Um método de homogeneização rápido, simples e padronizado para preparar emulsões de antígenos/adjuvantes para induzir encefalomielite autoimune experimental
Summary
Para induzir encefalomielite autoimune experimental, um modelo animal de esclerose múltipla, os ratos são imunizados com uma emulsão de água em óleo contendo um autoantígeno e adjuvante completo de Freund. Embora existam vários protocolos para a preparação dessas emulsões, um protocolo de homogeneização rápido, simples e padronizado para a preparação de emulsões é apresentado aqui.
Abstract
A encefalomielite autoimune experimental (EAE) compartilha características imunológicas e clínicas semelhantes com a esclerose múltipla (EM) e, portanto, é amplamente utilizada como modelo para identificar novos alvos de medicamentos para um melhor tratamento do paciente. A EM é caracterizada por vários cursos diferentes da doença: EM remitente-recorrente (EMRR), EM progressiva primária (EMPP), EM progressiva secundária (EMSP) e uma forma rara de EM progressiva-recidivante (EMPR). Embora os modelos animais não imitem com precisão todos esses fenótipos contrastantes de doenças humanas, existem modelos EAE que refletem algumas das diferentes manifestações clínicas da EM. Por exemplo, o EAE induzido por glicoproteína oligodendrócitos de mielina (MOG) em camundongos C57BL/6J imita PPMS humanos, enquanto o EAE induzido por proteína proteolipídica (PLP) de mielina em camundongos SJL/J se assemelha ao RRMS. Outros autoantígenos, como a proteína básica de mielina (MBP) e várias cepas diferentes de camundongos também são usados para estudar EAE. Para induzir a doença nesses modelos EAE de imunização de autoantígenos, uma emulsão de água em óleo é preparada e injetada por via subcutânea. A maioria dos modelos EAE também requer uma injeção de toxina pertussis para que a doença se desenvolva. Para uma indução consistente e reprodutível de EAE, é necessário um protocolo detalhado para preparar os reagentes para produzir emulsões de antígeno/adjuvante. O método descrito aqui aproveita um método padronizado para gerar emulsões de água em óleo. É simples e rápido e usa um homogeneizador de agitação em vez de seringas para preparar emulsões de qualidade controlada.
Introduction
Uma quebra da tolerância imunológica pode resultar na geração de distúrbios autoimunes, como a esclerose múltipla (EM). Estima-se que 2,8 milhões de pessoas vivam com EM em todo o mundo1. Embora a causa exata da SM ainda seja amplamente desconhecida, a desregulação das células T e B auto-reativas, bem como defeitos na função Treg, desempenham papéis importantes na patogênese da doença 2,3.
Modelos animais de doenças autoimunes são ferramentas essenciais para investigar possíveis modalidades terapêuticas. O modelo experimental de encefalomielite autoimune (EAE) tem sido usado por quase um século por pesquisadores interessados na EM4. Nos primeiros experimentos, a incidência da doença era relativamente baixa. A introdução do adjuvante de Freund completo (CFA), contendo Mycobacterium e toxina pertussis, possibilitou a indução consistente de EAE em camundongos4. Mais importante ainda, é necessário misturar CFA com um antígeno específico do sistema nervoso central (SNC) para gerar uma emulsão homogênea de água em óleo para induzir EAE. Os modelos de EAE mais comuns atualmente disponíveis são baseados na imunização ativa de camundongos com peptídeos encefalitogênicos. O fundo genético dos camundongos desempenha um papel importante na suscetibilidade à doença, com peptídeos glicoproteína oligodendrócitos de mielina (MOG35-55) e proteína proteolipídica de mielina (PLP139-151) usados para induzir EAE em camundongos C57BL/6J e SJL, respectivamente5. No entanto, outras cepas de camundongos e peptídeos derivados do SNC também podem ser usados.
A qualidade da emulsão CFA/peptídeo é um fator crítico que determina a penetrância da doença no modelo 6 de imunização ativaEAE. Uma emulsão homogênea de água em óleo deve ser preparada misturando os peptídeos encefalitogênicos dissolvidos em tampão aquoso com CFA, caso contrário, os animais não desenvolverão a doença. Numerosos protocolos foram publicados sobre a preparação de emulsões CFA/peptídicas. Exemplos incluem o uso de um vórtice7, sonicação8, seringas e um conector T de três vias9, ou uma seringa apenas5. No entanto, todos esses métodos são difíceis de padronizar e são frequentemente associados a protocolos longos e complicados.
Em comparação com todos os métodos acima, o método simples descrito aqui para a preparação da emulsão oferece as vantagens de não ter diferenças de pessoa para pessoa e ser relativamente rápido. A emulsão é gerada por um homogeneizador agitando os reagentes com uma velocidade, tempo e temperatura definidos, garantindo resultados rápidos e consistentes. Além de induzir a doença no modelo EAE, esse método também pode ser utilizado para estudar outros modelos de doenças autoimunes, como a artrite induzida por colágeno (CIA) e a artrite induzida por antígeno (AIA)6. Portanto, espera-se que esse método possa ser utilizado para induzir consistentemente a doença em outros modelos animais que dependem de emulsões de água em óleo com autoantígenos, como neurite autoimune experimental (EAN)10, tireoidite autoimune experimental (EAT)11, uveíte autoimune (EAU)12 e miastenia gravis (MG)13. Esse método também induz respostas imunes gerais, como hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) de forma consistente6 e, portanto, poderia ser usado para administrar vacinas contra câncer e malária (ver discussão).
Assim, um método rápido (tempo total de preparação ~ 30 min), simples (todos os reagentes podem ser preparados com antecedência e armazenados) e padronizado (a emulsão é realizada usando um homogeneizador de agitação) foi desenvolvido e é apresentado aqui. As emulsões CFA/antígeno preparadas usando este protocolo induzem consistentemente a doença em modelos animais autoimunes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Emulsões de água em óleo, como o antígeno/adjuvante de Freund, têm sido usadas por mais de meio século para induzir EAE17. Atualmente, não existe um método padronizado para preparar emulsões de antígenos que seja independente da influência humana. A mistura manual usando seringas é padrão para a maioria dos laboratórios, no entanto, este método é demorado, muitas vezes resulta em uma perda excessiva de material, e a qualidade difere dependendo do cientista que o prepara.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autor gostaria de agradecer às unidades de alojamento de animais da Universidade de Lund, Camilla Björklöv e Agnieszka Czopek, por seu apoio, e Richard Williams, do Instituto Kennedy de Reumatologia, Universidade de Oxford, Reino Unido, pela crítica construtiva e apoio linguístico na produção deste manuscrito.
Materials
| 1 mL Injection syringe | B. Braun | 9166017V | |
| 1 mL Injection syringe | Sigma-Aldrich | Z683531 | |
| 7 ml empty tubes with caps | Bertin-Instruments | P000944LYSK0A.0 | 7 mL tube |
| 50 mL sterile centrifuge tube | Fisher Scientific | 10788561 | 50 mL tube |
| Bordetella pertussis toxin | Sigma-Aldrich | P2980 | Store at -20 °C |
| Dispersant, light mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | Store at RT |
| Emulsion kit | Bertin-Instruments | D34200.10 ea | Containing a tube, cap, and plunger |
| Incomplete Freund's Adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Store at +4 °C |
| Mycobacterium tuberculosis, H37RA | Fisher Scientific | DF3114-33-8 | Store at +4 °C |
| Mastersizer 2000 | Malvern Panalytical | N/A | Particle size analyzer |
| Minilys-Personal homogenizer | Bertin-Instruments | P000673-MLYS0-A | Shaking homogenizer |
| MOG 35-55 Peptide | Innovagen | N/A | |
| Montanide ISA 51 VG | Seppic | 36362Z | FDA-approved oil adjuvant |
| Pall Acrodisc Syringe Filters 0.2 μm | Fisher Scientific | 17124381 | Sterlie filter |
| PBS, Ca2+/Mg2+ free | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| Phase-Constrast Microscope | Olympus | BX40-B | |
| Steel Beads 3.2 mm | Fisher Scientific | NC0445832 | Autoclave and store at RT |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 648463 | Store at RT |
References
- Walton, C., et al. Rising prevalence of multiple sclerosis worldwide: Insights from the Atlas of MS, third edition. Multiple Sclerosis. 26 (14), 1816-1821 (2020).
- van Langelaar, J., Rijvers, L., Smolders, J., van Luijn, M. M. B and T cells driving multiple sclerosis: identity, mechanisms and potential triggers. Frontiers in Immunology. 11, 760 (2020).
- Sambucci, M., Gargano, F., Guerrera, G., Battistini, L., Borsellino, G. One, No One, and One Hundred Thousand: T Regulatory Cells’ Multiple Identities in Neuroimmunity. Frontiers in Immunology. 10, 2947 (2019).
- Mix, E., Meyer-Rienecker, H., Hartung, H. P., Zettl, U. K. Animal models of multiple sclerosis–potentials and limitations. Progress in Neurobiology. 92 (3), 386-404 (2010).
- Terry, R. L., Ifergan, I., Miller, S. D. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice. Methods in Molecular Biology. 1304, 145-160 (2016).
- Topping, L. M., et al. Standardization of antigen-emulsion preparations for the induction of autoimmune disease models. Frontiers in Immunology. 13, 892251 (2022).
- Flies, D. B., Chen, L. A simple and rapid vortex method for preparing antigen/adjuvant emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 276 (1-2), 239-242 (2003).
- Määttä, J. A., Erälinna, J. P., Röyttä, M., Salmi, A. A., Hinkkanen, A. E. Physical state of the neuroantigen in adjuvant emulsions determines encephalitogenic status in the BALB/c mouse. Journal of Immunological Methods. 190 (1), 133-141 (1996).
- Moncada, C., Torres, V., Israel, Y. Simple method for the preparation of antigen emulsions for immunization. Journal of Immunological Methods. 162 (1), 133-140 (1993).
- Waksman, B. H., Adams, R. D. Allergic neuritis: an experimental disease of rabbits induced by the injection of peripheral nervous tissue and adjuvants. The Journal of Experimental Medicine. 102 (2), 213-236 (1955).
- Vladutiu, A. O., Rose, N. R. Autoimmune murine thyroiditis relation to histocompatibility (H-2) type. Science. 174 (4014), 1137-1139 (1971).
- Caspi, R. R. Experimental autoimmune uveoretinitis in the rat and mouse. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Tuzun, E., et al. Guidelines for standard preclinical experiments in the mouse model of myasthenia gravis induced by acetylcholine receptor immunization. Experimental Neurology. 270, 11-17 (2015).
- Brinckerhoff, L. H., et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. International Journal of Cancer. 83 (3), 326-334 (1999).
- Kool, M., et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 205 (4), 869-882 (2008).
- Hasselmann, J. P. C., Karim, H., Khalaj, A. J., Ghosh, S., Tiwari-Woodruff, S. K. Consistent induction of chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice for the longitudinal study of pathology and repair. Journal of Neuroscience Methods. 284, 71-84 (2017).
- Freund, J., Lipton, M. M. Experimental allergic encephalomyelitis after the excision of the injection site of antigen-adjuvant emulsion. The Journal of Immunology. 75 (6), 454-459 (1955).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. Journal of Visualized Experiments. (62), e3778 (2012).
- Arevalo-Herrera, M., et al. Randomized clinical trial to assess the protective efficacy of a Plasmodium vivax CS synthetic vaccine. Nature Communications. 13 (1), 1603 (2022).
- Jiang, C., et al. Potential association factors for developing effective peptide-based cancer vaccines. Frontiers in Immunology. 13, 931612 (2022).
- Neninger Vinageras, E., et al. Phase II randomized controlled trial of an epidermal growth factor vaccine in advanced non-small-cell lung cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (9), 1452-1458 (2008).
