとんど触れなくなるまで下げます。必要に応じて r コマンドを使用してアームを上げ、正確な位置を調整します。注意: アーマチュアが定規からかなり離れている場合は、 d コマンドを入力してモーターコイル電流を無効にし、アームを手動で定規に向かって移動できるようにします。アームを手動で動かした後、 e コマンドを使用してモーターコイル電流を有効にし、アームを所定の位置にロックしたままにします。実験開始前に適切に下げると、アーマチュアの下端が定規の左端から1 cm離れている必要があります。アーマチュアは定規を叩くことによって機械的なパルスを届けます。 i コマンドを使用して、慣れ装置の自動モードを初期化します。 コマンド ラインにステップ サイズを入力します。レベル 5 は最小ステップで、レベル 1 は最大ステップです。レベル4は、ベースラインの馴化実験に使用されるステップサイズです。注:レベル5の刺激により、定規が~0.5mm下向きに変位します。レベル4では、~1 mm下向きの変位が発生します。レベル3では、~2 mm下向きの変位が発生します。レベル2では、~3〜4 mm下向きの変位が発生します。レベル1では、~8 mm下向きの変位が発生します。レベル5の刺激は、~0.122 Nの定規に対する電機子の下向きのピーク力をもたらします。レベル4は~0.288 Nの下向きのピーク力をもたらします。レベル3では、~0.557 Nの下向きのピーク力が得られます。レベル1とレベル2によって生成される下向きの力は、アーマチュアが接触した後に発生する大きな定規振動のために、ダイナモメータで経験的に定量化することがより困難です。 パルス間の時間を分単位で入力します。ベースライン慣れ実験に使用される間隔は1分です。 赤い録画ボタンを押して、Webカメラレコーダーアプリを使用してビデオの撮影を開始します。次に、馴化装置のスイッチを入れて、最初の自動機械的パルス配信で実験を開始します。 3. 実験映像の解析 最初の機械的パルスがビデオに表示される直前に、一時停止して、35 mmプレートの底に固定され、細長いトランペットのような形状に伸びている ステントーター の数を数えます(図5A、ビデオ1)。 最初のパルスの直後に、プレートの底に固定され、ボールのような形に収縮している ステントーター の数を数えます(図5B、ビデオ1)。注:収縮した細胞は、 収縮 イベント中に50ミリ秒以内に体長を10%以上短縮するため、細長い細胞から簡単に識別できます3。 2番目のカウントを最初のカウントで割って、機械的刺激に応答して収縮した ステントー の割合を決定します。 実験ビデオのすべての機械的パルスに対して手順3.1〜3.3を繰り返します。 図5:機械的刺激を受けた後に収縮するステンター。 (A)ステントーターは細長い状態にあり、ペトリプレートの底に固定されています。(B)ステントは、慣れ装置からレベル4の機械的刺激を受けた後に収縮した。画像はUSB顕微鏡で撮影されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 ビデオ1:ステントー契約のビデオ。ステントーターは、馴化装置からレベル4の機械的刺激を毎分受け取ります。これらの細胞はまだ慣れていないので、脈拍を受けた後に収縮します。細胞は、馴化装置の上に置かれたペトリプレートにあります。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。