カスタムメイド給餌システムを用いたマウスのリズミカルな食物摂取量の操作

すべての動物の被験者は、テキサスA&M大学の施設動物管理および使用委員会(AUP #2022-0050)によって定められたガイドラインに従って使用されます。ここでは、生後2〜4か月の雄と雌の両方のC57BL / 6マウスが使用されます。供給システムを構築するための手順を以下に説明し、装置を構築するために必要な原材料を 材料表で参照する。 1. 給餌システムの構築 ポリ塩化ビニル(PVC)ベースの建設次の寸法に従ってカットされた0.25インチのPVCシートを4枚調達します:4.875インチx4.5インチ。4.875インチx2.125インチ;9.5インチx2.125インチ(2個)。 図 1A に示す測定値を使用して、4.875 インチ x 4.5 インチのベースに 24 時間のタイマーを取り付けるための 4 つの穴を開けます。 図1Aのように、4枚のPVCを接着してベースを取得します。 PVCベースのタイマーの固定タイマーを開いてプラグを取り外します。標準の延長/電気コードを使用して接続します(図1B)。 タイマーをPVCベースに配置して、手順1.1.1でベースに開けた穴に合わせます。1.5インチのネジを使用して、タイマーをPVCベースに固定します。タイマーが平らで、PVCベースで安定していることを確認してください。 タイマーの上部に4つの穴を開け、0.75インチのネジを固定して8コンパートメントの食品容器を保持します(図1B)。システムのベースが完成し、 図1Cのようになります。注意: タイマー全体に穴を開けないでください。 ケージのセットアップ4インチの高さで4インチのPVCチューブ(外径3.5インチ)を切り取ります。パイプの底に約0.5インチの穴を開けて、電気ケーブルを通します。 パイプの上部を研磨して(ルーターや回転工具などを使用して)、食品容器を交換するときにキャップを簡単に取り外せるようにします。 幅が4.5インチを超えるマウスケージを使用し、ホールソーを使用してケージの下部に4.5インチの穴を開けます。注意: 穴の位置は、ケージのセットアップによって異なります(たとえば、ケージの上部とウォーターボトルの位置、ランニングホイールの追加など)。 給餌コンテナのセットアップ図1Dに示すように、4インチの8コンパートメントジュエリーオーガナイザーからフードディスペンサーを作成します。パイプにうまく収まるように容器の縁を切ります。 4インチのPVCパイプキャップを使用し、単一のディスペンサーコンパートメントのサイズに対応する穴を開けて(回転工具など)、一度に8つのコンパートメントの1つだけを露出させる開口部を作成します。タイマーが動くと、開口部は3時間ごとに新しいコンパートメントを露出させます。これで、供給システムコンポーネントを使用する準備が整いました。すべてのケージが設定されると、最終的なセットアップは 図1Eのようになります。 一度に多くの食品容器を輸送するのは面倒な場合があります。輸送を容易にするために、0.25インチのPVCパイプを3本取ります。2つのピースの中央に0.625インチの穴を開け、それらを接着します。次に、 図1Fに示すように、穴に収まり、フードカップの中央を通る細い0.625インチのPVCパイプを使用して、フードカップを積み重ねて輸送を容易にします。 マウスを導入する前に、セットアップを電源コンセントに接続し、記録された時間に1つのコンパートメントにネストレットを配置し、12時間後にネスレットの位置を監視して、タイマーがすぐに回転することを確認することにより、タイマーをテストします。 2.給餌システムの適用 マウスの食物摂取量の連続測定マウスを実験室に移し、部屋に設定された明暗(LD)サイクルに少なくとも1週間、明暗サイクルが3時間以上ずれた場合は2週間順応させます。この実験では、LD 12:12に曝露された生後2〜4か月の男性と女性のC57BL / 6マウスからデータを収集します(n = 7人の男性と4人の女性)。 マウスをフィーダーケージに個々に収容する前にマウスの体重を記録する(体重は午後3:00、すなわち食物交換が行われた時点で記録した)。マウスが水と十分な寝具と小節に 自由 にアクセスできることを確認してください。 フィーダーカップの8つのコンパートメントすべてに1.5 gの食品(日常的に使用されている45 mgのほこりのない精密ペレット)を追加します。フィーダーカップをタイマーの上に置きます。次に、1つのコンパートメントだけが露出するようにフィーダーカップに蓋をし、食品の提示の時間をメモします。4 つのコンパートメントは夜間のポイントを表し、他の 4 つのコンパートメントは日中のポイントを表します。注:過剰な食物提示時に観察された買いだめ行動のため、1.5gが開始食品重量として最適化されました。マウスは、フードカップの蓋の上またはケージ内の寝具のいずれかにペレットを蓄える傾向があります。これにより、データが歪んで誤解が生じます。オスのマウスは、コンパートメントあたり1.5 g以下を与えた場合、ペレットを蓄えません。女性は男性よりも食べ物を蓄える傾向がありますが、これはマウス固有であり、コンパートメントごとに1 gのペレットを提供すると弱めることができます。 毎日同時に食べ物を交換し、各コンパートメントに残っているペレットの数を数えて、消費された食べ物の量を計算します。1週間の摂食プロファイルを監視して、 自由摂取を与えられたマウスのベースライン摂食プロファイルを取得します。 すべてのコンパートメントで消費される食物に基づいて、各マウスの毎日の平均食物消費量を計算します(図2)。 高脂肪食(HFD)治療注:この給餌システムは、代謝性疾患に対するHFDの効果を研究するためにも使用でき、最終的には時間制限のある給餌スケジュールに使用できます。HFDは正確なサイズと重量のペレットとして市販されておらず、供給用のペレットは通常0.5インチのペレットとして調達されます。HFDペレットをきれいな表面または透明なフィルムに置き、かみそりの刃を使用して均一なサイズの6〜7個の小さな断片にカットします。上記のセクション2.1で使用されている通常のチャウペレットに似せるように、ペレットを十分に小さくカットします。注:マウスはケージに大きなペレットを蓄える傾向があり、消費される食物の誤算につながります。 カットされたHFD片1.5 gを量り、8つの食品コンパートメントのそれぞれに入れます。一日おきに食品を交換するには、コンパートメントあたり1.5 gのHFDで十分です。 実験の必要性に従って毎日または隔日で食べ物を交換し、残っている食べ物の重量を記録します。 与えられた食物の初期量から食物の残りの重量を差し引くことによって消費される食物の量を計算します。このプロセスを1週間にわたって繰り返して、HFD食物摂取量のベースラインを取得します(図2)。 オスマウスを夜間制限(NR)食に順応させる手順2.1.1〜2.1.4に従って、 自由 摂取のベースラインを取得します。この実験では、LD 12:12(n = 18人の男性)に曝露された生後2〜4か月の雄C57BL / 6マウスからデータを収集します。 自由食の3〜7日後、マウスを一日区画内のペレットの数を徐々に減少させることによって移行食に入れる。これを行うには、移行の1日目にコンパートメントあたり5つのペレット(コンパートメントあたり0.225 g)、2日目に3つのペレット(コンパートメントあたり0.135 g)、3日目に1つのペレット(コンパートメントあたり0.045 g)があり、その後は何もせずに、夜間制限食でマウスを完全に移行させます。注意: マウスがカロリー制限されていないことを確認してください。 自由摂取 ベースラインに基づいてコンパートメントあたりのマウスの毎日の食物消費量を平均し、同じ量の食物を与えて、4泊の区画にのみ分配します。 マウスが夜間制限レジメンに適応した後、2週間食物摂取量を監視し続けます。この期間中、各マウスに与える食物の量を、その総食物消費量に合わせて調整します(図3A)。通常、マウスが2泊連続ですべての食べ物を食べるときに、食物ペレット(4つの夜間区画のそれぞれに1つのペレット)を追加します。 2週間の終わりにマウスの体重を量り、摂食レジメンによる体重の変化を監視します。この期間の終わりに、マウスをイソフルランで麻酔し、断頭によって安楽死させる。組織を収集し、摂食パラダイムによる日々の変化についてそれらを分析します。 雄マウスを不整脈(AR)食に順応させる手順2.1.1〜2.1.4に従って、 自由 摂取のベースラインを取得します。この実験では、LD 12:12(n = 18人の男性)に曝露された生後2〜4か月の雄C57BL / 6マウスからデータを収集します。 1週間 の自由 食の後、1日あたりの平均食物消費量を計算し、その数を8で割って、各コンパートメントで提供される食物の量を求めます。マウスが一日を通して8つのコンパートメントすべてで同じ量の食物を確実に得ることによって、AR摂食を達成します。 次いで、マウスを移行食に乗せ、3〜5日間かけて、区画当たりに与えられる食物の量を徐々に減少させ、最終的に食物摂取の任意のリズムを廃止する( 図3Bに示されるように)。ARダイエット中は、マウスが8つのコンパートメントのそれぞれで1日の食物摂取量の1/8にアクセスできるようにし、3時間ごとに食物にアクセスできるようにします。マウスがカロリー制限されていないことを確認してください。 マウスをAR食で2週間以上維持する(図3B)。 ARダイエット中は、マウスが数個のペレット(通常は5未満)しか残らないように、毎日食べ物を調整してください。これにより、マウスは適切な量の食物を摂取し、カロリー制限を受けなくなります。食物摂取のリズムを引き起こさないように、8つのコンパートメントすべてでペレットを減らすか追加するか、2つの反対側のコンパートメントでペレットを減らすか追加することによって調整します。注:ARダイエットの下で与えられたマウスは、ZT3からZT9の間(点灯後3時間から9時間の間)にほぼ独占的に食物を残しますが、夜に空腹であり、次のコンパートメントにアクセスするためにフードディスペンサーを噛みます。それにもかかわらず、AR給餌マウスはカロリー制限されておらず、実際、時間の経過とともにNR給餌マウスよりも体重が増えます。 2週間の終わりにマウスの体重を量り、摂食レジメンによる体重の変化を監視します。この期間の終わりに、マウスをイソフルランで麻酔し、断頭によって安楽死させる。組織を収集し、摂食パラダイムによる日々の変化についてそれらを分析します。