توليد الخلايا القاتلة الطبيعية من الخلايا الجذعية البشرية المحتملة الموسعة
Summary
يوضح البروتوكول الحالي كيفية التمييز بين خلايا CD3− / CD45 + CD56 + ذات السمية الخلوية الخفيفة والخلايا الجذعية البشرية المحتملة الموسعة (hEPSCs) في ظل ظروف الاستزراع ثلاثي الأبعاد و 2D. وهذا يسمح بالتحقق من النمط الظاهري الروتيني دون تدمير البيئة المكروية المعقدة.
Abstract
يسمح تمايز الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) عن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات بإجراء البحوث على المنتجات الخلوية السريرية وتصنيعها للعلاج المناعي. يوصف هنا بروتوكول من مرحلتين يستخدم وسيطا تجاريا خاليا من المصل وكوكتيلا من السيتوكينات (إنترلوكين [IL] -3 ، IL-7 ، IL-15 ، عامل الخلايا الجذعية [SCF] ، و التيروزين كيناز 3 ليجند الشبيه ب FMS [Ftl3L]) للتمييز بين الخلايا الجذعية البشرية المحتملة الموسعة (hEPSCs) إلى خلايا تمتلك خصائص الخلايا القاتلة الطبيعية في المختبر باستخدام تقنية الاستزراع ثلاثية الأبعاد (3D) و 2 الأبعاد (2D). باتباع هذا البروتوكول ، يتم إنشاء خلايا CD3−CD56 + أو CD45 + CD56 + NK باستمرار. عند الاستزراع مع أهداف الورم لمدة 3 ساعات ، تظهر المنتجات المتمايزة سمية خلوية خفيفة مقارنة بخط الخلايا الدائمة المستقل IL-2 ، خلايا NK92mi. يحافظ البروتوكول على تعقيد البيئة المكروية التمايز عن طريق توليد هياكل 3D ، مما يسهل دراسة العلاقات المكانية بين الخلايا المناعية ومنافذها. وفي الوقت نفسه ، يتيح نظام الثقافة 2D التحقق الظاهري الروتيني من تمايز الخلايا دون الإضرار بمكانة التمايز الدقيقة.
Introduction
بالمقارنة مع الخلايا الجذعية التقليدية متعددة القدرات مثل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان (hiPSCs) ، فإن الخلايا الجذعية البشرية المحتملة الموسعة (hEPSCs) أقرب إلى حالة القدرة الكاملة ، حيث يمكن أن تتمايز إلى سلالات خارج الجنين وجنينية1. على سبيل المثال ، يمكن تمييز hEPSCs إلى خلايا تشبه الأرومة الغاذية1 وخلايا تشبه كيس الصفار2. لتحقيق الفعالية الفريدة ل hEPSCs ، يتم استزراع بلاستومير فردي في وسط يحتوي على عدة جزيئات صغيرة تمنع التزام النسب بالإشارة1 ، والتي يشار إليها باسم وسيط EPSC (EPSCM). إن استزراع hESCs و hiPSCs في EPSCM يوسع من فعاليتها المقيدة سابقا لتمييزها إلى خلايا الأرومة الغاذية1.
الخلايا الجذعية متعددة القدرات هي أداة بحثية قيمة لتجربة التعديلات الجينية الجديدة. نظرا لقدرات التجديد الذاتي والتمايز للخلايا الجذعية متعددة القدرات ، يمكن لاستنساخ واحد محول لخلية جذعية متعددة القدرات إنتاج منتجات خلوية متمايزة تمتلك نفس التعديل الجيني في نفس الموضع. وضع تشو وكوفمان معيارا لتمايز الخلايا القاتلة الطبيعية عن الخلايا الجذعية التقليدية متعددة القدرات (hESCs و hiPSCs)3. أولا ، قاموا بتحفيز الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) من جسم جنيني مشتق من الخلايا الجذعية متعددة القدرات. أدت إضافة عامل الخلايا الجذعية (SCF) ، التيروزين كيناز 3 ليجند الشبيه ب FMS (Ftl3L) ، الإنترلوكين (IL) -7 ، IL-15 ، ومكمل مبكر من IL-3 إلى تحيز HSCs لتتطور إلى خلايا قاتلة طبيعية (NK). بعد ذلك ، قاموا بتوسيع الخلايا القاتلة الطبيعية بخلايا تقديم المستضد الاصطناعي (aAPCs) ، والتي تقدم IL-21 المرتبط بالغشاء ، مع مكملات مستمرة من IL-2. طبق الباحثون هذا النهج على العلاج المناعي من أجل توليد خلايا قاتلة طبيعية مشتقة من iPSC تتمتع بمستقبلات المستضد الخيمري (CAR-iNK)4.
يتم تعريف الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية على أنها كريات الدم البيضاء CD3−CD56 + في الدم المحيطي. هم المستجيبون ضد الخلايا المصابة بالفيروس والخلايا السرطانية5. تتعرف بعض المستقبلات المثبطة على الخلايا القاتلة الطبيعية على الجزيئات المعبر عنها في كل مكان في الخلايا الطبيعية. على سبيل المثال ، يتعرف NKG2A / CD94 heterodimer المعبر عنه على خلايا NK على جزيئات MHC من الفئة الأولى5. وفي الوقت نفسه ، تتعرف المستقبلات المنشطة على الخلايا القاتلة الطبيعية على الروابط التي يسببها الإجهاد ، مثل كيفية التعرف على NKG2D للتسلسل A المرتبط ب MPTIDE من الفئة الأولى من MHC المستحث بالتحول A (MICA / MICK)6. تقوم بعض الخلايا المتحولة بتقليل تنظيم “روابطها الذاتية” للهروب من المراقبة المناعية وتنظيم الروابط الشاذة ، مما يحفز الخلايا القاتلة الطبيعية على تنفيذ آلياتها الحلزونية. لفتت القدرات الجوهرية المضادة للورم للخلايا القاتلة الطبيعية الانتباه إلى هذا النوع من الخلايا المناعية.
إن القدرة على الظهور في وقت واحد لكل من السلالات الجنينية وغير الجنينية قد تجعل hEPSCs تلخيصا أكثر إخلاصا لمكانة التطور الجنيني من الخلايا الجذعية التقليدية متعددة القدرات. من التجربة ، من الأسهل الحفاظ على قوة hEPSCs من hiPSCs. في الدراسة الحالية ، تم تطوير بروتوكول (الشكل 1) لتحيز hEPSCs للتطور إلى سلالات مكونة للدم وتمييز الخلايا السلفية لاحقا إلى خلايا قاتلة طبيعية (NK) في المختبر. في البروتوكول ، يتم استخدام الوسائط التجارية لتجنب تناقضات المصل ، تليها إضافة السيتوكينات تدريجيا إلى التمايز المتحيز إلى السلالات اللمفاوية. يحتوي هذا البروتوكول على نظامين للحفاظ على البيئة المكروية ثلاثية الأبعاد المعقدة أثناء اشتقاق خلايا CD3−CD56 + / CD45 + CD56 + التي تشبه الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية ظاهريا ووظيفيا.
قد يكون هذا البروتوكول مفيدا في دراسة تفاعل الخلايا المناعية مع منافذ تمايزها وقد يكون لديه القدرة على تنقية المنتجات الخلوية للاستخدامات العلاجية المناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك بعض الخطوات المحورية لضمان التمايز الناجح لخلايا CD45 + CD56 + من hEPSCs. التمايز المسبق (الخطوة 1.2) أمر بالغ الأهمية لأن وسيط EPSC يحتوي على مثبطات التزام النسب1. بعد التمايز المسبق ، يتم تسطيح مستعمرات hEPSCs على شكل قبة (الشكل 2 ب). لا غنى عن إضافة Y27632 ، مثبط Rho-kinase (ROCKi) ، أثناء تكوين EBs من hEPSCs (الخطوة 1.3) لبقاء hEPSCs بعد التفكك. اعتبار آخر مهم هو عدد EBs المزروعة في كل بئر. نظرا لأنه نظام صغير الحجم ، فإن اثنين إلى ثلاثة EBs لكل transwell هي الكثافة المثلى لمنع الاستهلاك المفرط للوسائط. يتم الحفاظ على واجهة الهواء والسائل خلال كامل مسار تمايز الخلايا القاتلة الطبيعية لنظام 3D ، والذي يعتقد أنه يحافظ على قطبية الخلايا اللحمية ويدعم توسع السلف المكونة للدم المشتقة من AGM14,15.
كما ذكرنا من قبل ، فإن كثافة EBs على transwell هي عامل حاسم للتمايز الناجح. العلامة الرئيسية لهذا هو لون الوسط 1 يوم بعد زرع EBs على transwell. إذا تحول اللون إلى اللون الأصفر بسرعة ، فهذا يشير إما إلى التلوث أو الاكتظاظ. لحل المشكلة ، يجب استخدام ماصة 1 مل لالتقاط EBs إضافية يدويا ونقلها إلى بئر آخر.
أحد القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هو نقاء خلايا CD3− / CD45 + CD56 + في منتجات IVD ، والتي يعتقد أنها مسؤولة جزئيا عن السمية الخلوية السفلية مقارنة بخلايا NK92mi النقية. تم استخدام نظام ثقافة 3D للحث على السلف المكونة للدم عن طريق توليد EB الذي يشبه الطبقات الجرثومية الجنينية الثلاث. تحاكي هذه الاستراتيجية تطور خلايا الدم في البيئة المكروية لنخاع العظم ، وبالتالي إزالة الحاجة إلى الخلايا اللحمية لدعم التمايز3. بدون خطوة فرز لتنقية السلف المكونة للدم ، من المتوقع أن تنخفض نقاء منتجات IVD. تعمل الإستراتيجية للاحتفاظ بمكانة التمايز المعقدة مع زيادة نقاء منتج نقطة النهاية على تطوير طريقة توسيع لمنتجات CD3−CD56+ IVD التي تم فرزها. على سبيل المثال ، يمكن زراعة منتجات CD3−CD56 + IVD التي تم فرزها على خلايا تقديم المستضد الاصطناعي (aAPCs) ، مثل خلايا K562 المشععة المهندسة باستخدام IL-21 المرتبط بالغشاء. مع توفير IL-2 في الثقافة ، يمكن لهذه الطريقة تحقيق زيادة بمقدار 1000 ضعف في أرقام الخلايا القاتلة الطبيعية3.
ومن القيود الأخرى محدودية الوصول إلى الخلايا البشرية القاتلة الطبيعية كمرجع إيجابي. NK92mi هو المرجع الإيجابي المستخدم في مقايسة الثقافة المشتركة ، لكنه ليس دقيقا بدرجة كافية. تم تصميم خلايا NK92mi من خلايا NK92 ، وهو خط خلية دائم يعبر عن الأنماط الظاهرية للخلايا القاتلة الطبيعيةالمنشطة 16 ، لإنتاج IL-2 بشكل مستقل لتلبية متطلبات الثقافة. تظهر خلايا NK92 نشاطا قاتلا متفوقا ضد خلايا K562 في المختبر مقارنة بالخلايا القاتلة الطبيعية الأوليةالبشرية 17. يمكن تحقيق مقارنة أكثر عدلا لقدرة منتجات IVD على قتل الورم من خلال فحص السمية الخلوية لخلايا الدم القاتلة الطبيعية المحيطية بالتوازي ، ولكن لسوء الحظ ، لا يوجد وصول إلى بنوك الدم.
يهدف بروتوكول الاستزراع ثنائي النظام هذا إلى إنشاء خلايا CD3− / CD45 + CD56 + من hEPSCs. يمكن إجراء تقييم علامات السطح والسمية الخلوية باستخدام FACS بشكل روتيني على خلايا من أنظمة 2D دون تعطيل مكانة التمايز. على الرغم من الاختلافات في النسب المئوية لخلايا CD3−CD56 + ، يمكن للأنظمة ثلاثية الأبعاد و 2D اشتقاق خلايا CD3−CD56 + مع اختلافات مماثلة في تعبير CD56 (الشكل 3) ، ويعكس نظام 2D وجود أسلاف لمفاوية من حالة الثقافة ثلاثية الأبعاد.
تكمن أهمية استخدام نظام ثقافة 3D في أنه يسمح باستخدام مقايسات التنميط عالية الدقة ، مثل النسخ المكاني أو قياس الطيف الكتلي للتصوير ، للبحث في العلاقات المكانية وتفاعلات الخلية الخلوية داخل مكانة التمايز المعقدة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر الدكتور هاندي كاو ، وسانشينغ غاو ، وديفيد شيانغ ، وييمينغ تشاو ، وريتيكا جوغاني ، وأوين تشان ، وستيفاني تشيونغ ، وسيلين تشان على مساعدتهم الفنية ومناقشاتهم المفيدة. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق تكنولوجيا المنصة. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com.
Materials
| 30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free | Wako Chemicals | 017-22231 | For resuspending cytokines. |
| ACCUMAX | STEMCELL Technologies | 07921 | |
| Anti-human-CD159a-PE | BD | 375104 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
| Anti-human-CD3-APC antibodies | BD | 555355 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) |
| Anti-human-CD45-APC antibodies | BD | 555485 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS) |
| Anti-human-CD56-PE antibodies | BD | 555516 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS) |
| Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies | BD | 335826 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
| Anti-human-CD94-APC | BD | 559876 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Thermo Scientific | 11772644 | |
| Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience | Thermo Scientific | 16-5838-85 | |
| Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts | STEMCELL Technologies | 3470 | |
| Dapi Solution, 1 mg/mL | BD | 564907 | It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) |
| DMEM | CPOS-Bioreagent core | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11320033 | |
| FcX, human | Biolengend | 422302 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America | CPOS-Bioreagent core | 10270106 | |
| FlowJo v10.8.0 | BD | ||
| Gibco PBS (10x) pH 7.4 | CPOS-Bioreagent core | 70011044 | 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Scientific | 10828-028 | |
| MyeloCult H5100 medium | STEMCELL Technologies | 5150 | |
| NK92mi cells | ATCC | CRL-2408 | Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL. |
| Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate | Thermo Scientific | 150628 | flat bottom |
| Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| Nunc EasYDish Dishes | Thermo Scientific | 150460 | |
| pLenti-GFP Lentiviral Control Vector | CELL BIOLABS | LTV-400 | It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2. |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein | R&D Systems | 308-FK-005 | It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL. |
| Recombinant Human IL-15 Protein | R&D Systems | 247-ILB-005 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. |
| Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein | R&D Systems | 9124-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. |
| Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug | PeproTech | 200-03 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. |
| Recombinant Human IL-7 Protein | R&D Systems | 207-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. |
| STEMdiff Hematopoietic Kit | STEMCELL Technologies | 5310 | Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B |
| StemSpan lymphoid differentiation coating material | STEMCELL Technologies | 9950 | It is resuspended in PBS (100x) |
| StemSpan NK cell differentiation medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x) into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
| StemSpan lymphoid expansion medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
| StemSpan NK Cell Generation Kit | STEMCELL Technologies | 9960 | Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. |
| The BD LSRFortessa cell analyzer | BD | ||
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific | 25300054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | working concentration: 10 µM |
References
- Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nature Cell Biology. 21 (6), 687-699 (2019).
- Mackinlay, K. M. L., et al. An in vitro stem cell model of human epiblast and yolk sac interaction. eLife. 10, 63930 (2021).
- Zhu, H., Kaufman, D. S. An improved method to produce clinical-scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2048, 107-119 (2019).
- Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity. Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192 (2018).
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nature Immunology. 9 (5), 503-510 (2008).
- Dhar, P., Wu, J. D. NKG2D and its ligands in cancer. Current Opinion in Immunology. 51, 55-61 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- Rungarunlert, S., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bioreactors. World Journal of Stem Cells. 1, 11-21 (2009).
- Counting cells using a hemocytometer. abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022)
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294, 15-22 (2004).
- Tremblay-McLean, A., Coenraads, S., Kiani, Z., Dupuy, F. P., Bernard, N. F. Expression of ligands for activating natural killer cell receptors on cell lines commonly used to assess natural killer cell function. BMC Immunology. 20, 8 (2019).
- Inoue, T., Swain, A., Nakanishi, Y., Sugiyama, D. Multicolor analysis of cell surface marker of human leukemia cell lines using flow cytometry. Anticancer Research. 34 (8), 4539 (2014).
- Mhatre, S. Rapid flow cytometry based cytotoxicity assay for evaluation of NK cell function. Indian Journal of Experimental Biology. 52 (10), 983-988 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Motazedian, A., et al. Multipotent RAG1+ progenitors emerge directly from haemogenic endothelium in human pluripotent stem cell-derived haematopoietic organoids. Nature Cell Biology. 22 (1), 60-73 (2020).
- Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Yan, Y., et al. Antileukemia activity of a natural killer cell line against human leukemias. Clinical Cancer Research. 4 (11), 2859-2868 (1998).
