JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

מניפולציה של צריכת מזון קצבית בעכברים באמצעות מערכת הזנה מותאמת אישית

Published: December 16, 2022
doi:
10.3791/64624
, , ,
1Department of Biology,Texas A&M University, 2Center for Biological Clocks Research,Texas A&M University, 3Interdisciplinary Program of Genetics,Texas A&M University

Summary

הגבלת העיתוי של צריכת המזון התגלתה כהתערבות מבטיחה להחלשת מחלות מטבוליות הנגרמות על ידי דיאטה. כתב יד זה מפרט את הבנייה והשימוש במערכת יעילה שנבנתה בתוך הבית למדידה ומניפולציה של צריכת מזון קצבית בעכברים.

Abstract

ביטוי גנים ריתמיים הוא סימן ההיכר של השעון הביולוגי והוא חיוני להנעת הריתמוס של תפקודים ביולוגיים בשעה המתאימה ביום. מחקרים שנערכו בעשורים האחרונים הראו כי צריכת מזון קצבית (כלומר, הזמן שבו אורגניזמים אוכלים מזון במהלך 24 שעות היממה), תורמת באופן משמעותי לוויסות ריתמי של ביטוי גנים באיברים וברקמות שונות בגוף. ההשפעות של צריכת מזון קצבית על הבריאות והפיזיולוגיה נחקרו רבות מאז וגילו כי הגבלת צריכת המזון למשך 8 שעות במהלך השלב הפעיל מחלישה מחלות מטבוליות הנובעות ממגוון דיאטות אובסוגניות. מחקרים אלה דורשים לעתים קרובות שימוש בשיטות מבוקרות לתזמון מסירת מזון לבעלי חיים. כתב יד זה מתאר את התכנון והשימוש במערכת זולה ויעילה, הבנויה בתוך הבית למדידת צריכת מזון יומית וכן מניפולציה של צריכת מזון קצבית בעכברים. מערכת זו כוללת שימוש בחומרי גלם במחיר סביר לבניית כלובים המתאימים למשלוחי מזון, בהליך טיפול ידידותי למשתמש. ניתן להשתמש במערכת זו ביעילות כדי להאכיל עכברים במשטרי האכלה שונים כגון אד ליביטום, לוחות זמנים מוגבלים בזמן או הפרעות קצב, והיא יכולה לשלב תזונה עתירת שומן כדי לחקור את השפעתה על התנהגות, פיזיולוגיה והשמנת יתר. ניתן תיאור של האופן שבו עכברי בר (WT) מסתגלים למשטרי האכלה שונים.

Introduction

השעון הצירקדי נמצא בכל מקום במינים שונים ומספק מנגנון שמירת זמן המסייע לאורגניזמים להסתגל לסביבתם המשתנה בקצב. קוצב הלב היממה הראשי ממוקם בגרעין הסופרה-כיאזמטי (SCN) של ההיפותלמוס. ה-SCN מאומן בעיקר על-ידי מחזור האור-חושך הסביבתי, ומסנכרן שעונים היקפיים הקיימים כמעט בכל תא בגוף באמצעות רמזים מרובים, כולל אותות עצביים והורמונליים, הזנה וטמפרטורת גוף 1,2,3,4,5,6,7,8 . ביונקים, השעון הצירקדי המולקולרי מסתמך על גורם השעתוק ההטרודימרי CLOCK: BMAL1 9,10, השולט על ביטוי הגנים של שעון הליבה הנקראים Period (Per1, Per2 ו-Per3) ו-Cryptochrome (Cry1 ו-Cry2) כדי ליזום לולאת משוב שעתוק שהיא קריטית ליצירת מקצבים צירקדיים9,11,12 . השעון המולקולרי גם מווסת את השעתוק הקצבי של אלפי גנים השולטים בריתמוס של כמעט כל פונקציה ביולוגית13,14,15. יותר מ-50% מהגנום ביונקים מבוטא באופן ריתמי לפחות בסוג רקמה אחד 16,17,18, וברקמות כמו הכבד בעכברים יש כ-25%-30% מהשעתוק שלהם מבוטא באופן ריתמי18,19. ביטוי גנים ריתמי חיוני להפעלת תהליכים ביולוגיים חשובים כגון בקרת מחזור התא20, הומאוסטזיס גלוקוז 21 ומטבוליזם של חומצות אמינו22 בזמן הנכון של היום על מנת להגביר את כושר האורגניזם.

במהלך העשורים האחרונים, יש ראיות הולכות וגדלות המצביעות על כך שצריכת מזון יכולה לשמש כרמז סנכרון רב עוצמה לאימון מקצבים בביטוי גנים ברקמות מרובות, כולל הכבד23,24. חשוב לציין, הוכח כי הזנה מאמנת מקצבים בכבד ללא תלות ב-SCN או במחזור אור-חושך25, והזנה קצבית יכולה להניע ביטוי גנים ריתמי מבלי לערב את השעון המולקולרי 26,27,28,29,30,31. הזנה המוגבלת לתקופה הלא פעילה של עכברים (בשעות היום) הופכת את שלב הביטוי של גני שעון הליבה ושל גנים ריתמיים רבים31. הזנה מוגבלת בזמן (TRF), שהיא התערבות תזונתית שבה צריכת הקלוריות היומית מוגבלת לתקופה של 8-10 שעות, הוכחה כמגנה מפני השמנת יתר, היפראינסולינמיה, סטאטוזיס בכבד ותסמונת מטבולית32,33. כל הניסויים הנ”ל הכוללים מניפולציה של צריכת מזון דורשים מהנסיין לעשות שימוש בשיטות יעילות כדי לספק מזון בשעה הנכונה של היום.

פותחו שיטות שונות לאספקת מזון, הנושאות מספר יתרונות וחסרונות 29,34,35,36,37,38,39 (טבלה 1). חלק מהמזינים האוטומטיים תוכננו לפעול על בסיס תוכנה השולטת בכמות, משך ועיתוי זמינות המזון תוך תיעוד האכלה ופעילות ריצה רצונית בעכברים34. בכמה שיטות אחרות מוכנסים עכברים לכלובים שונים לתנאי הזנה שונים, כאשר הנסיין מוסיף ידנית כדורי מזון בזמן המוקדם38,39. מערכת אחרת משתמשת במערכת הזנה אוטומטית הנשלטת על ידי מחשב שבו מגן מונע פניאומטי מונע גישה למזון ואשר ניתן לשלוט בו על ידי מרווחי זמן או מסת מזון35. כל השיטות הללו דורשות שימוש והתקנה של תוכנה ממוחשבת שיכולה להיות יקרה ודורשת הכשרה מסוימת לתפעול תקין של המכשיר, או שהן דורשות עבודה רבה מכיוון שהנסיין צריך להיות נוכח בזמנים ספציפיים כדי לשנות ידנית את תנאי ההזנה. גם מערכות ממוחשבות מגיעות עם לא מעט בעיות, ביניהן תקלה במנופים או בדלתות שמאפשרות לאוכל לצאת, כדורי מזון שנתקעים בשקעים ותקלות תוכנה. יתר על כן, הצליל שעשוי להיות מופק במהלך פתיחת דלתות או מנופים מהווה את הסיכון של עכברי התניה לקשר אותם עם משלוח מזון, ובכך לפגוע בפרשנות ההשפעות של מניפולציה במזון כנובעים אך ורק מגישה למזון או בשל השפעות על מקצבים התנהגותיים אחרים כגון מחזור שינה/ערות. המטרה הכוללת של מחקר זה הייתה לפתח מערכת זולה ויעילה למניפולציה של צריכת מזון קצבית לטווח ארוך שתסייע להקל על רבות מהסוגיות שהוזכרו לעיל. בראש ובראשונה, ניתן לבנות את מערך ההזנה שפותח ויתואר להלן בעלות מינימלית ביותר בהשוואה למכונות האוטומטיות (טבלה 2) ואינו דורש הכשרה מתוחכמת לטיפול, תפעול ותחזוקה. שנית, מערכת ההזנה מפיקה רק רעש לבן ברקע וללא קולות חזקים במהלך משלוח המזון, ובכך מונעת התניה פבלובית. בסך הכל, מערכת הזנה זו היא כלכלית, נגישה ואמינה יותר לחוקרים תוך שהיא עדיין יעילה במניפולציה של צריכת מזון קצבית.

Protocol

כל הנבדקים בבעלי חיים משמשים בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת טקסס A&M (AUP #2022-0050). עכברי C57BL/6 זכרים ונקבות בגילאי 2-4 חודשים משמשים כאן. הליך בניית מערכת ההזנה מתואר להלן, וחומרי הגלם הדרושים לבניית המנגנון מוזכרים בטבלת החומרים. 1. בניית מערכת ההזנה בניית בסיס פולי ויניל כלוריד (PVC)רכוש ארבע חתיכות של יריעות PVC בגודל 0.25 אינץ’ חתוכות לפי המידות הבאות: 4.875 אינץ’ x 4.5 אינץ’; 4.875 אינץ ‘x 2.125 אינץ ‘; 9.5 אינץ ‘x 2.125 אינץ ‘(שני חלקים). קדח ארבעה חורים בבסיס בגודל 4.875 אינץ’ x 4.5 אינץ’ לחיבור טיימר של 24 שעות באמצעות המדידות המוצגות באיור 1A. הדביקו את ארבע חתיכות ה-PVC כדי לקבל את הבסיס כמו באיור 1A. אבטחת הטיימר על בסיס PVCפתח את הטיימר כדי להסיר את התקע. צרו חיבור באמצעות כבל מאריך/חשמלי סטנדרטי (איור 1B). מקם את הטיימר על בסיס PVC כדי ליישר אותו עם החורים שנקדחו בבסיס בשלב 1.1.1. השתמש בברגים בגודל 1.5 אינץ’ כדי לתקן את הטיימר בבסיס PVC. ודא שהטיימר שטוח ויציב על בסיס PVC. קדח ארבעה חורים מעל הטיימר וקבע ברגים בקוטר 0.75 אינץ’ כדי להחזיק את מכל המזון בעל שמונת התאים (איור 1B). הבסיס של המערכת שלם ונראה כמו איור 1C.אזהרה: אין לקדוח את החורים לאורך כל הטיימר. הגדרת כלובחותכים צינור PVC בגודל 4 אינץ’ (קוטר חיצוני של 4.5 אינץ’) בגובה 3.125 אינץ’. קדח חור של כ -0.5 אינץ ‘בתחתית הצינור כדי לאפשר לכבל החשמל לעבור. חול בחלק העליון של הצינור (למשל, עם נתב או כלי סיבובי) כדי לאפשר להסיר את המכסה בקלות בעת החלפת מיכל המזון. השתמש בכלוב עכבר ברוחב גדול מ -4.5 אינץ ‘וחתוך חור של 4.5 אינץ ‘בתחתית הכלוב באמצעות מסור חור.הערה: מיקום החור תלוי במערך הכלוב (למשל, מיקום ראש הכלוב ובקבוק המים, הוספת גלגל ריצה וכו’). הגדרת מיכל הזנההכינו מתקן מזון ממארגן תכשיטים בגודל 4 אינץ’ עם שמונה תאים, כפי שמוצג באיור 1D. חותכים את שפת המיכל כך שהוא מתאים היטב לתוך הצינור. השתמש במכסה צינור PVC בגודל 4 אינץ’ וחתוך חור המתאים לגודל של תא מתקן יחיד (למשל, עם כלי סיבובי) כדי ליצור פתח שחושף רק אחד משמונת התאים בכל פעם. כאשר הטיימר זז, הפתח חושף תא חדש כל 3 שעות. רכיבי מערכת ההזנה מוכנים כעת לשימוש. לאחר שכל הכלובים מסודרים, המבנה הסופי דומה לזה שמוצג באיור 1E. הובלה של מכולות מזון רבות בכל פעם יכולה להיות מסורבלת. כדי להקל על ההובלה, קח שלוש חתיכות של צינור PVC בגודל 0.25 אינץ ‘. קדח חור בקוטר 0.625 אינץ’ במרכז שתי חתיכות והדביק אותן זו לזו. לאחר מכן, השתמשו בצינור PVC צר בקוטר 0.625 אינץ’ שנכנס לחור ודרך מרכז כוסות המזון כדי לערום כוסות מזון כדי להקל על הובלתן, כפי שמוצג באיור 1F. בדוק את הטיימרים לפני הצגת העכברים על ידי חיבור ההתקנה לשקעי חשמל, הנחת חתיכת קינון בתא אחד בזמן מוקלט, וניטור מיקום הקן 12 שעות מאוחר יותר כדי לוודא שהטיימר מסתובב מיד. 2. יישום מערכת ההזנה מדידה רציפה של צריכת מזון בעכבריםהעבירו עכברים לחדר הניסוי והתרגלו למחזור אור-חושך (LD) שנקבע בחדר למשך שבוע אחד לפחות, ולמשך שבועיים אם מחזור האור-חושך מוסט ביותר מ-3 שעות. לצורך ניסוי זה, הנתונים נאספים מעכברים זכרים ונקבות C57BL/6 בגילאי 2-4 חודשים שנחשפו ל-LD 12:12 (n = 7 זכרים ו-4 נקבות). שיא משקל עכברים לפני שיכונם בנפרד בכלובי ההזנה (המשקולות נרשמו בשעה 15:00, כלומר בזמן ביצוע החלפת המזון). ודאו שלעכברים יש גישה למים ומספיק מצעים וקינים. הוסף 1.5 גרם מזון (בשימוש שגרתי 45 מ”ג של כדורים מדויקים ללא אבק) לכל שמונת התאים של ההזנה. הניחו את ההזנה על הטיימר. לאחר מכן, הניחו את המכסה על ההזנה כך שרק תא אחד חשוף, ושימו לב לזמן הצגת המזון. ארבעה תאים מייצגים נקודות לילה וארבעת האחרים מייצגים נקודות זמן יום.הערה: בשל התנהגות אגרנות שנצפתה בעת הצגת מזון עודפת, 1.5 גרם היה אופטימלי כמשקל המזון ההתחלתי. עכברים נוטים לאגור כדוריות על גבי מכסי כוסות מזון או במצעים בתוך הכלוב. זה מטה את הנתונים ומוביל לפרשנות שגויה שלהם. עכברים זכרים אינם אוגרים כדוריות כאשר הם מוזנים ב-1.5 גרם או פחות לתא. נקבות נוטות לאגור מזון יותר מאשר זכרים, אבל זה ספציפי לעכבר וניתן להחליש אותו אם מספקים 1 גרם של גלולה לכל תא. החליפו מזון כל יום באותה שעה וספרו את מספר הכדורים שנותרו בכל תא כדי לחשב את כמות המזון הנצרכת. עקוב אחר פרופיל ההאכלה במשך שבוע כדי לקבל פרופיל הזנה בסיסי של עכברים שניזונו אד ליביטום. בהתבסס על המזון הנצרך בכל תא, חשבו את צריכת המזון היומית הממוצעת עבור כל עכבר (איור 2). טיפול בדיאטה עתירת שומן (HFD)הערה: מערכת הזנה זו יכולה לשמש גם לחקר ההשפעה של HFD על מחלות מטבוליות ובסופו של דבר לשמש ללוחות זמנים מוגבלים בזמן האכלה. HFD אינו זמין מסחרית ככדורי גודל ומשקל מדויקים, והכדורים להאכלה נרכשים בדרך כלל ככדורי 0.5 אינץ ‘.מניחים את כדורי HFD על משטח נקי או סרט שקוף וחתכו אותם ל 6-7 חתיכות קטנות יותר בגודל אחיד באמצעות סכין גילוח. חתכו את הכדוריות קטנות מספיק כך שיהיו דומות לכדורי צ’או רגילים כפי שנעשה בסעיף 2.1 לעיל.הערה: עכברים נוטים לאגור כדוריות גדולות יותר בכלובים שלהם, מה שמוביל לחישוב שגוי של המזון הנצרך. שוקלים 1.5 גרם של חתיכות HFD חתוכות ומניחים בכל אחד מ-8 תאי המזון. עבור החלפת מזון כל יומיים, 1.5 גרם של HFD לכל תא מספיק. החליפו את המזון כל יום או כל יומיים לפי צרכי הניסוי ותיעדו את משקל המזון שנותר. חישוב כמות המזון הנצרכת על ידי הפחתת המשקל הנותר של מזון מכמות המזון הראשונית שניתנה. חזרו על התהליך הזה במשך שבוע אחד כדי לקבל בסיס של צריכת מזון HFD (איור 2). התאקלמות עכברים זכרים לדיאטה מוגבלת בלילה (NR)בצע את שלבים 2.1.1-2.1.4 כדי לקבל בסיס של הזנת ad libitum . לצורך ניסוי זה, הנתונים נאספים מעכברי C57BL/6 זכרים בגילאי 2-4 חודשים שנחשפו ל-LD 12:12 (n = 18 זכרים). לאחר 3-7 ימים של דיאטת אד ליביטום , הכניסו את העכברים לדיאטת מעבר על ידי הפחתה הדרגתית של מספר הכדוריות בתאי היום. כדי לעשות זאת, יש חמישה כדורים לתא ביום הראשון של המעבר (0.225 גרם לתא), 3 כדורים ביום 2 (0.135 גרם לתא), 1 גלולה ביום 3 (0.045 גרם לתא), ואף אחד לאחר מכן לא להעביר את העכברים לחלוטין על דיאטה מוגבלת בלילה.הערה: ודא שעכברים אינם מוגבלים בקלוריות. ממוצע צריכת המזון היומית של עכברים לתא בהתבסס על קו הבסיס של ad libitum ולתת להם את אותה כמות מזון, ולחלק אותה רק על פני תאים של ארבעה לילות. המשך לעקוב אחר צריכת המזון במשך שבועיים לאחר שהעכברים הסתגלו למשטר מוגבל בלילה. במהלך התקופה הזו, התאימו את כמות המזון הניתנת לכל עכבר כך שתתאים טוב יותר לצריכת המזון הכוללת שלו (איור 3A). בדרך כלל מוסיפים כדורי מזון (גלולה אחת לכל אחד מארבעת תאי הלילה) כאשר עכברים אוכלים את כל מזונם במשך שני לילות רצופים. לשקול את העכברים בסוף תקופה של 2 שבועות כדי לפקח על כל שינוי במשקל עקב משטר האכלה. בסוף תקופה זו, להרדים את העכברים עם isoflurane ולהרדים אותם על ידי עריפת ראש. לאסוף רקמות ולנתח אותם עבור שינויים יומיומיים עקב פרדיגמת האכלה. הסתגלות עכברים זכרים לתזונה של הפרעות קצב (AR)בצע את שלבים 2.1.1-2.1.4 כדי לקבל בסיס של הזנת ad libitum . לצורך ניסוי זה, הנתונים נאספים מעכברי C57BL/6 זכרים בגילאי 2-4 חודשים שנחשפו ל-LD 12:12 (n = 18 זכרים). לאחר שבוע של דיאטת אד ליביטום , חשבו את צריכת המזון הממוצעת ליום וחלקו את המספר הזה ב-8 כדי לקבל את כמות המזון שתסופק בכל תא. השיגו האכלה במציאות רבודה על ידי הבטחה שהעכברים יקבלו כמות שווה של מזון בכל שמונת התאים לאורך היום. לאחר מכן, הכניסו את העכברים לדיאטת מעבר על-ידי הפחתה הדרגתית, במשך 3-5 ימים, של כמות המזון הניתנת בכל תא כדי לבטל בסופו של דבר כל קצב של צריכת מזון (כפי שמוצג באיור 3B). כאשר אתם בדיאטת מציאות רבודה, ודאו שלעכברים יש גישה ל-1/8 מצריכת המזון היומית שלהם בכל אחד משמונת התאים, וכך גישה למזון בכל 3 שעות. ודאו שהעכברים אינם מוגבלים בקלוריות. שמרו על העכברים בדיאטת מציאות רבודה במשך שבועיים או יותר (איור 3B). במהלך דיאטת AR, התאימו את המזון מדי יום כדי לוודא שהעכברים משאירים רק כמה כדורים מאחור (בדרך כלל פחות מ-5). זה מבטיח שהעכברים מקבלים בדיוק את כמות המזון הנכונה ואינם מוגבלים בקלוריות. בצע התאמות על ידי הפחתה או הוספה של כדורים בכל שמונת התאים או על ידי הקטנה או הוספה של כדורים בשני תאים מנוגדים, כדי לא לגרום למקצבים כלשהם של צריכת מזון.הערה: עכברים המוזנים תחת דיאטת AR משאירים מזון כמעט אך ורק בין ZT3 ל-ZT9 (בין 3 שעות ל-9 שעות לאחר הדלקת האור) אך רעבים בלילה ונושכים את מתקן המזון כדי לגשת לתא הבא. עם זאת, עכברים הניזונים ממציאות רבודה אינם מוגבלים בקלוריות, ולמעשה עולים במשקל רב יותר מאשר עכברים הניזונים מ-NR לאורך זמן. לשקול את העכברים בסוף תקופה של 2 שבועות כדי לפקח על כל שינוי במשקל עקב משטר האכלה. בסוף תקופה זו, להרדים את העכברים עם isoflurane ולהרדים אותם על ידי עריפת ראש. לאסוף רקמות ולנתח אותם עבור שינויים יומיומיים עקב פרדיגמת האכלה.

Representative Results

מערכת ההזנה שתוארה לעיל יכולה לשמש למניפולציה ארוכת טווח של צריכת מזון קצבית בעכברים. מערכת זו למעשה חושפת תא מזון חדש לעכבר כל 3 שעות, ומאפשרת לחוקר לבצע מניפולציות ספציפיות על המזון בכל תא. יישום אחד היה לנתח את הפרופיל של צריכת מזון על פני תקופה של 24 שעות. הנתונים מצביעים על כך שעכברי WT שניזונו מצ’או אד ליבטום רגילים אוכלים כ-75% מהמזון שלהם במהלך הלילה (איור 2A). יתר על כן, רוב המזון שנאכל במהלך היום מתרחש בתוך 3 שעות לפני כיבוי האור. עכברים שניזונו מ-HFD ad libitum אכלו יותר מזון ביומיים הראשונים של החשיפה, ככל הנראה בגלל החידוש של HFD (איור 2A). לאחר יומיים, צריכת HFD נשארה קצבית, אך עם משרעת מופחתת בהשוואה להזנת צ’או אד ליביטום. בעוד שגם עכברי WT זכרים וגם נקבות הוזנו HFD, נמצא כי נקבות עכברים אגרו כמות גדולה של מזון על מכסה מנגנון ההאכלה ובתוך הכלוב, בעוד שהזכרים לא הראו אגירה מורגשת. כפי שהוזכר לעיל, אגירת מזון עלולה לגרום לחישוב שגוי של צריכת המזון ולהוביל לפרשנות שגויה של הנתונים. בנוסף, נקבות עכברים נוגסות בשולי הפלסטיק של כוסות המזון בתדירות גבוהה יותר, במיוחד בתאי הלילה. עכברים זכרים הראו עלייה משמעותית במשקל לאחר שבוע אחד של צ’או רגיל ואחרי שבוע אחד של HFD (איור 2E). מגמה דומה נצפתה אצל נקבות עכברים אך לא הגיעו לערכי p משמעותיים, ככל הנראה בין היתר בגלל מספר נמוך יותר של נקבות בשימוש בהשוואה לזכרים. עכברים שעברו לדיאטת NR אוכלים את סך הקלוריות היומי שלהם רק בלילה, ללא ירידה משמעותית בצריכת הקלוריות במשך 3-5 השבועות הראשונים (איור 3A). חשיפה ארוכה יותר ללוח הזמנים של NR מפחיתה את צריכת הקלוריות היומית הממוצעת ב-10%-15% בהשוואה לעכברים שניזונו מ-ad libitum, כמתואר במקום אחר34. עכברים שעברו לדיאטת מציאות רבודה צרכו את סך הקלוריות היומי שלהם בכמויות שוות במהלך היום, מה שהוביל לירידה דרמטית בקצב צריכת המזון היומית (איור 3B). באשר ללוח הזמנים של הזנת NR, הממוצע היומי של צריכת הקלוריות אינו מושפע מלוח הזמנים של הזנת AR במשך 3-5 השבועות הראשונים של החשיפה, אלא יורד עם חשיפה ארוכה יותר. עכברים הראו עלייה במשקל אחרי לוחות הזמנים של NR (איור 3C) ומציאות רבודה (איור 3C). איור 1: תכנון ובנייה של מערכת מנגנון ההזנה . (A) מידות בסיס ה-PVC למערכת ההזנה, ותיאור המקומות שבהם יש לעשות חורים לתיקון הטיימר. (B) טיימר של 24 שעות לפני ואחרי הסבת החוט וקידוח בברגים להנחת המזון. (C) הבסיס והטיימר האפורים שהורכבו יחד עם צינור PVC בגודל 4 אינץ’. (D) המזון בעלת שמונה התאים לאחר חיתוך הקצוות החיצוניים. (ה) התקנה סופית של כלובים כאשר המזון מכוסה במכסה של 4 אינץ’ כך שיהיה נגיש רק לתא אחד בכל פעם. (F) הובלה של כוסות מזון מרובות במהלך ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: פרופילי האכלה תחת משטרי תזונה שונים . (A) פרופיל ההאכלה של עכברי WT זכרים שניזונו עם צ’או רגיל (NC) במשך 7 ימים ודיאטה עתירת שומן (HFD) במשך 7 ימים נוספים. קווים צבעוניים מייצגים פרופילי עכבר בודדים (n = 7) והקו השחור מציין ± SEM ממוצע של שבעה עכברים. (B) דיאטה עתירת שומן לפני ואחרי החיתוך. (C) הממוצע היומי של צריכת מזון כל 3 שעות ± SEM (n = 7). הממוצע חושב במהלך 5 הימים האחרונים של NC או HFD האכלה לוח זמנים. (D) הממוצע (משמאל) והאחוז (מימין) של צריכת המזון במהלך היום והלילה עבור עכברים שניזונו עם NC או HFD. הערכים מייצגים את הממוצע של שבעה עכברים ± SEM וחושבו באמצעות נתוני צריכת המזון במהלך 5 הימים האחרונים של לוחות הזמנים של האכלת NC או HFD. * p < 0.05 בין שתי הקבוצות ( מבחן T זוגי). (E) משקל הגוף הממוצע של עכברים ששימשו בניסוי לאחר שבוע אחד של NC ושבוע אחד של HFD. הנתונים עבור זכרים (משמאל) ונקבות (מימין) מוצגים עם * p < 0.05 בין שתי הקבוצות ( מבחן t זוגי). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: מניפולציה של הקצב היומי של צריכת מזון. (A) פרופיל ההאכלה של עכברי WT זכרים שהואכלו בצ’או אד ליבטום רגיל במשך יומיים, עברו למשטר האכלה מוגבל בלילה (NR) במשך 3 ימים, ונשמר תחת האכלת NR במשך 8 לילות. הקווים הצבעוניים מייצגים פרופילי עכבר בודדים (n = 18) והקו השחור מציין ± SEM ממוצע של 18 עכברים. הכוכבית האפורה מצביעה על תקלה בטיימר עבור אותו עכבר באותו יום בודד שבו הטיימר הפסיק להסתובב. (B) פרופיל האכלה של עכברי WT זכרים שניזונו מצ’או אד ליבטום רגיל במשך יומיים, עברו למשטר האכלה של הפרעות קצב (AR) במשך יום אחד, ונשמרו תחת האכלת AR במשך 8 לילות. הקווים הצבעוניים מייצגים פרופילי עכבר בודדים (n = 18) והקו השחור מציין את ממוצע ± SEM של 18 העכברים. (C) משקל הגוף הממוצע של עכברים ששימשו בניסוי לאחר שבועיים של חשיפה לדיאטות NR ו-AR. הנתונים מוצגים עם * p < 0.05 בין שתי הקבוצות (מבחן t זוגי). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. טבלה 1: יתרונות וחסרונות של מערכות ההזנה הקיימות. טבלה המדגישה מערכות הזנה שונות המשמשות למניפולציה של צריכת מזון, עם תיאור קצר של היתרונות והחסרונות של כל מערכת. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 2: עלות החומרים הדרושים לבניית מערכת ההזנה. טבלה המפרטת את עלות הפריטים הדרושים לבניית מערכת ההזנה המתוארת במאמר זה יחד עם אומדן עלות הבנייה לכלוב. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

מחקר מקיף בוצע בעשורים האחרונים על מניפולציה של מקצבי האכלה והשפעתם על הפיזיולוגיה. הבנייה והניצול של מערכת ההזנה המתוארת כאן יכולים לשמש כשיטה יעילה למניפולציה של צריכת מזון. הפרוטוקול משתמש בטיימר משותף של 24 שעות ובכוס מזון שתוכננה כמארגן שמונה תאים כרכיבי מפתח של המערכת. ניתן לבנות את הכלובים בקלות באמצעות מספר כלים נגישים בלבד, והטיפול במערכת ידידותי למשתמש. חלק מההיבטים המרכזיים של הפרוטוקול להתאמת המערכת למניפולציה של צריכת מזון קצבית כוללים החלפה יומית של כוסות מזון מכיוון שהטיימר מסתובב על פני תקופה של 24 שעות, ספירה ידנית או שקילה של המזון שנותר, והתאמה יומית של מספר הכדוריות להאכלת AR. בדרך כלל, שבבי פלסטיק נראים כאשר עכברים רעבים ואינם מקבלים מזון מספיק. ניתן לתקן בעיה זו על ידי הוספת עוד כמה כדורי מזון השומרים על משטר ההאכלה עד שלא יראו שבבי פלסטיק. במקרה של הזנת מציאות רבודה, שבה המזון היומי צריך להיות מותאם, יש להיזהר לא לגרום לקצב צריכת המזון (איור 3B). לכן, עדיף להוסיף או להחסיר כדורים בתאים מנוגדים לכל אורכם כדי לשמור על עכברים מוזנים בקצב קצב.

ניתן לשפר מערכת זו עוד יותר על ידי ציפוי כוסות המזון בשכבת אפוקסי כדי למנוע מהעכברים לנגוס בפלסטיק, ובכך לסייע בהארכת חיי כוסות המזון. ניתן גם לשנות את פני השטח של הטיימר למיקום כוסות מזון כדי לעזור לכוס המזון לשבת שטוחה ויציבה על הטיימר. זה יכול למנוע עצירה בשוגג של הטיימר הנגרמת על ידי טיימר ממוקם באופן לא אחיד. חלק מרכיבי הכלוב, כגון כוסות מזון, ניתנים גם להדפסה תלת ממדית כדי להוזיל עלויות ומותאמים אישית לטעמו של החוקר. זה יכול לכלול כוסות מזון עם יותר משמונה תאים, מה שיכול לתת רזולוציית זמן טובה יותר מאשר חלון 3 השעות הנוכחי.

למרות יעילותה הרבה, למערכת זו יש כמה מגבלות, כגון עבודה אינטנסיבית, כאשר החוקר עדיין צריך להחליף כוסות מזון כל 24 שעות ודורש מהם לספור / לשקול באופן ידני את המזון שנותר. בנוסף, יש לעקוב אחר הטיימרים מעת לעת כדי לזהות בעיות פוטנציאליות ו / או אם הם הפסיקו לעבוד. ניתן להשיג זאת תוך ספירת כדורי המזון שנותרו לאחר ההאכלה (למשל, על ידי קביעה אם חלק מהעכברים אכלו מזון רק בכמה תאים והשאירו חלק מהתאים ללא פגע). מגבלה נוספת של מערכת זו היא שהיא עשויה שלא לעבוד טוב עם נקבות עכברים, שכן הניסויים המעטים שבוצעו עם נקבות הראו שהן נוטות לאגור מזון וללעוס את הפלסטיק יותר מאשר עכברים זכרים.

עם זאת, מערכת הזנה זו יעילה מאוד במניפולציה של צריכת מזון, קלה לבנייה, תפעול, תחזוקה והיא זולה בהשוואה למזינים האוטומטיים היקרים הקיימים בשוק. ניתן להתאים ולשנות אותה בקלות כך שתתאים לדרישות החוקר ואינה זקוקה להכשרה מיוחדת להפעלת המערכת. חשוב לציין, טיימרים מפיקים רק כמות נמוכה של רעש לבן קבוע, מה שמונע מעכברים לקשר כל צליל לזמינות מזון.

לסיכום, מאמר זה מתאר מערכת הזנה חדשנית שניתן להשתמש בה כדי לפקח על צריכת מזון יומית בעכברים וניתן להתאים אותה להאכלת עכברים בפרדיגמות שונות כגון הזנה מוגבלת בזמן, הזנה בקצב קצב והזנה בתזונה עתירת שומן. מערכת זו מתווספת לרשימת הכלים שניתן להשתמש בהם כדי לענות על שאלות חשובות בתחום צריכת המזון הקצוב והשפעתו על הפיזיולוגיה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה כספית על ידי המענק R01DK128133 מ- NIH/NIDDK (ל- J.S.M) וקרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת טקסס A&M.

Materials

#6 x 0.75 inch Phillips Pan Head Stainless Steel Sheet Metal Screw (50-Pack) Everbilt #800172
#8 x 1.5 inch Phillips Pan Head Zinc Plated Sheet Metal Screw (100-Pack) Everbilt  #801622
0.25 inch gray PVC sheet (24 inch x 48 inch) USPlastic #45088
4 inch PVC pipe (10 ft) Home Depot #531103
45 mg dustless precision pellets Bio-Serv #F0165
6 ft. Extension Cord HDX HD#145-017
Food container (eight-compartment jewelry organizer)  JewelrySupply #PB8301
Indoor Basic Timer General Electric #15119
Oatey 4 inch ABS Pipe Test Cap with Knockout Home Depot #39103D
Rodent Diet with 45 kcal% fat (with red dye) Research Diets #D12451
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of light and temperature in the regulation of circadian gene expression in Drosophila. PLoS Genetics. 3 (4), 0492-0507 (2007).
  2. Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).
  3. Buhr, E. D., Yoo, S. H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330 (6002), 379-385 (2010).
  4. Kawamoto, T., et al. Effects of fasting and re-feeding on the expression of Dec, Per1, and other clock-related genes. Journal of Biochemistry. 140 (3), 401-408 (2006).
  5. Lamia, K. A., Storch, K. F., Weitz, C. J. Physiological significance of a peripheral tissue circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (39), 15172-15177 (2008).
  6. Oosterman, J. E., Kalsbeek, A., La Fleur, S. E., Belsham, D. D. Impact of nutrients on circadian rhythmicity. American Journal of Physiology – Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 308 (5), 337-350 (2015).
  7. Pitts, S. N., Perone, E., Silver, R. Food-entrained circadian rhythms are sustained in arrhythmic Clk/Clk mutant mice. American Journal of Physiology – Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 285, 57-67 (2003).
  8. Sheward, W. J., et al. Entrainment to feeding but not to light: Circadian phenotype of VPAC 2 receptor-null mice. Journal of Neuroscience. 27 (16), 4351-4358 (2007).
  9. Gekakis, N., et al. Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism. Science. 280 (5369), 1564-1569 (1998).
  10. King, D. P., et al. Positional cloning of the mouse circadian Clock gene. Cell. 89 (4), 641-653 (1997).
  11. Kume, K., et al. mCRY1 and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop. Cell. 98 (2), 193-205 (1999).
  12. Shearman, L. P., et al. Interacting molecular loops in the mammalian circadian clock. Science. 288 (5468), 1013-1019 (2000).
  13. Beytebiere, J. R., et al. Tissue-specific BMAL1 cistromes reveal that rhythmic transcription is associated with rhythmic enhancer-enhancer interactions. Genes and Development. 33 (5-6), 294-309 (2019).
  14. Menet, J. S., Pescatore, S., Rosbash, M. CLOCK: BMAL1 is a pioneer- like transcription factor. Genes and Development. 28 (1), 8-13 (2014).
  15. Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
  16. Mure, L. S., et al. Diurnal transcriptome atlas of a primate across major neural and peripheral tissues. Science. 359 (6381), (2018).
  17. Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Translational Medicine. 10 (458), 1-8 (2018).
  18. Zhang, R., Lahens, N. F., Ballance, H. I., Hughes, M. E., Hogenesch, J. B. A circadian gene expression atlas in mammals: Implications for biology and medicine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16219-16224 (2014).
  19. Menet, J. S., Rodriguez, J., Abruzzi, K. C., Rosbash, M. Nascent-Seq reveals novel features of mouse circadian transcriptional regulation. eLife. 2012 (1), 1-25 (2012).
  20. Miller, B. H., et al. Circadian and CLOCK-controlled regulation of the mouse transcriptome and cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3342-3347 (2007).
  21. Cailotto, C., et al. The suprachiasmatic nucleus controls the daily variation of plasma glucose via the autonomic output to the liver: Are the clock genes involved. European Journal of Neuroscience. 22 (10), 2531-2540 (2005).
  22. Eckel-Mahan, K. L., et al. Coordination of the transcriptome and metabolome by the circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5541-5546 (2012).
  23. Damiola, F., et al. Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes and Development. 14 (23), 2950-2961 (2000).
  24. Saini, C., et al. Real-time recording of circadian liver gene expression in freely moving mice reveals the phase-setting behavior of hepatocyte clocks. Genes and Development. 27 (13), 1526-1536 (2013).
  25. Stokkan, K. A., Yamazaki, S., Tei, H., Sakaki, Y., Menaker, M. Entrainment of the circadian clock in the liver by feeding. Science. 291 (5503), 490-493 (2001).
  26. Atger, F., et al. Circadian and feeding rhythms differentially affect rhythmic mRNA transcription and translation in mouse liver. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 6579-6588 (2015).
  27. Greenwell, B. J., et al. Rhythmic food intake drives rhythmic gene expression more potently than the hepatic circadian clock in mice. Cell Reports. 27 (3), 649-657 (2019).
  28. Izumo, M., et al. Differential effects of light and feeding on circadian organization of peripheral clocks in a forebrain Bmal1 mutant. eLife. 3, 04617 (2014).
  29. Mange, F., et al. Diurnal regulation of RNA polymerase III transcription is under the control of both the feeding-fasting response and the circadian clock. Genome Research. 27 (6), 973-984 (2017).
  30. Van Der Veen, D. R., et al. Impact of behavior on central and peripheral circadian clocks in the common vole Microtus arvalis, a mammal with ultradian rhythms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (9), 3393-3398 (2006).
  31. Vollmers, C., et al. Time of feeding and the intrinsic circadian clock drive rhythms in hepatic gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21453-21458 (2009).
  32. Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted feeding prevents obesity and metabolic syndrome in mice lacking a circadian clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
  33. Hatori, M., et al. Time-restricted feeding without reducing caloric intake prevents metabolic diseases in mice fed a high-fat diet. Cell Metabolism. 15 (6), 848-860 (2012).
  34. Acosta-Rodríguez, V. A., de Groot, M. H. M., Rijo-Ferreira, F., Green, C. B., Takahashi, J. S. Mice under caloric restriction self-impose a temporal restriction of food intake as revealed by an automated feeder system. Cell Metabolism. 26 (1), 267-277 (2017).
  35. Chung, H., et al. Time-restricted feeding improves insulin resistance and hepatic steatosis in a mouse model of postmenopausal obesity. Metabolism: Clinical and Experimental. 65 (12), 1743-1754 (2016).
  36. Sen, S., et al. Ultradian feeding in mice not only affects the peripheral clock in the liver, but also the master clock in the brain. Chronobiology International. 34 (1), 17-36 (2017).
  37. Xie, X., et al. Natural food intake patterns do not synchronize peripheral clocks. BMC Biology. 18 (160), 1-11 (2020).
  38. Swamy, S., et al. Circadian disruption of food availability significantly reduces reproductive success in mice. Hormones and Behavior. 105, 177-184 (2018).
  39. Xin, H., et al. Protocol for setup and circadian analysis of inverted feeding in mice. STAR Protocols. 2 (3), 100701 (2021).

Tags

Rhythmic Food IntakeFeeding SystemMicePVCTimerFood DispenserHigh-fat DietTime-restricted FeedingAd Libitum FeedingArrhythmic Feeding ScheduleMetabolic Diseases

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sahasrabudhe, A., Guy, C. R., Greenwell, B. J., Menet, J. S. Manipulation of Rhythmic Food Intake in Mice Using a Custom-Made Feeding System. J. Vis. Exp. (190), e64624, doi:10.3791/64624 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image