Generatie van Natural Killer Cellen uit Human Expanded Potential Stamcellen

De huidige studie betrof in vitro experimenten; daarom is ethische goedkeuring niet van toepassing. De gevestigde cellijnen die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen uit commerciële bronnen (zie de tabel met materialen). 1. Generatie van 3D organoïde structuren uit hEPSC’s Onderhoud hEPSC’s door ze te kweken met 1 ml EPSC-medium (12-wellsplaat) op SNL-feedercellen1.OPMERKING: Koepelvormige kolonies worden waargenomen (figuur 2A) als hun uitgebreide potentie blijft bestaan. Voer pre-differentiatie van de hEPSC’s uit.Verwijder het hEPSC-medium en voeg 1 ml DFK-medium toe (DMEM/F12 + 10% serumvervangend medium, zie de materiaaltabel). Incubeer gedurende 2-3 dagen bij 37 °C en 5% CO2. Voer een gemiddelde verandering uit op de tweede dag als u de incubatie gedurende 3 dagen voortzet.OPMERKING: Onder de microscoop worden de koepelvormige kolonies afgeplat (figuur 2B). Controleer de vorming van embryoïde lichamen met behulp van dehanging drop-techniek 7,8.Verwijder het DFK-medium en was eenmaal met 1 ml PBS. Voeg 500 μL 0,05% trypsine toe en incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 3-7 minuten op basis van de morfologie.OPMERKING: De hEPSC’s moeten kunnen worden losgemaakt van de feedercellen wanneer de plaat enigszins wordt verstoord. Verwijder de trypsine en voeg 2 ml DFK-medium toe om de cellen te oogsten. Draai de cellen op 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant met een pipet. Voeg 1 ml DFK-medium en 1 μL Y27632 (zie de materiaaltabel) toe om de cellen te reuspenderen door te vegen. Tel het aantal cellen in de celsuspensie met een hemocytometer9. Verdun de celsuspensie met DFK medium en Y27632 (1.000x) zodat er 4.000 cellen/25 μL DFK medium zijn. Vul de dop van een petrischaaltje van 10 cm met ongeveer 30-40 druppels 25 μL celsuspensie per dop. Giet wat PBS in de onderste schaal om de verdamping van de druppels te voorkomen. Draai de dop voorzichtig om en bedek de schaal. Incubeer het gerecht op 37 °C en 5% CO2 gedurende 3 dagen. 2. Mesoderm en hemato-endotheelpatronen van het embryoïde lichaam (EB) Verzamel EV’s in de druppel.Verzamel alle EB’s van de druppel in een buis van 15 ml met behulp van een pipet van 1 ml en wat PBS. Pomp een beetje PBS in de druppel en zuig vervolgens het medium, inclusief de EB’s, met de pipet uit.OPMERKING: Druppels die meer geel zijn, duiden op meer succesvolle vorming en groei dan roze druppels. Draai de verzamelde EB’s op 100 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen. Voeg 1 ml medium A toe (uit een in de handel verkrijgbare celdifferentiatiekit, zie de tabel met materialen) om de verzamelde EB’s over te brengen naar een niet-hechtende 24-well plaat. Label deze dag als Dag 0 (Figuur 1).OPMERKING: Gewoonlijk worden alle EB’s verzameld uit één schaal van 10 cm gegroepeerd en overgebracht naar één put van een bord met 24 putten. Voer mesoderm-patronen van de EB’s uit.Incubeer de plaat gedurende 3 dagen bij 37 °C met 5% CO2. Verwijder op dag 2 500 μL medium A (uit de kit, stap 2.1.2) terwijl u het pipetteren van de EB’s vermijdt. Voeg vervolgens 500 μL vers medium A toe. Voer hemato-endotheelspecificatie van het embryoïde lichaam uit.Verwijder 700 μL medium A uit de put en voeg 700 μL medium B toe (uit de kit, stap 2.1.2). Cultuur voor 7 dagen. Voer een halve verandering van medium B uit op dag 5, dag 7 en dag 9. 3. NK-celdifferentiatie Breng de patroon-EB’s over op een lucht-vloeistofinterface.Kantel de plaat iets zodat de EB’s aan de onderkant aggregeren. Gebruik een pipet van 1 ml om zoveel mogelijk medium B te verwijderen en vermijd de EB’s. Pak de EB’s op met een pipet door het resterende medium aan te zuigen. Breng ze over in een transwell in een plaat met 24 putten (zie de materiaaltabel).OPMERKING: Beperk de aantallen tot twee tot drie EV’s per transwell voor een optimale dichtheid. Voer lymfoïde voorloperuitbreiding uit.Voeg 500 μL NK-1 medium (in de handel verkrijgbaar lymfoïde expansiemedium + 14 IE/ml IL-3, 4.500 IE/ml IL-15, 8.800 IE/ml IL-7, 26 IE/ml SCCF en 12 IE/ml ftl3L, zie de materiaaltabel) toe aan het onderste compartiment van de transwell. Cultuur gedurende 14 dagen en voer om de dag een gemiddelde verandering uit. Oogst en breng de cellen op dag 7-10 over naar een gecoate plaat.Om de plaat te coaten, verdunt u het coatingmateriaal (in de handel verkrijgbaar lymfoïde differentiatiecoatingmateriaal, 100x, zie de tabel met materialen) in PBS. Voeg 1 ml verdunde coatingoplossing toe aan elke put van een 12-wellsplaat en incubeer de plaat een nacht bij 4 °C. Bedek de opening van de plaat met wikkelfolie. Voeg 200 μL PBS toe aan de transwell en pipetteer langzaam op en neer ongeveer vijf tot zes keer om de cellen te oogsten die vrijkomen uit de organoïden. Vermijd pipetteer de organoïden.OPMERKING: Er komen continu ronde cellen vrij uit de organoïden (figuur 2D). Breng de geoogste celsuspensie over in een buis van 2 ml en draai de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant met een pipet en voeg 1 ml NK-1 medium (stap 3.2.1) toe om de cellen te resuspenderen door te pipetteren. Verwijder alle coatingoplossing uit de put en was elke put van een 12-wells plaat met 1 ml PBS tweemaal. Splits de geoogste cellen in een verhouding van 1:2. Breng de celsuspensie over op een gecoate 12-wellsplaat (stap 3.3.1). Voeg 1 ml NK-1 medium toe, zodat elke put 1,5 ml medium heeft. Om een gemiddelde verandering uit te voeren, laat je de cellen 1-2 minuten zitten om de cellen naar de bodem te laten zinken. Zuig voorzichtig 750 μL medium uit. Draai het verzamelde supernatant op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het grootste deel van het supernatant weg en resuspenseer in 750 μL NK-1-medium met pipetteren vijf tot zes keer. Voeg de cellen die in het verse medium zijn geresuspendeerd toe aan het oorspronkelijke putje.OPMERKING: Dit parallelle systeem wordt in figuur 1 het 2D-systeem genoemd. Volg het medium veranderingsschema van de put van de organoïden waaruit de cellen afkomstig zijn. Voer NK-celrijping uit volgens de onderstaande stappen.Verwijder het oude medium van het 3D-systeem en voeg 500 μL NK-2 (in de handel verkrijgbaar NK-celdifferentiatiemedium + 4.500 IE/ml IL-15, 8.800 IE/ml IL-7, 26 IE/ml SCF en 12 IE/ml ftl3L, zie de materiaaltabel) toe aan het onderste compartiment van de transwell. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 14 dagen.OPMERKING: Zorg ervoor dat het medium de bodem van de transwell raakt. Voer een volledige mediumverandering uit op de cellen in het 2D-systeem. Verzamel alle 1,5 ml cellen uit één put en centrifugeer het bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het grootste deel van het supernatant met een pipet en resuspendeer de pellet met 1,5 ml NK-2 medium (stap 3.4.1). Voer elke andere dag een gemiddelde verandering uit. Kantel de plaat van het 3D-systeem iets en verwijder al het oude medium buiten de transwell. Voeg 500 μL NK-2 medium toe buiten de transwell. Om een halve mediumverandering uit te voeren op een put van een 12-well plaat voor het 2D-systeem, laat u de cellen 1-2 minuten zitten om de cellen naar de bodem te laten zinken. Zuig voorzichtig 750 μL van het medium uit. Draai het verzamelde supernatant op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om celverlies te voorkomen. Gooi het grootste deel van het supernatant weg en resuspenseer in 750 μL NK-2-medium door vijf tot zes keer te pipetteren. Voeg de in vers medium geresuspendeerde cellen toe aan het oorspronkelijke putje. 4. Rijpe cellen oogsten Oogst de cellen gekweekt in het 2D-systeem.Oogst de cellen door op en neer te pipetteren tijdens dag 38-45. Tweemaal wassen met 1 ml PBS. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant met een pipet en resuspenseer het in de buffer naar keuze (d.w.z. PBS + 2% FBS voor flowcytometrie, zie de tabel met materialen). Oogst de cellen ingebed in de organoïde.Verzamel het medium van buiten de transwell in een buis van 15 ml tijdens dag 38-45. Was de organoïde tweemaal door 200 μL PBS in de transwell toe te voegen en vijf tot zes keer op en neer te pipetteren. Breng de suspensie over op de buis van 15 ml. Voeg 500 μL PBS toe aan een putje van een 12-well plaat. Breng de organoïde over van de transwell naar die put van de 12-well plaat met een tang. Knip de organoïde 20 keer met een schaar en tang. Spoel de resterende cellen op de tang en schaar in de put met PBS. Verzamel zoveel mogelijk PBS en breng het over naar de buis van 15 ml die in stap 4.2.1 is gebruikt zonder de organoïde structuur aan te zuigen. Voeg 500 μL van het dissociatiereagens (zie de materiaaltabel) toe aan de transwell om de organoïde enzymatisch te verteren. Incubeer met een commerciële celloslatingsoplossing (zie de materiaaltabel) gedurende 7-10 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Doof de reactie door 1 ml PBS met 2% FBS toe te voegen en verzamel de oplossing in een andere buis van 15 ml. Was de put tweemaal met 1 ml PBS met 2% FBS.OPMERKING: Bepaal de lengte van de incubatie op basis van de morfologie. Probeer het punt te bereiken waarop afzonderlijke cellen beginnen te worden vrijgegeven uit het membraan van de 3D-structuur. Voeg 1 ml PBS toe met 2% FBS en pipetteer 8-10 keer op en neer. Verzamel alle oplossingen, inclusief de organoïde structuren. Breng ze over op de buis van 15 ml die in stap 4.2.3 is gebruikt met een celzeef. Centrifugeer beide buizen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg met een pipet. Resuspendeer de celpellet met de buffer naar keuze (stap 4.1.2).