İnsan Genişletilmiş Potansiyel Kök Hücrelerden Doğal Öldürücü Hücrelerin Üretilmesi

Bu çalışmada in vitro deneyler yer almaktadır; bu nedenle, etik onay geçerli değildir. Bu çalışmada kullanılan yerleşik hücre hatları ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bkz. 1. hEPSC’lerden 3D organoid yapıların oluşturulması hEPSC’leri SNL besleyici hücreler 1 üzerinde 1 mL EPSC ortamı (12 delikli plaka) ile kültürleyerek koruyun1.NOT: Kubbe şeklindeki koloniler, genişlemiş potansiyelleri kalırsa gözlenir (Şekil 2A). hEPSC’lerin ön farklılaştırmasını gerçekleştirin.hEPSC ortamını çıkarın ve 1 mL DFK ortamı ekleyin (DMEM / F12 + % 10 serum değiştirme ortamı, Malzeme Tablosuna bakın). 37 ° C’de 2-3 gün boyunca inkübe edin ve% 5 CO2. Kuluçkaya 3 gün boyunca devam ediyorsanız, ikinci günde orta bir değişiklik yapın.NOT: Mikroskop altında, kubbe şeklindeki koloniler düzleştirilir (Şekil 2B). Embriyoid cisimlerin oluşumunu asılı damla tekniği 7,8 ile kontrol edin.DFK ortamını çıkarın ve bir kez 1 mL PBS ile yıkayın. 500 μL% 0.05 tripsin ekleyin ve plağı morfolojiye bağlı olarak 3-7 dakika boyunca 37 ° C’de ve% 5 CO2’de inkübe edin.NOT: hEPSC’ler, plaka hafifçe bozulduğunda besleyici hücrelerden ayrılabilmelidir. Tripsini çıkarın ve hücreleri toplamak için 2 mL DFK ortamı ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 300 x g’da döndürün. Süpernatantı bir pipetle çıkarın. Hücreleri hafifçe vurarak yeniden askıya almak için 1 mL DFK ortamı ve 1 μL Y27632 ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Bir hemositometre9 ile hücre süspansiyonu içindeki hücre sayısını sayın. Hücre süspansiyonunu DFK ortamı ve Y27632 (1.000x) ile seyreltin, böylece 4.000 hücre / 25 μL DFK ortamı olur. 10 cm’lik bir Petri kabının kapağını, kapak başına yaklaşık 30-40 damla 25 μL hücre süspansiyonu ile doldurun. Damlacıkların buharlaşmasını önlemek için alt kaba biraz PBS dökün. Kapağı yavaşça ters çevirin ve çanağı örtün. Çanağı 37 ° C’de ve% 5 CO2’de 3 gün boyunca inkübe edin. 2. Embriyoid cismin mezodermi ve hemato-endotel paternlenmesi (EB) EB’leri damlacık içinde toplayın.Damlacıktan tüm EB’leri 1 mL’lik pipet ve bazı PBS kullanarak 15 mL’lik bir tüpe toplayın. Damlacığa biraz PBS pompalayın ve ardından EB’ler de dahil olmak üzere ortamı pipetle aspire edin.NOT: Daha sarı olan damlacıklar, pembe damlacıklardan daha başarılı oluşum ve büyüme gösterir. Toplanan EB’leri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 100 x g’da döndürün ve süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın. Toplanan EB’leri yapışkan olmayan 24 delikli bir plakaya aktarmak için 1 mL orta A ekleyin (ticari olarak temin edilebilen bir hücre farklılaştırma kitinden, Malzeme Tablosuna bakın). Bu günü 0. Gün olarak etiketleyin (Şekil 1).NOT: Genellikle, 10 cm’lik bir tabaktan toplanan tüm EB’ler gruplandırılır ve 24 delikli bir tabağın bir kuyucuğuna aktarılır. EB’lerin mezoderm desenlemesini gerçekleştirin.Plakayı 3 gün boyunca 37 ° C’de% 5 CO2 ile inkübe edin. 2. Günde, EB’leri pipetlemekten kaçınırken 500 μL orta A’yı (kitten, adım 2.1.2) çıkarın. Ardından, 500 μL taze ortam A ekleyin. Embriyoid cismin hemato-endotel spesifikasyonunu gerçekleştirin.Kuyudan 700 μL orta A çıkarın ve 700 μL orta B ekleyin (kitten, adım 2.1.2). 7 gün boyunca kültür. 5. Gün, 7. Gün ve 9. Gün’de orta B’nin yarısını değiştirin. 3. NK hücre farklılaşması Desenli EB’leri bir hava-sıvı arayüzüne aktarın.EB’lerin altta toplanması için plakayı hafifçe eğin. EB’lerden kaçınırken orta B’nin mümkün olduğunca çoğunu çıkarmak için 1 mL’lik bir pipet kullanın. Kalan ortamı aspire ederek EB’leri bir pipetle alın. Bunları 24 delikli bir plakadaki bir transwell’e aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız).NOT: Optimum yoğunluk için sayıları transwell başına iki ila üç EB ile sınırlandırın. Lenfoid progenitör genişlemesi gerçekleştirin.Transwellin alt bölmesine 500 μL NK-1 ortamı (ticari olarak temin edilebilen lenfoid genleşme ortamı + 14 IU / mL IL-3, 4.500 IU / mL IL-15, 8.800 IU / mL IL-7, 26 IU / mL SCF ve 12 IU / mL ftl3L, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 14 gün boyunca kültür yapın ve her gün orta bir değişim gerçekleştirin. 7-10. günlerde hücreleri hasat edin ve kaplanmış bir tabağa aktarın.Plakayı kaplamak için, PBS’deki kaplama malzemesini (ticari olarak temin edilebilen lenfoid farklılaşma kaplama malzemesi, 100x, Malzeme Tablosuna bakınız) seyreltin. 12 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL seyreltilmiş kaplama çözeltisi ekleyin ve plakayı gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Plakanın açıklığını sarma filmi ile örtün. Transkuyu içine 200 μL PBS ekleyin ve organoidlerden salınan hücreleri toplamak için yaklaşık beş ila altı kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet yapın. Organoidleri pipetlemekten kaçının.NOT: Yuvarlak hücreler organoidlerden sürekli olarak salınır (Şekil 2D). Hasat edilen hücre süspansiyonunu 2 mL’lik bir tüpe aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g’de döndürün. Süpernatantı bir pipetle çıkarın ve pipetle pipetleyerek hücreleri yeniden askıya almak için 1 mL NK-1 ortamı (adım 3.2.1) ekleyin. Tüm kaplama çözeltisini kuyudan çıkarın ve 12 delikli bir plakanın her bir kuyusunu 1 mL PBS ile iki kez yıkayın. Hasat edilen hücreleri 1: 2 oranında bölün. Hücre süspansiyonunu kaplanmış 12 delikli bir plakaya aktarın (adım 3.3.1). 1 mL NK-1 ortamı ekleyin, böylece her bir kuyucuk 1,5 mL ortama sahip olur. Orta bir değişiklik yapmak için, hücrelerin dibe batmasına izin vermek için hücrelerin 1-2 dakika oturmasına izin verin. 750 μL ortamı dikkatlice aspire edin. Toplanan süpernatantı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g’da döndürün. Süper nantantın çoğunu atın ve 750 μL NK-1 ortamında beş ila altı kez pipetleme ile yeniden askıya alın. Taze ortamda yeniden askıya alınan hücreleri orijinal kuyucuğa ekleyin.NOT: Bu paralel sistem Şekil 1’de 2B sistem olarak anılmaktadır. Hücrelerin kaynaklandığı organoidlerin kuyusunun orta değişim programını takip edin. Aşağıdaki adımları izleyerek NK hücresi olgunlaşması gerçekleştirin.3D sistemin eski ortamını çıkarın ve transwellin alt bölmesine 500 μL NK-2 (piyasada bulunan NK hücre farklılaşma ortamı + 4.500 IU / mL IL-15, 8.800 IU / mL IL-7, 26 IU / mL SCF ve 12 IU / mL ftl3L, Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. 14 gün boyunca 37 ° C’de ve% 5 CO2’de inkübe edin.NOT: Ortamın transwell’in dibine dokunduğundan emin olun. 2B sistemdeki hücreler üzerinde tam bir ortam değişikliği gerçekleştirin. 1,5 mL’lik hücrelerin tümünü bir kuyucuktan toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantın çoğunu bir pipetle çıkarın ve peleti 1,5 mL NK-2 ortamı ile yeniden askıya alın (adım 3.4.1). Her alternatif günde bir orta düzeyde değişiklik yapın. 3D sistemin plakasını hafifçe eğin ve transwell’in dışındaki tüm eski ortamları çıkarın. Transwellin dışına 500 μL NK-2 ortamı ekleyin. 2D sistem için 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda yarım orta bir değişim gerçekleştirmek için, hücrelerin dibe batmasına izin vermek için hücrelerin 1-2 dakika oturmasına izin verin. Ortamın 750 μL’sini dikkatlice aspire edin. Hücre kaybını önlemek için toplanan süpernatantı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g’da döndürün. Süper natantın çoğunu atın ve beş ila altı kez pipetleyerek 750 μL NK-2 ortamında yeniden askıya alın. Taze ortamda yeniden askıya alınan hücreleri orijinal kuyucuğuna ekleyin. 4. Olgun hücrelerin toplanması 2B sistemde kültürlenmiş hücreleri toplayın.38-45. günlerde yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri toplayın. 1 mL PBS ile iki kez yıkayın. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı bir pipetle çıkarın ve seçtiğiniz tamponda yeniden askıya alın (yani, akış sitometrisi için PBS +% 2 FBS, Malzeme Tablosuna bakınız). Organoide gömülü hücreleri toplayın.Ortamı transvelin dışından 38-45. günlerde 15 mL’lik bir tüpe toplayın. Transvelin içine 200 μL PBS ekleyerek ve beş ila altı kez yukarı ve aşağı pipetleyerek, organoidi iki kez yıkayın. Süspansiyonu 15 mL tüpe aktarın. 12 delikli bir plakanın kuyucuğuna 500 μL PBS ekleyin. Organoidi transvilden forsepsli 12 delikli plakanın kuyusuna aktarın. Bir çift makas ve forseps kullanarak organoidi 20 kez kesin. Forseps ve makas üzerinde kalan hücreleri PBS ile kuyuya yıkayın. Mümkün olduğunca fazla PBS toplayın ve organoid yapıyı aspire etmeden adım 4.2.1’de kullanılan 15 mL tüpe aktarın. Organoidi enzimatik olarak sindirmek için transwell’e 500 μL ayrışma reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Ticari bir hücre ayırma çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile 37 ° C’de 7-10 dakika ve% 5 CO2’de inkübe edin. % 2 FBS ile 1 mL PBS ekleyerek reaksiyonu söndürün ve çözeltiyi başka bir 15 mL tüpte toplayın. Kuyuyu iki kez% 2 FBS ile 1 mL PBS ile yıkayın.NOT: Morfolojiye göre inkübasyonun uzunluğunu belirleyin. Tek hücrelerin 3B yapının zarından salınmaya başladığı noktaya ulaşmaya çalışın. %2 FBS ile 1 mL PBS ekleyin ve 8-10 kez yukarı ve aşağı pipet ekleyin. Organoid yapılar da dahil olmak üzere tüm çözeltileri toplayın. Bunları bir hücre süzgeci ile adım 4.2.3’te kullanılan 15 mL tüpe aktarın. Her iki tüpü de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı bir pipetle atın. Hücre peletini tercih edilen tamponla yeniden askıya alın (adım 4.1.2).