التلاعب في تناول الطعام الإيقاعي في الفئران باستخدام نظام تغذية مخصص
Summary
برز تقييد توقيت تناول الطعام كتدخل واعد لتخفيف الأمراض الأيضية التي يسببها النظام الغذائي. توضح هذه المخطوطة بالتفصيل بناء واستخدام نظام فعال تم بناؤه داخليا لقياس ومعالجة تناول الطعام الإيقاعي في الفئران.
Abstract
التعبير الجيني الإيقاعي هو السمة المميزة لإيقاع الساعة البيولوجية وهو ضروري لقيادة إيقاع الوظائف البيولوجية في الوقت المناسب من اليوم. أظهرت الدراسات التي أجريت على مدى العقود القليلة الماضية أن تناول الطعام الإيقاعي (أي الوقت الذي تأكل فيه الكائنات الحية الطعام خلال يوم 24 ساعة) ، يساهم بشكل كبير في التنظيم الإيقاعي للتعبير الجيني في مختلف الأعضاء والأنسجة في جميع أنحاء الجسم. تمت دراسة آثار تناول الطعام الإيقاعي على الصحة وعلم وظائف الأعضاء على نطاق واسع منذ ذلك الحين وكشفت أن تقييد تناول الطعام لمدة 8 ساعات خلال المرحلة النشطة يخفف من الأمراض الأيضية الناشئة عن مجموعة متنوعة من الأنظمة الغذائية المسببة للسمنة. غالبا ما تتطلب هذه الدراسات استخدام طرق خاضعة للرقابة لتوقيت تسليم الطعام للحيوانات. تصف هذه المخطوطة تصميم واستخدام نظام منخفض التكلفة وفعال ، تم بناؤه داخليا لقياس الاستهلاك اليومي للطعام بالإضافة إلى التلاعب بتناول الطعام الإيقاعي في الفئران. يستلزم هذا النظام استخدام مواد خام ميسورة التكلفة لبناء أقفاص مناسبة لتوصيل الطعام ، باتباع إجراء مناولة سهل الاستخدام. يمكن استخدام هذا النظام بكفاءة لإطعام الفئران على أنظمة تغذية مختلفة مثل الجداول الزمنية أو جداول عدم انتظام ضربات القلب ، ويمكن أن يتضمن نظاما غذائيا عالي الدهون لدراسة تأثيره على السلوك وعلم وظائف الأعضاء والسمنة. يتم تقديم وصف لكيفية تكيف الفئران من النوع البري (WT) مع أنظمة التغذية المختلفة.
Introduction
تم العثور على الساعة البيولوجية في كل مكان عبر الأنواع وتوفر آلية لحفظ الوقت تساعد الكائنات الحية على التكيف مع بيئتها المتغيرة إيقاعيا. يقع جهاز تنظيم ضربات القلب اليومي الرئيسي في النواة فوق التصالبية (SCN) في منطقة ما تحت المهاد. يتم تقييد SCN بشكل أساسي من خلال دورة الضوء والظلام البيئية ، ومزامنة الساعات الطرفية الموجودة في كل خلية من خلايا الجسم تقريبا عبر إشارات متعددة ، بما في ذلك الإشارات العصبية والهرمونية ، والتغذية ، ودرجة حرارة الجسم1،2،3،4،5،6،7،8 . في الثدييات ، تعتمد الساعة البيولوجية الجزيئية على عامل النسخ غير المتجانس CLOCK: BMAL1 9,10 ، والذي يتحكم في التعبير عن جينات الساعة الأساسية المسماة Period (Per1 و Per2 و Per3) و Cryptochrome (Cry1 و Cry2) لبدء حلقة تغذية مرتدة نسخية ضرورية لتوليد إيقاعات الساعة البيولوجية9،11،12 . تنظم الساعة الجزيئية أيضا النسخ الإيقاعي لآلاف الجينات التي تتحكم في إيقاع كل وظيفة بيولوجية تقريبا13،14،15. يتم التعبير عن أكثر من 50٪ من الجينوم في الثدييات بشكل إيقاعي في نوع نسيج واحد على الأقل16،17،18 ، والأنسجة مثل الكبد في الفئران لديها حوالي 25٪ -30٪ من نسختها المعبر عنها بشكل إيقاعي18،19. يعد التعبير الجيني الإيقاعي أمرا بالغ الأهمية لتنشيط العمليات البيولوجية المهمة مثل التحكم في دورة الخلية20 ، وتوازن الجلوكوز 21 ، واستقلاب الأحماض الأمينية22 في الوقت المناسب من اليوم من أجل زيادة لياقة الكائن الحي.
على مدى العقود القليلة الماضية ، كانت هناك أدلة متزايدة تشير إلى أن تناول الطعام يمكن أن يكون بمثابة إشارة متزامنة قوية لتقييد الإيقاعات في التعبير الجيني في أنسجة متعددة ، بما في ذلك الكبد23,24. الأهم من ذلك ، فقد ثبت أن التغذية تقيد الإيقاعات في الكبد بشكل مستقل عن SCN أو عن دورة الضوءوالظلام 25 ، ويمكن للتغذية الإيقاعية أن تدفع التعبير الجيني الإيقاعي دون إشراك الساعة الجزيئية 26،27،28،29،30،31. التغذية المقيدة بالفترة غير النشطة للفئران (النهار) تعكس مرحلة التعبير عن جينات الساعة الأساسية والعديد من الجينات الإيقاعية31. ثبت أن التغذية المقيدة بالوقت (TRF) ، وهي تدخل غذائي حيث يقتصر تناول السعرات الحرارية اليومية على فترة 8-10 ساعات ، تحمي من السمنة وفرط الأنسولين في الدم والتنكس الدهني الكبدي ومتلازمة التمثيل الغذائي32,33. تتطلب جميع التجارب المذكورة أعلاه التي تنطوي على التلاعب بتناول الطعام من المجرب الاستفادة من الأساليب الفعالة لتوصيل الطعام في الوقت المناسب من اليوم.
تم تطوير طرق مختلفة لتوصيل الطعام ، تحمل العديد من المزايا والعيوب29،34،35،36،37،38،39 (الجدول 1). تم تصميم بعض المغذيات الآلية للعمل بناء على برنامج يتحكم في كمية ومدة وتوقيت توافر الطعام أثناء تسجيل نشاط التغذية والجري الطوعي في الفئران34. تتضمن بعض الطرق الأخرى وضع الفئران في أقفاص مختلفة لظروف تغذية مختلفة, مع إضافة المجرب يدويا كريات الطعام في الوقت المحدد38,39. يستخدم نظام آخر نظام تغذية آلي يتم التحكم فيه بواسطة جهاز كمبيوتر حيث يمنع الدرع الهوائي الوصول إلى الطعام والذي يمكن التحكم فيه إما عن طريق فترات زمنية أو كتلة الطعام35. كل هذه الطرق إما تتطلب استخدام وإعداد برنامج محوسب يمكن أن يكون مكلفا ويتطلب بعض التدريب للتشغيل السليم للأداة أو كثيفة العمالة لأن المجرب يحتاج إلى أن يكون حاضرا في أوقات محددة لتغيير ظروف التغذية يدويا. تأتي الأنظمة المحوسبة أيضا مع نصيبها من المشكلات ، بما في ذلك خلل في الرافعات أو الأبواب التي تسمح للطعام بالخروج ، وتعلق كريات الطعام في المنافذ ، وتعطل البرامج. علاوة على ذلك ، فإن الصوت الذي قد ينتج أثناء فتح الأبواب أو الرافعات يمثل خطر تكييف الفئران لربطها بتوصيل الطعام ، مما يضر بتفسير آثار التلاعب بالطعام على أنها ناتجة تماما عن الوصول إلى الطعام أو بسبب التأثيرات على الإيقاعات السلوكية الأخرى مثل دورة النوم / الاستيقاظ. كان الهدف العام من هذه الدراسة هو تطوير نظام ميسور التكلفة وفعال للتعامل مع تناول الطعام الإيقاعي على المدى الطويل والذي من شأنه أن يساعد في التخفيف من العديد من هذه المشكلات المذكورة أعلاه. أولا وقبل كل شيء ، يمكن بناء جهاز التغذية الذي تم تطويره ووصفه أدناه بتكلفة قليلة جدا مقارنة بالآلات الآلية (الجدول 2) ولا يتطلب تدريبا متطورا للمناولة والتشغيل والصيانة. ثانيا ، ينتج نظام التغذية ضوضاء بيضاء في الخلفية فقط ولا توجد أصوات عالية أثناء توصيل الطعام ، وبالتالي يمنع تكييف بافلوفيان. إجمالا ، يعد نظام التغذية هذا اقتصاديا ، ويمكن الوصول إليه بسهولة وموثوقية للباحثين بينما لا يزال فعالا في التلاعب بتناول الطعام الإيقاعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم إجراء بحث مكثف على مدى العقود القليلة الماضية حول التلاعب بإيقاعات التغذية وتأثيرها على علم وظائف الأعضاء. يمكن استخدام بناء واستخدام نظام التغذية الموصوف هنا كطريقة فعالة لمعالجة تناول الطعام. يستخدم البروتوكول مؤقتا مشتركا لمدة 24 ساعة وكوب طعام مصمما كمنظم من ثماني حجرات كمكونات رئيسية للنظام. يمكن بناء الأقفاص بسهولة باستخدام عدد قليل من الأدوات التي يسهل الوصول إليها ، كما أن التعامل مع النظام سهل الاستخدام. تتضمن بعض الجوانب الرئيسية للبروتوكول الخاص بتكييف النظام للتلاعب باستهلاك الطعام الإيقاعي التغيير اليومي لأكواب الطعام نظرا لأن المؤقت يدور عبر فترة 24 ساعة ، والعد اليدوي أو وزن الطعام المتبقي ، والتعديل اليومي لعدد الكريات لتغذية AR. عادة ، تظهر نشارة البلاستيك عندما تكون الفئران جائعة ولا تحصل على طعام كاف. يمكن إصلاح هذه المشكلة عن طريق إضافة عدد قليل من كريات الطعام التي تلتزم بنظام التغذية حتى لا يتم رؤية نشارة بلاستيكية. في حالة التغذية بالواقع المعزز ، حيث يحتاج الطعام اليومي إلى التعديل ، يجب الحرص على عدم تحفيز إيقاع تناول الطعام (الشكل 3 ب). وبالتالي ، فمن الأفضل إما إضافة أو طرح الكريات في مقصورات متقابلة طوال الوقت للحفاظ على تغذية الفئران بشكل غير منتظم.
يمكن تحسين هذا النظام بشكل أكبر عن طريق طلاء أكواب الطعام بطبقة من الإيبوكسي لمنع الفئران من عض البلاستيك ، وبالتالي المساعدة في إطالة عمر أكواب الطعام. يمكن أيضا تعديل سطح المؤقت لوضع كوب الطعام لمساعدة كوب الطعام على الجلوس بشكل مسطح ومستقر على المؤقت. هذا يمكن أن يمنع التوقف العرضي للمؤقت الناجم عن مؤقت غير متساو. يمكن أيضا طباعة عدد قليل من مكونات القفص ، مثل أكواب الطعام ، بتقنية 3D لتقليل التكلفة وحسب الطلب حسب رغبة الباحث. يمكن أن يشمل ذلك أكواب الطعام التي تحتوي على أكثر من ثماني مقصورات ، والتي يمكن أن توفر دقة زمنية أفضل من نافذة 3 ساعات الحالية.
على الرغم من كفاءته العالية ، إلا أن هذا النظام له بعض القيود ، مثل كونه كثيف العمالة ، حيث لا يزال الباحث بحاجة إلى تغيير أكواب الطعام كل 24 ساعة ويطلب منهم عد / وزن الطعام المتبقي يدويا. بالإضافة إلى ذلك ، يجب مراقبة المؤقتات من وقت لآخر لتحديد المشكلات المحتملة و / أو إذا توقفت عن العمل. يمكن تحقيق ذلك أثناء حساب كريات الطعام المتبقية بعد التغذية (على سبيل المثال ، من خلال تحديد ما إذا كانت بعض الفئران قد أكلت الطعام فقط في بضع حجرات وتركت بعض المقصورات دون مساس). هناك قيد آخر لهذا النظام وهو أنه قد لا يعمل بشكل جيد مع إناث الفئران ، حيث أظهرت التجارب القليلة التي أجريت على الإناث أنها تميل إلى تخزين الطعام ومضغ البلاستيك أكثر من ذكور الفئران.
ومع ذلك ، فإن نظام التغذية هذا فعال للغاية في التعامل مع تناول الطعام ، وهو سهل البناء والتشغيل والصيانة وغير مكلف مقارنة بالمغذيات الآلية باهظة الثمن الموجودة في السوق. يمكن تكييفه وتعديله بسهولة ليناسب متطلبات الباحث ولا يحتاج إلى أي تدريب خاص لتشغيل النظام. الأهم من ذلك ، أن أجهزة ضبط الوقت تنتج فقط كمية منخفضة من الضوضاء البيضاء الثابتة ، مما يمنع الفئران من ربط أي صوت بتوافر الطعام.
باختصار ، تصف هذه الورقة نظام تغذية مبتكر يمكن استخدامه لمراقبة استهلاك الطعام اليومي في الفئران ويمكن تكييفه لإطعام الفئران على نماذج مختلفة مثل التغذية المقيدة بالوقت ، والتغذية غير المنتظمة ، والتغذية على نظام غذائي غني بالدهون. يضيف هذا النظام إلى قائمة الأدوات التي يمكن استخدامها لمعالجة الأسئلة المهمة في مجال تناول الطعام الإيقاعي وتأثيره على علم وظائف الأعضاء.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل ماليا من خلال المنحة R01DK128133 من NIH / NIDDK (إلى JSM) وصناديق بدء التشغيل من جامعة تكساس إيه آند إم.
Materials
| #6 x 0.75 inch Phillips Pan Head Stainless Steel Sheet Metal Screw (50-Pack) | Everbilt | #800172 | |
| #8 x 1.5 inch Phillips Pan Head Zinc Plated Sheet Metal Screw (100-Pack) | Everbilt | #801622 | |
| 0.25 inch gray PVC sheet (24 inch x 48 inch) | USPlastic | #45088 | |
| 4 inch PVC pipe (10 ft) | Home Depot | #531103 | |
| 45 mg dustless precision pellets | Bio-Serv | #F0165 | |
| 6 ft. Extension Cord | HDX | HD#145-017 | |
| Food container (eight-compartment jewelry organizer) | JewelrySupply | #PB8301 | |
| Indoor Basic Timer | General Electric | #15119 | |
| Oatey 4 inch ABS Pipe Test Cap with Knockout | Home Depot | #39103D | |
| Rodent Diet with 45 kcal% fat (with red dye) | Research Diets | #D12451 |
References
- Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of light and temperature in the regulation of circadian gene expression in Drosophila. PLoS Genetics. 3 (4), 0492-0507 (2007).
- Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks. Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).
- Buhr, E. D., Yoo, S. H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330 (6002), 379-385 (2010).
- Kawamoto, T., et al. Effects of fasting and re-feeding on the expression of Dec, Per1, and other clock-related genes. Journal of Biochemistry. 140 (3), 401-408 (2006).
- Lamia, K. A., Storch, K. F., Weitz, C. J. Physiological significance of a peripheral tissue circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (39), 15172-15177 (2008).
- Oosterman, J. E., Kalsbeek, A., La Fleur, S. E., Belsham, D. D. Impact of nutrients on circadian rhythmicity. American Journal of Physiology – Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 308 (5), 337-350 (2015).
- Pitts, S. N., Perone, E., Silver, R. Food-entrained circadian rhythms are sustained in arrhythmic Clk/Clk mutant mice. American Journal of Physiology – Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 285, 57-67 (2003).
- Sheward, W. J., et al. Entrainment to feeding but not to light: Circadian phenotype of VPAC 2 receptor-null mice. Journal of Neuroscience. 27 (16), 4351-4358 (2007).
- Gekakis, N., et al. Role of the CLOCK protein in the mammalian circadian mechanism. Science. 280 (5369), 1564-1569 (1998).
- King, D. P., et al. Positional cloning of the mouse circadian Clock gene. Cell. 89 (4), 641-653 (1997).
- Kume, K., et al. mCRY1 and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop. Cell. 98 (2), 193-205 (1999).
- Shearman, L. P., et al. Interacting molecular loops in the mammalian circadian clock. Science. 288 (5468), 1013-1019 (2000).
- Beytebiere, J. R., et al. Tissue-specific BMAL1 cistromes reveal that rhythmic transcription is associated with rhythmic enhancer-enhancer interactions. Genes and Development. 33 (5-6), 294-309 (2019).
- Menet, J. S., Pescatore, S., Rosbash, M. CLOCK: BMAL1 is a pioneer- like transcription factor. Genes and Development. 28 (1), 8-13 (2014).
- Koike, N., et al. Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals. Science. 338 (6105), 349-354 (2012).
- Mure, L. S., et al. Diurnal transcriptome atlas of a primate across major neural and peripheral tissues. Science. 359 (6381), (2018).
- Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Translational Medicine. 10 (458), 1-8 (2018).
- Zhang, R., Lahens, N. F., Ballance, H. I., Hughes, M. E., Hogenesch, J. B. A circadian gene expression atlas in mammals: Implications for biology and medicine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16219-16224 (2014).
- Menet, J. S., Rodriguez, J., Abruzzi, K. C., Rosbash, M. Nascent-Seq reveals novel features of mouse circadian transcriptional regulation. eLife. 2012 (1), 1-25 (2012).
- Miller, B. H., et al. Circadian and CLOCK-controlled regulation of the mouse transcriptome and cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3342-3347 (2007).
- Cailotto, C., et al. The suprachiasmatic nucleus controls the daily variation of plasma glucose via the autonomic output to the liver: Are the clock genes involved. European Journal of Neuroscience. 22 (10), 2531-2540 (2005).
- Eckel-Mahan, K. L., et al. Coordination of the transcriptome and metabolome by the circadian clock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5541-5546 (2012).
- Damiola, F., et al. Restricted feeding uncouples circadian oscillators in peripheral tissues from the central pacemaker in the suprachiasmatic nucleus. Genes and Development. 14 (23), 2950-2961 (2000).
- Saini, C., et al. Real-time recording of circadian liver gene expression in freely moving mice reveals the phase-setting behavior of hepatocyte clocks. Genes and Development. 27 (13), 1526-1536 (2013).
- Stokkan, K. A., Yamazaki, S., Tei, H., Sakaki, Y., Menaker, M. Entrainment of the circadian clock in the liver by feeding. Science. 291 (5503), 490-493 (2001).
- Atger, F., et al. Circadian and feeding rhythms differentially affect rhythmic mRNA transcription and translation in mouse liver. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 6579-6588 (2015).
- Greenwell, B. J., et al. Rhythmic food intake drives rhythmic gene expression more potently than the hepatic circadian clock in mice. Cell Reports. 27 (3), 649-657 (2019).
- Izumo, M., et al. Differential effects of light and feeding on circadian organization of peripheral clocks in a forebrain Bmal1 mutant. eLife. 3, 04617 (2014).
- Mange, F., et al. Diurnal regulation of RNA polymerase III transcription is under the control of both the feeding-fasting response and the circadian clock. Genome Research. 27 (6), 973-984 (2017).
- Van Der Veen, D. R., et al. Impact of behavior on central and peripheral circadian clocks in the common vole Microtus arvalis, a mammal with ultradian rhythms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (9), 3393-3398 (2006).
- Vollmers, C., et al. Time of feeding and the intrinsic circadian clock drive rhythms in hepatic gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21453-21458 (2009).
- Chaix, A., Lin, T., Le, H. D., Chang, M. W., Panda, S. Time-Restricted feeding prevents obesity and metabolic syndrome in mice lacking a circadian clock. Cell Metabolism. 29 (2), 303-319 (2019).
- Hatori, M., et al. Time-restricted feeding without reducing caloric intake prevents metabolic diseases in mice fed a high-fat diet. Cell Metabolism. 15 (6), 848-860 (2012).
- Acosta-Rodríguez, V. A., de Groot, M. H. M., Rijo-Ferreira, F., Green, C. B., Takahashi, J. S. Mice under caloric restriction self-impose a temporal restriction of food intake as revealed by an automated feeder system. Cell Metabolism. 26 (1), 267-277 (2017).
- Chung, H., et al. Time-restricted feeding improves insulin resistance and hepatic steatosis in a mouse model of postmenopausal obesity. Metabolism: Clinical and Experimental. 65 (12), 1743-1754 (2016).
- Sen, S., et al. Ultradian feeding in mice not only affects the peripheral clock in the liver, but also the master clock in the brain. Chronobiology International. 34 (1), 17-36 (2017).
- Xie, X., et al. Natural food intake patterns do not synchronize peripheral clocks. BMC Biology. 18 (160), 1-11 (2020).
- Swamy, S., et al. Circadian disruption of food availability significantly reduces reproductive success in mice. Hormones and Behavior. 105, 177-184 (2018).
- Xin, H., et al. Protocol for setup and circadian analysis of inverted feeding in mice. STAR Protocols. 2 (3), 100701 (2021).
