जीनोम-वाइड क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर विधि माइक्रो-सी-एक्सएल का उपयोग करके न्यूक्लियोसोम रिज़ॉल्यूशन के साथ त्रि-आयामी जीनोम संगठन के मानचित्रण के लिए एक प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया गया है।
तीन-आयामी (3 डी) गुणसूत्र संगठन जीनोम विनियमन और सेल-प्रकार विनिर्देश में एक प्रमुख कारक है। उदाहरण के लिए, सीआईएस-नियामक तत्व, जिन्हें एन्हांसर के रूप में जाना जाता है, को 3 डी स्पेस में बातचीत के माध्यम से डिस्टल प्रमोटरों की गतिविधि को विनियमित करने के लिए माना जाता है। जीनोम-वाइड क्रोमोसोम अनुरूपण कैप्चर (3 सी) -प्रौद्योगिकियों, जैसे कि हाई-सी, ने कोशिकाओं में जीनोम कैसे व्यवस्थित होते हैं, इसकी हमारी समझ को बदल दिया है। 3 डी जीनोम संगठन की वर्तमान समझ उस संकल्प से सीमित है जिसके साथ 3 डी अंतरिक्ष में गुणसूत्रों के टोपोलॉजिकल संगठन को हल किया जा सकता है। माइक्रो-सी-एक्सएल क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर प्रोटोकॉल के दौरान जीनोम को टुकड़े करने के लिए माइक्रोकोकल न्यूक्लियस (एमनेज) का उपयोग करके क्रोमैटिन की मूल इकाई न्यूक्लियोसोम के स्तर पर रिज़ॉल्यूशन के साथ क्रोमोसोम फोल्डिंग को मापता है। इसके परिणामस्वरूप माप में एक बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है, इस प्रकार अन्य जीनोम-वाइड 3 डी प्रौद्योगिकियों की तुलना में इन्सुलेशन साइटों और क्रोमोसोम लूप का बेहतर पता लगाने की सुविधा मिलती है। स्तनधारी कोशिकाओं से उच्च गुणवत्ता वाले माइक्रो-सी-एक्सएल नमूने तैयार करने के लिए एक नेत्रहीन समर्थित, विस्तृत, चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल इस लेख में प्रस्तुत किया गया है।
माइक्रो-सी-एक्सएल न्यूक्लियोसोम रिज़ॉल्यूशन के साथ 3 डी जीनोम रचना को मापने के लिए एक जीनोम-वाइड तकनीक है। माइक्रो-सी-एक्सएल व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली निकटता बंधाव-आधारित हाई-सी तकनीक पर आधारित है, जिसने हमारी समझ को बदल दिया है कि 3 डी जीनोमकैसे व्यवस्थित किए जाते हैं। माइक्रो-सी-एक्सएल और इसकी पहली पुनरावृत्ति, माइक्रो-सी, शुरू में सैकरोमाइसेस सेरेविसिया2,3 में विकसित की गई थी और बाद में स्तनधारी सेल सिस्टम के लिए अनुकूलित की गई थी, जिसके लिए प्रोटोकॉल ने 3 डी जीनोम की छोटी दूरी की विशेषताओं का पता लगाने में अपनी पूरी क्षमता का प्रदर्शन किया है, जैसे कि क्रोमोसोम लूप और इन्सुलेशन साइटें। यह संस्करण हाल ही में स्तनधारी माइक्रो-सी-एक्सएल प्रकाशनों 4,5 पर आधारित है। चूंकि माइक्रो-सी-एक्सएल माइक्रो-सी की जगह लेता है, इसलिए माइक्रो-सी-एक्सएल को पांडुलिपि में माइक्रो-सी के रूप में संदर्भित किया जाता है।
माइक्रो-सी और हाई-सी6 के बीच प्रमुख अंतर इस प्रकार हैं: 1) प्रतिबंध एंजाइमों की तुलना में माइक्रोकोकल न्यूक्लियस (एमनेस) के साथ जीनोम विखंडन और 2) केवल फॉर्मलाडेहाइड की तुलना में प्रतिक्रियाशील समूहों के बीच बड़े परमाणु अंतर के साथ अतिरिक्त क्रॉसलिंकर। दोनों कदम पारंपरिक हाई-सी की तुलना में माइक्रो-सी के बेहतर सिग्नल-टू-शोर अनुपात में महत्वपूर्ण योगदान देते हैं। विखंडन आकार उस संकल्प को सीमित करता है जिसके लिए 3 डी जीनोम संगठन को निकटता बंधाव प्रोटोकॉल के दौरान हल किया जा सकता है। MNase एक न्यूक्लियस है जो अधिमानतः सुलभ डीएनए को पचाता है और न्यूक्लियोसोमल-संरक्षित डीएनए को बरकरार रखता है। MNase-अनुक्रमण का उपयोग करके न्यूक्लियोसोम पदचिह्न से पता चला है कि न्यूक्लियोसोम पूरी तरह से अधिकांश यूकेरियोटिक जीनोम7 को कवर करते हैं। चूंकि न्यूक्लियोसोम को प्रजातियों और सेल प्रकार के आधार पर 160-220 बीपी की औसत दूरी के साथ पूरे जीनोम में वितरित किया जाता है, इसलिए एमनेस जीनोम आर्किटेक्चर के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मैपिंग के लिए आदर्श एंजाइम है।
माइक्रो-सी विधि में फॉर्मलाडेहाइड (एफए) के साथ संयोजन में एक अतिरिक्त क्रॉसलिंकर का उपयोग सिग्नल-टू-शोर अनुपात 2,8 में भी सुधार करता है। प्रतिक्रियाशील समूहों के बीच लंबे परमाणु स्पेसर के साथ अमाइन-विशिष्ट क्रॉसलिंकर प्रोटीन-प्रोटीन क्रॉसलिंक की सुविधा प्रदान करते हैं। ये आमतौर पर क्रमशः 7.7 ° और 16.1 A स्पेसर के साथ डाइसुसिनिमिडिल ग्लूटारेट (DSG) या एथिलीन ग्लाइकॉल बिस-सक्सिनिमिडिल सक्सिनेट (ईजीएस) होते हैं। ईजीएस या डीएसजी के माध्यम से शोर की कमी विशेष रूप से उच्च विखंडन दर वाले प्रयोगों में स्पष्ट है, जैसे कि माइक्रो-सी, और संभवतः यादृच्छिक बंधावघटनाओं की दर में कमी के कारण होता है।
डीएसजी क्रॉसलिंकिंग और प्रतिबंध एंजाइमों के कई संयोजनों का उपयोग करने वाला हाल ही में विकसित हाई-सी 3.0 प्रोटोकॉल हाई-सी प्रयोगों में शोर को कम करता है और क्रोमोसोम लूप और इन्सुलेशन साइटों 8,9 का पता लगाने में काफी सुधार करता है। फिर भी, विभिन्न इंटरैक्शन डेटा सुविधाओं की साइट-दर-साइट तुलना में पाया गया कि माइक्रो-सी में हाई-सी 3.0 और पारंपरिक हाई-सी8 दोनों की तुलना में क्रोमोसोम लूप और इन्सुलेशन साइटों जैसी छोटी दूरी की विशेषताओं का बेहतर पता लगाया गया था। हालांकि, हाई-सी 3.0 छोटी दूरी की विशेषताओं का पता लगाने में सुधार करता है और पारंपरिक हाई-सी की तुलना में जीनोम कंपार्टमेंटलाइजेशन की मजबूत पहचान बनाए रखता है। सारांश में, क्रोमोसोम रचना कैप्चर विधि की पसंद उद्देश्य और जैविक प्रश्न द्वारा निर्धारित की जानी चाहिए।
यहां, हम सफल माइक्रो-सी प्रयोगों के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो 3 डी जीनोम संगठन को उजागर कर सकता है।
माइक्रो-सी प्रयोग की सफलता प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरणों पर निर्भर करती है जिन्हें सावधानीपूर्वक निष्पादित करने की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, अतिरिक्त क्रॉसलिंकर डीएसजी या ईजीएस के साथ क्रॉसलिंकिंग सेल प्रकार के आधार पर कोशिकाओं के एकत्रीकरण का कारण बन सकती है। क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया में 0.1% -0.5% बीएसए जोड़ने से क्रॉसलिंकिंग दक्षता को प्रभावित किए बिना एकत्रीकरण काफी कम हो जाता है। अक्षम क्रॉसलिंकिंग के परिणामस्वरूप ट्रांस-क्रोमोसोमल इंटरैक्शन की दर बढ़ सकती है जो यादृच्छिक बंधाव का संकेत है। इस प्रोटोकॉल में दूसरा, लेकिन सबसे महत्वपूर्ण, कदम MNase के साथ क्रोमैटिन का पाचन है। सबऑप्टिमल क्रोमैटिन पाचन अक्षम निकटता बंधाव (अति-पाचन) या गैर-निकटता-लिगेटेड डि-न्यूक्लियोसोम (अंडर-पाचन) की बढ़ी हुई दरों की ओर जाता है। लिगेशन प्रतिक्रिया की दक्षता का मूल्यांकन एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (चित्रा 1 बी) द्वारा किया जा सकता है और कम इनपुट अनुक्रमण द्वारा भी इसका सबसे अच्छा अनुमान लगाया जाता है। यदि कम-इनपुट अनुक्रमण से या तो उच्च दोहराव दर (अक्षम बंधाव) या बढ़ी हुई डी-न्यूक्लियोसोम दरों का पता चलता है, तो MNase पाचन डिग्री का पुनर्मूल्यांकन किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल निष्पादित करते समय नमूने के नुकसान से लाइब्रेरी जटिलता कम हो सकती है। डीएनए शुद्धिकरण (चरण 5.3) या न्यूनतम पीसीआर (चरण 8) के बाद एक नमूने की एकाग्रता का सबसे अच्छा मूल्यांकन किया जाता है। डीएनए शुद्धिकरण के बाद 5 x 106 स्तनधारी कोशिकाओं से डीएनए की कुल उपज आमतौर पर >2 μg होती है। MNase पाचन, ExoIII पाचन और डीएनए शुद्धिकरण के बाद डीएनए एकाग्रता को नियंत्रित किया जाना चाहिए। अंतर्जात न्यूक्लियस, जिनमें से बहुतायत सेल प्रकार-विशिष्ट और प्रजाति-विशिष्ट है, डीएनए क्षरण का स्रोत हो सकता है। इसके अलावा, स्तंभ-आधारित डीएनए शुद्धिकरण से डीप्रोटीनेशन प्रतिक्रियाओं से एसडीएस के साथ असंगति के कारण नमूना हानि हो सकती है। इथेनॉल वर्षा पर विचार किया जा सकता है यदि इस चरण में डीएनए एकाग्रता कम है।
चूंकि माइक्रो-सी को नमूना-विशिष्ट एमनेस अनुमापन की आवश्यकता होती है, इसलिए माइक्रो-सी को छोटे सेल आबादी पर लागू करना चुनौतीपूर्ण है, जैसे कि विभिन्न मॉडल जीवों, भ्रूण और एकल कोशिकाओं, ऑर्गेनोइड्स या रोगी बायोप्सी के छोटे अंगों के साथ। यहां, हाई-सी 3.0 अनुक्रम-विशिष्ट प्रतिबंध एंडोन्यूक्लियस 8,9 द्वारा समापन बिंदु प्रतिक्रिया का उपयोग करके एक अच्छी तरह से स्थापित विकल्प प्रदान करता है।
माइक्रो-सी एक उच्च गतिशील सीमा और कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ एक व्यापक रूप से लागू उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रोमोसोम रचना तकनीक है, जो इसे क्रोमोसोम लूप जैसे छोटी दूरी के गुणसूत्र विशेषताओं 4,5,8 की जांच के लिए विशेष रूप से उपयुक्त बनाता है। माइक्रो-सी का रिज़ॉल्यूशन प्रमोटर-एन्हांसर लूप को कैप्चर करने की अनुमति देता है, जो हाई-सी की पहचान सीमा से परे हैं, कुशलतापूर्वक जीनोम संगठन और विनियमन13,14,15 के बीच संबंधों के अधिक विस्तृत विश्लेषण को सक्षम करते हैं। इसके अलावा, डीएनए कैप्चर रणनीतियों को हाल ही में माइक्रो-सी के साथ जोड़ा गया है ताकि लक्षित जीनोमिक लोकी के लोक-विशिष्ट रिज़ॉल्यूशन को अभूतपूर्व स्तर तक बढ़ाया जा सके, जिससे 3 डी जीनोम16,17,18 की अल्ट्रास्ट्रक्चर में नई अंतर्दृष्टि का पता चलता है। सारांश में, हम कल्पना करते हैं कि माइक्रो-सी और इसके डेरिवेट ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन में 3 डी जीनोम की भूमिका को विच्छेदित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक होगी और परिणामस्वरूप, सेल प्रकार भेदभाव और रखरखाव।
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए क्रिस्टल गौबिट्ज़ और कैथलीन स्टीवर्ट-मॉर्गन को धन्यवाद देते हैं। हम अपनी प्रयोगशाला की स्थापना में उनके समर्थन के लिए अंजा ग्रोथ और ग्रोथ लैब को धन्यवाद देते हैं। हम समर्थन के लिए सीपीआर / रिन्यू जीनोमिक्स प्लेटफॉर्म के कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं: एच वोलमैन, एम मिचौट और ए कल्विसा। स्टेम सेल मेडिसिन के लिए नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन सेंटर (reNEW) नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन अनुदान संख्या NNF21CC0073729 द्वारा समर्थित है। नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन सेंटर फॉर प्रोटीन रिसर्च (सीपीआर) नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन अनुदान संख्या NNF14CC0001 द्वारा समर्थित है। हम माउस ईएस कोशिकाओं के लिए नोवो नॉर्डिस्क सेंटर फॉर स्टेम सेल मेडिसिन, रीन्यू कोपेनहेगन में ब्रिकमैन लैब को धन्यवाद देते हैं।
1 mM Biotin dATP | Jenna Bioscience | NU-835-Bio14-S | |
1 mM Biotin dCTP | Jenna Bioscience | NU-809-BioX-S | |
10 mM dGTP | NEB | N0442S | |
10 mM dTTP | NEB | N0443S | |
10 U/ml T4 PNK | NEB | M0201L | |
100 U/L Exonuclease III | NEB | M0206L | |
10x NEBuffer 1.1 | NEB | B7001S | |
10x NEBuffer 2.1 | NEB | B7202S | |
10x T4 DNA Ligase buffer | NEB | B0202A | |
1x DPBS w/o Mg2+ and Ca2+ | ThermoFisher | 14190144 | |
1x LIF | |||
2_Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | 0.1 mM b-mercaptoethanol |
37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-500ML | Caution. See manufactures MSDS |
400 U/ml T4 DNA Ligase | NEB | M0202L | |
5 U/ml Klenow Fragment | NEB | M0210L | |
Agarose | BIO-RAD | 1613102 | Caution. See manufactures MSDS |
BSA 20mg/ml | NEB | B9000S | |
CaCl2 | |||
cell counter | |||
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D8418-100ML | Caution. See manufactures MSDS |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | refered to as: magnet magnet for 1.5 ml tubes |
DynaMag-PCR Magnet | Invitrogen | 492025 | refered to as: magnet magnet for PCR tubes |
EDTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | |
EGTA Ultrapure 0.5M pH 8.0 | BioWorld | 40121266-1 | |
Ethanol 96% | VWR Chemicals | 20824365 | quality control system |
Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585-011 | |
Ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS) | ThermoFisher | 21565 | |
Fetl Bovin Serum | Sigma Aldrich | F7524 | 15% FBS |
Gel Loading dye purple (6X) | NEB | B7024S | |
Glycine | PanReac AppliChem | A1067.0500 | |
Halt Proteinase inhibitor (100x) | ThermoFisher | 78430 | Caution. See manufactures MSDS |
IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | 18896-50ML | |
MgCl 1 M | Invitrogen | AM9530G | |
Micrococcal Nuclease (MNase) | Worthington | LS004798 | |
mouse embryonic stem cells | |||
NaCl | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index primers) | NEB | E7600S | amplification primers for sequencing libraries |
NEBNext Ultra II DNA library prep kit for Illumina | NEB | E7645L | sequencing library preparation kit |
NEBNext Ultra II Q5 Master mix | NEB | M0544S | Caution. See manufactures MSDS |
Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | 1x NEAA |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | 1% Pen-Strep |
Proteinase K (40 mg/ml) | GoldBio | P-480-1 | Caution. See manufactures MSDS |
QIAquick Gel extraction kit | QIAgen | 28706 | refered to as: DNA gel elution kit |
QIAquick PCR purification kit | QIAgen | 28106 | refered to as: commercial DNA purification kit |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32854 | high sensitivity DNA quantification instrument |
Quick load purple 1kb plus DNA Ladder | NEB | N0550S | |
SPRIselect size selection beads | Beckman Coulter | B23319 | paramagnetic beads |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000015 | refered to as: thermomixer |
Tris | Merck | 10708976001 | |
Trypsin | |||
Tween20 | Sigma Aldrich | P7949-100ML | |
Ultrapure 10% SDS | Invitrogen | 15553-035 | |
Ultrapure Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol (PCI) | Invitrogen | 15593-031 | |
Fragment Analyzer |