יצירת תאי הרג טבעיים מתאי גזע פוטנציאליים מורחבים אנושיים

המחקר הנוכחי עסק בניסויי מבחנה ; לפיכך, אישור אתיקה אינו ישים. קווי התאים המבוססים ששימשו במחקר זה התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים). 1. יצירת מבנים אורגנואידים תלת ממדיים מ- hEPSCs שמור על hEPSCs על ידי תרבית אותם עם 1 מ”ל של מדיום EPSC (צלחת 12 בארות) על תאי מזין SNL1.הערה: מושבות בצורת כיפה נצפות (איור 2A) אם העוצמה המורחבת שלהן נשארת. בצע הבחנה מראש של hEPSCs.הסר את מדיום hEPSC והוסף 1 מ”ל של מדיום DFK (DMEM/F12 + 10% מדיום החלפת סרום, עיין בטבלת החומרים). יש לדגור במשך 2-3 ימים בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. בצע שינוי בינוני ביום השני אם ממשיכים את הדגירה במשך 3 ימים.הערה: מתחת למיקרוסקופ, המושבות בצורת כיפה משוטחות (איור 2B). בדוק את היווצרות גופי העובר על ידי טכניקת הטיפה התלויה 7,8.הסר את מדיום DFK, ושטוף עם 1 מ”ל של PBS פעם אחת. הוסף 500 μL של 0.05% טריפסין, ודגר על הצלחת ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 3-7 דקות בהתבסס על המורפולוגיה.הערה: יש לנתק את תאי ה-hEPSC מתאי ההזנה כאשר הצלחת מופרעת מעט. הסר את הטריפסין, והוסף 2 מ”ל של מדיום DFK כדי לקצור את התאים. סובבו את התאים במהירות של 300 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את הסופרנאטנט עם פיפטה. הוסף 1 מ”ל של מדיום DFK ו- 1 μL של Y27632 (ראה טבלת חומרים) כדי להשהות מחדש את התאים על ידי הבהוב. ספור את מספר התאים בתוך תרחיף התא עם המוציטומטר9. דללו את תרחיף התא עם מדיום DFK ו-Y27632 (1,000x) כך שיהיו 4,000 תאים/25 μL של תווך DFK. מלאו את הפקק של צלחת פטרי בקוטר 10 ס”מ בכ-30-40 טיפות של 25 מיקרוליטר תרחיף תאים לכל מכסה. יוצקים מעט PBS לצלחת התחתונה כדי למנוע אידוי של הטיפות. הופכים בעדינות את הפקק ומכסים את המנה. לדגור את המנה ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 3 ימים. 2. דפוס מזודרם והמטו-אנדותל של הגוף העוברי (EB) אספו EBs בתוך הטיפה.לאסוף את כל EBs מן הטיפה לתוך צינור 15 מ”ל באמצעות פיפטה 1 מ”ל וכמה PBS. לשאוב קצת PBS לתוך הטיפה, ולאחר מכן לשאוף החוצה את המדיום, כולל EBs, עם פיפטה.הערה: טיפות צהובות יותר מצביעות על היווצרות וצמיחה מוצלחות יותר מאשר טיפות ורודות. סובבו את ה-EBs שנאספו במהירות של 100 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, והשתמשו בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט. הוסף 1 מ”ל של מדיום A (מתוך ערכת התמיינות תאים זמינה מסחרית, ראה טבלת החומרים) כדי להעביר את EBs שנאספו לצלחת 24 בארות שאינה דבקה. תייגו יום זה כיום 0 (איור 1).הערה: בדרך כלל, כל ה- EBs שנאספו מצלחת אחת של 10 ס”מ מקובצים ומועברים לבאר אחת של צלחת בת 24 בארות. בצע דפוס מזודרם של EBs.לדגור על הצלחת במשך 3 ימים ב 37 ° C עם 5% CO2. ביום השני, יש להסיר 500 μL של מדיום A (מהערכה, שלב 2.1.2) תוך הימנעות מפיפטציה של ה-EBs. לאחר מכן, להוסיף 500 μL של בינוני טרי A. בצע מפרט המטו-אנדותל של הגוף העוברי.מוציאים 700 μL של בינוני A מהבאר, ומוסיפים 700 μL של בינוני B (מהערכה, שלב 2.1.2). תרבות במשך 7 ימים. בצע חצי שינוי של בינוני B ביום 5, יום 7 ויום 9. 3. התמיינות תאי NK העבר את ה- EBs המעוצבים לממשק אוויר-נוזל.הטו מעט את הצלחת כך שה-EBs יצטברו בתחתית. השתמש פיפטה 1 מ”ל כדי להסיר כמה שיותר מדיום B תוך הימנעות EBs. הרימו את ה-EBs עם פיפטה על ידי שאיפת המדיום הנותר. מעבירים אותם לטרנסוול בצלחת בת 24 בארות (ראו טבלת חומרים).הערה: הגבל את המספרים לשניים עד שלושה EBs לכל טרנסוול לקבלת צפיפות מיטבית. בצע הרחבת אב לימפה.הוסף 500 μL של מדיום NK-1 (בינוני הרחבת לימפה זמין מסחרית + 14 IU/mL IL-3, 4,500 IU/mL IL-15, 8,800 IU/mL IL-7, 26 IU/mL SCF ו- 12 IU/mL ftl3L, ראה טבלת חומרים) לתא התחתון של הטרנסוול. תרבות במשך 14 יום, ולבצע שינוי בינוני כל יומיים. קוצרים ומעבירים את התאים בימים 7-10 לצלחת מצופה.כדי לצפות את הצלחת, דללו את חומר הציפוי (חומר ציפוי התמיינות לימפואידית זמין מסחרית, 100x, ראה טבלת חומרים) ב- PBS. מוסיפים 1 מ”ל של תמיסת ציפוי מדוללת לכל באר של צלחת 12 בארות, ודגרים על הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מכסים את פתח הצלחת בסרט עטיפה. הוסיפו 200 μL של PBS לתוך הטרנסוול, ולאט לאט פיפטה מעלה ומטה בערך חמש עד שש פעמים כדי לקצור את התאים ששוחררו מהאורגנואידים. הימנע pipetting אורגנואידים.הערה: תאים עגולים משתחררים מהאורגנואידים ברציפות (איור 2D). מעבירים את תרחיף התאים שנקטף לצינור של 2 מ”ל, ומסובבים את התאים במהירות של 500 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant עם פיפטה, ולהוסיף 1 מ”ל של מדיום NK-1 (שלב 3.2.1) כדי להשעות מחדש את התאים על ידי pipetting. מוציאים את כל תמיסת הציפוי מהבאר, ושוטפים כל באר של צלחת 12 בארות עם 1 מ”ל של PBS פעמיים. פצלו את התאים שנקטפו ביחס של 1:2. העבר את מתלה התא לצלחת מצופה בת 12 בארות (שלב 3.3.1). הוסף 1 מ”ל של מדיום NK-1 כך שלכל באר יש 1.5 מ”ל של בינוני. כדי לבצע שינוי בינוני, תנו לתאים לשבת 1-2 דקות כדי לאפשר לתאים לשקוע לתחתית. בזהירות לשאוף החוצה 750 μL של בינוני. סובבו את הסופרנאטנט שנאסף במהירות של 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את רוב הסופרנטנט, ולהשהות מחדש ב-750 מיקרוליטר של מדיום NK-1 עם פיפטינג חמש עד שש פעמים. מוסיפים את התאים המרחפים בתווך הטרי לתוך הבאר המקורית.הערה: מערכת מקבילית זו מכונה המערכת הדו-ממדית באיור 1. עקוב אחר לוח הזמנים של השינוי הבינוני של באר האורגנואידים שמהם נוצרו התאים. בצע הבשלה של תאי NK לפי השלבים הבאים.הסר את המדיום הישן של מערכת התלת-ממד, והוסף 500 μL של NK-2 (בינוני התמיינות תאי NK זמין מסחרית + 4,500 IU/mL IL-15, 8,800 IU/mL IL-7, 26 IU/mL SCF ו-12 IU/mL ftl3L, ראה טבלת חומרים) לתא התחתון של הטרנסוול. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 14 יום.הערה: ודא שהמדיום נוגע בתחתית הטרנסוול. בצע שינוי בינוני מלא על התאים במערכת הדו-ממדית. לאסוף את כל 1.5 מ”ל של תאים מבאר אחת, ולצנזר אותו ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מוציאים את רוב הסופרנאטנט עם פיפטה, ומשעיפים מחדש את הגלולה עם 1.5 מ”ל של מדיום NK-2 (שלב 3.4.1). בצע שינוי בינוני בכל יום לסירוגין. הטה מעט את הצלחת של מערכת התלת-ממד, והסר את כל המדיום הישן מחוץ לטרנסוול. הוסף 500 μL של מדיום NK-2 מחוץ לטרנסוול. כדי לבצע שינוי חצי בינוני על באר אחת של צלחת 12 בארות עבור המערכת הדו-ממדית, תנו לתאים לשבת 1-2 דקות כדי לאפשר לתאים לשקוע לתחתית. בזהירות לשאוף החוצה 750 μL של המדיום. סובב את הסופרנאטנט שנאסף ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי למנוע אובדן תאים. יש להשליך את רוב הסופרנטנט, ולהשהות מחדש ב-750 מיקרוליטר של תווך NK-2 על ידי פיפטינג חמש עד שש פעמים. מוסיפים את התאים המרחפים בתווך טרי לבאר המקורית. 4. קצירת תאים בוגרים קצרו את התאים שגודלו בתרבית במערכת הדו-ממדית.קצרו את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה במהלך ימים 38-45. לשטוף עם 1 מ”ל של PBS פעמיים. צנטריפוגה את מתלה התא ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הסופרנאטנט עם פיפטה, והשהה אותו מחדש במאגר לפי בחירתו (כלומר, PBS + 2% FBS עבור ציטומטריית זרימה, ראה טבלת חומרים). קצרו את התאים המוטבעים באורגנואיד.אספו את התווך מחוץ לטרנסוול לתוך צינור של 15 מ”ל במהלך ימים 38-45. שטפו את האורגנואיד פעמיים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של PBS בתוך הטרנסוול ופיפטציה למעלה ולמטה חמש עד שש פעמים. העבר את המתלה לצינור 15 מ”ל. הוסף 500 μL של PBS לתוך באר של צלחת 12 בארות. מעבירים את האורגנואיד מהטרנסוול לבאר זו של צלחת 12 הקידוחים בעזרת מלקחיים. חותכים את האורגנואיד 20 פעמים באמצעות זוג מספריים ומלקחיים. שטפו את התאים הנותרים על המלקחיים והמספריים לתוך הבאר עם PBS. אסוף PBS רב ככל האפשר, והעבר אותו לצינור 15 מ”ל המשמש בשלב 4.2.1 מבלי לשאוף את מבנה האורגנואידים. הוסף 500 μL של מגיב הדיסוציאציה (ראה טבלת החומרים) לתוך הטרנסוול כדי לעכל את האורגנואיד באופן אנזימטי. יש לדגור עם תמיסת ניתוק תאים מסחרית (ראו טבלת חומרים) למשך 7-10 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. להרוות את התגובה על ידי הוספת 1 מ”ל של PBS עם 2% FBS, ולאסוף את הפתרון עוד 15 מ”ל צינור. לשטוף את הבאר עם 1 מ”ל של PBS עם 2% FBS פעמיים.הערה: קבע את אורך הדגירה בהתבסס על המורפולוגיה. נסו להשיג את הנקודה שבה תאים בודדים מתחילים להשתחרר מהקרום של המבנה התלת-ממדי. הוסף 1 מ”ל של PBS עם 2% FBS, פיפטה למעלה ולמטה 8-10 פעמים. לאסוף את כל התמיסות, כולל מבנים אורגנואידים. העבר אותם לצינור 15 מ”ל המשמש בשלב 4.2.3 עם מסננת תאים. צנטריפוגה את שני הצינורות ב 500 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט עם פיפטה. השהה מחדש את גלולת התא עם המאגר הנבחר (שלב 4.1.2).