マウス脳からのシナプス成分の単離のための細胞内分画

マウスを用いたすべての実験は、イェール大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認され(プロトコル2021-11117)、実験動物ケア国際評価認定協会(AAALAC)によって認定された施設で実施されました。動物の世話と住居は、実験動物の世話と使用のためのガイド33 に準拠し、イェール動物リソースセンター(YARC)によって提供されました。動物は、食物と水への 自由アクセス を伴う12時間の明暗サイクルで維持されました。遺伝子型または状態ごとに5〜8匹のマウスまたは2〜4匹のラットが、以下のプロトコルに必要である。脳の容積が大きいため、必要なラットは少なくなります。同様に、実験動物の年齢は分数収量に影響を与える可能性があります。2ヶ月未満の年齢には追加のマウスが必要になる場合があります。.それ以外の場合、概説された手順は、マウス種とあらゆる年齢の健康な成体動物の両方に適用されます。この研究で提示された代表的なデータは、市販の情報源から入手した野生型(C57BL / 6J)マウス(年齢= 2か月、反復あたり4人の男性と4人の女性)を利用しました( 資料表を参照)。 1. 実験準備 注:このプロトコルは、1人の研究者が完了するのに~11時間かかります。該当する場合は、プロトコル実行の前日に、ベンチトップセットアップ(図1)、バッファーの準備(表1)、遠心分離機とローターの4°Cへの予冷、および必要な材料と機器の収集とラベル付け( 材料の表を参照)を完了することを強くお勧めします。 図1:ベンチトップのセットアップ。 脳解剖の前に、(A)ガラスホモジナイザーと(B)すべてのバッファーを氷上で冷やしました。(C)プロテアーゼ阻害剤原液を氷上で解凍した。遠心管用のウェットアイスの第2の容器、液体窒素のデュワー(図示せず)、および(D)液体窒素中で瞬間凍結したサンプルの短期保存用のドライアイスの容器を得た。(E)この手順中に遺伝子型または条件ごとに各細胞内画分サンプルの4つのアリコートが収集されたため、マイクロ遠心チューブはすべてのサンプルに対して事前にラベル付けされました(時間節約のヒント:実験が行われる前日にすべてのチューブに完全にラベルを付けます)。(F)適切なバイオハザード廃棄物容器、(G)70%エタノール、(H)手術器具、および(I)吸収性表面パッド。必要な遠心分離管および使い捨て品は、プロトコル実施中の効率的なアクセスのために確保された(図示せず)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 手術用のベンチトップを準備し、脳切除に必要なはさみと鉗子を収集します( 資料表を参照)。マウス尾部生検用の1.5 mL微量遠心チューブに事前にラベルを付け、 図2に概説されているように、採取した画分ごとに4本のチューブをラベル付けします。 ウェットアイスの容器2つ、ドライアイスの容器1つ、およびベンチトップ液体窒素デュワーフラスコを入手します。 フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)、ペプスタチンA、アプロチニン、およびロイペプチンストック溶液を氷上で解凍します( 材料の表を参照)。必要なバッファーを準備します (表 1)。注:ショ糖溶液は事前に調製し、4°Cで保存することができます。 ただし、プロテアーゼ阻害剤(解凍ストックおよび錠剤)は、水溶液中でこれらの試薬が不安定であるため、実験の開始時にすべてのバッファーに新鮮に添加する必要があります。さらに、すべてのバッファーは、無傷のシナプトソームの収集を可能にするために、洗剤を含まないガラス製品と洗剤を含まない水で調製する必要があります。 すべてのバッファーとガラスのダウンスホモジナイザー( 材料の表を参照)を氷上で冷やします。遠心分離機を4°Cに設定し、ローターを4°Cに冷却します。 14 mLのバッファーA(表1)を氷上のダウンスホモジナイザーに加えます。 表1:細胞内分画バッファーの組成。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 図2:細胞内分画プロトコルの概要。 細胞内分画工程および採取したサンプルの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 2.マウス脳切除 図3:頭蓋顔面解剖学 。 (A)関連する頭蓋構造が示されたマウス頭蓋骨の背側図。(B)マウスの頭蓋骨と脳の左側面図で、関連する頭蓋構造と解剖学的方向が示されています。破線は、切開を行う位置を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 オープンドロップ法34を使用して、ヒュームフードまたはバイオセーフティキャビネットにある麻酔室で各マウスを100%イソフルオランで深く麻酔します。頸椎脱臼によって各マウスを犠牲にし、その後迅速に斬首します。犠牲と解剖ごとに遺伝子型または実験グループを交互に行う12.安楽死後の尾生検は、遠位尾端2 mmを細かいハサミで切除して取得します。ジェノタイピングのために組織を保管してください。 断頭した頭部に70%エタノールをスプレーして、解剖中に髪が組織や手術器具に付着するのを防ぎます。 断頭切開部で皮膚の下に細かいハサミを頭蓋周囲の深さまで挿入し、鼻間縫合糸まで矢状中切開を行い(図3A)、頭皮を頭蓋骨から引っ込めます。 後頭部から各側頭に向かって作業し、筋膜と筋肉をトリミングして、各外部音響口を越えて頭蓋骨の外面を露出させます(図3B)。 利き手ではない手で頭蓋骨の頭皮と吻側の側面を固定します。もう一方では、脊髄が出ているのが見える大孔の尾側に2 mmの細かいはさみを挿入します。はさみが頭頂内骨の内面に到達するまで正中線を切開します(図3;破線)。注:最初の切開時には、脳幹と小脳の損傷を防ぐために、はさみが脊髄と平行で、頭蓋骨の内面に向かって圧力がかかる必要があります。 はさみの角度を変更して、ブレードが頭蓋骨の背側表面と平行になるようにします。矢状縫合糸と前頭間縫合糸をガイドとして使用して、頭頂骨と前頭骨を通して吻側方向に矢状切開を進み続けます。皮質への損傷を避けるために一定の上向きの圧力を使用してください。鼻間縫合糸のすぐ向こうの切開を終了します(図3A)。 鼻骨に小さな垂直切開(~3 mm)、鼻間縫合糸に対して吻側を、はさみを頭蓋骨に垂直に配置し、各ブレードを鼻上顎前縫合に配置し、1つを均等に切断します(図3;破線)。注:この手順により、頭蓋骨の収縮が容易になり、この領域が関心のある場合は嗅球を収集するために重要になります。 吻側を固定しながら、テクスチャー加工された鉗子の片側を使用して、頭蓋骨を脳からゆっくりと持ち上げ、次に横方向と腹側に持ち上げます。必要に応じて正中線に沿って繰り返し、次に脳表面全体が露出するまでもう一方の半球についても繰り返します。 湾曲した鉗子または細いへらを使用して、脳の吻側をそっと持ち上げます。視神経と脳神経を切断して、頭蓋骨からの切除を完了します。 各条件について、5〜8匹のマウスの脳を一緒に14 mLのバッファーAを含むチルドグラスDounceホモジナイザーに集めます(表1)。 3.シナプトソームの準備 メモ: この手順の回路図を 図 4 に示します。 図4:シナプトソーム調製。 工程3の概略図は、シナプトソーム(P2 ́)の生成である。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 ガラスDounceホモジナイザーを使用して、500rpm(合計)で12回のアップダウンパスで脳を均質化します。各ダウンストロークで短時間一時停止して、組織の完全な均質化を確実にします。加温やタンパク質の変性を避けるために、氷浴中で優先的に均質化します。ビシンコニン酸アッセイによるタンパク質濃度測定のために5 μLのアリコートを取ります(BCA、 材料表を参照)。ウェスタンブロット(WB)のために100 μLの全脳ライセートアリコートを取ります。このサンプルとそれに続くすべてのサンプル(図2)について、BCAには2つのアリコート、WBには2つのアリコートを取ります。採取したすべてのアリコートを液体窒素でフラッシュ凍結し、-80°Cで保存します。 全脳ホモジネートを高速丸底遠沈管(14mL)中で800 x gで4°Cで10分間回転させ、上清(S1)を得た。S1を新しい遠心チューブに移し、無傷の細胞と核を含むペレット(P1)を残します。ふわふわの、白い、ゆるい、表面的なペレットをピペッティングすることは避けてください。BCAの場合は2 x 5 μLのS1を、WBの場合は2 x 100 μLのS1を取ります。 S1を9,000 x g で4°Cで15分間スピンし、シナプトソーム上清(S2)および粗シナプトソームペレット(P2)を得た。BCAの場合は10 μLのS2を2 x、WBの場合はS2の500 μLを2 x 2します。アリコートを得た後、上清を捨て、ペレットで次のステップに進みます。 P2をプロテアーゼ阻害剤を含む3 mLの氷冷バッファーAに再懸濁し、9,000 x g で4°Cで15分間遠心分離して、上清(S2′)と洗浄シナプトソーム(P2′)を得ました。上清を捨て、ペレットを保管してください。 P2’を3 mLのバッファーAに再懸濁します。 主にミトコンドリアを含むペレットの底にある暗赤色の部分を再懸濁しないでください。BCAの場合は20 μLのP2’を2 x、WBの場合はP2 ‘を2 x 100 μL取ります。注:これは、ペレットの端と表面を穏やかにピペット混合して、ピペットチップをペレットの赤い中心から遠ざけながら、白く洗浄されたシナプトソームを再懸濁することによって達成できます。 4.低張性溶解 メモ: この手順の回路図を 図 5 に示します。 図5:低張性溶解。 工程4の概略図は、シナプトソームの低張溶解により、溶解上清(LS1)およびシナプトソーム膜画分(LP1)を生成する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 洗浄したシナプトソームの低張溶解のために、9容量の冷やしたバッファーB(表1)を再懸濁したP2′(~27 mL)に加えます。シナプトソームをガラス製ダウンスホモジナイザーでホモジナイズします(500 rpmで3回のアップダウンパス)。 サンプルを50 mLキャップ付きコニカル遠心チューブに移します。4°Cの冷蔵室でチューブリボルバーで15分間回転させます。 遠心分離機はP2 ‘を25,000 x gで4°Cで20分間溶解し、溶解上清(LS1)およびシナプトソーム膜を含む溶解ペレット(LP1)を得た。BCAの場合はLS1を2 x 50 μL、WBの場合はLS1を2 x 400 μL服用します。LS1を超遠心分離用のキャップ付き遠沈管に移します(材料表を参照)。 5.シナプス小胞の分離 メモ: この手順の回路図を 図 6 に示します。 図6:シナプス小胞の単離とシナプス原形質膜の単離。 (A)工程5の概略図、シナプス細胞質ゾル(LS2)およびシナプス小胞(LP2)画分の単離、および(B)工程6、スクロース勾配の超遠心分離後のミエリン(MF)、シナプス原形質膜(SPM)、およびミトコンドリア(Mito.)画分の生成。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 LS1を固定角度超遠心ローター( 材料の表を参照)で100,000 x g で4°Cで60分間遠心分離し、シナプス細胞質ゾル上清(LS2)およびシナプス小胞ペレット(LP2)を得た。LP2は小さく、半透明で、遠心管の側面に強く付着します。 LP2を500 μLのバッファーAに再懸濁します。 23 Gの針と1 mLのシリンジを使用して、穏やかな粉砕でLP2をせん断します。BCAの場合は10 μLのLP2を2 x、WBにはLP2 x 250 μLを取ります。 LS2(~30 mL)を10 kDaカットオフの遠心フィルターユニットに移します(材料表を参照)。注:10 kDa未満のタンパク質が対象である場合は、4 kDaカットオフ遠心フィルターユニットを使用できますが、スピン時間が長くなります。 LS2を5000 x g で4°Cで最大1時間回転させて、LS2を約0.5 mLまで濃縮します。 BCAには10 μLの濃縮LS2を2 x、WBには2 x 250 μLの濃縮LS2を取ります。スピンを開始したら、手順6.1に直接進みます。 6. シナプス原形質膜分離 LP1を1 mLのバッファーBに再懸濁します(ステップ4.3)(表1)。BCAには10 μLのLP1を2 x、WBにはLP1のLP1を2 x 50 μL摂取します。残りのLP1をバッファーBとバッファーCを使用して、最終容量7.5 mL、最終スクロース濃度1.1 Mに調整します(表1)。 再懸濁したLP17.5 mLを14 mL超遠心チューブに移します( 材料の表を参照)。LP1を3.75 mLのバッファーD(表1)で注意深く重ね合わせ、次に1.25 mLのバッファーA(または遠心管の上部のすぐ下に充填する大容量)を重層します。チューブの側面をピペッティングすると、スクロースグラジエント界面が乱れます。各スクロース画分を重ねた後、溶液の上部にペンで印を付けます。超遠心用のチューブを容量ではなく重量でバランスを取り、バッファーAを10 mg以内に滴下します。スイングバケット超遠心ローターで4°Cで2.5時間、48,000 x g で遠心分離します( 材料の表を参照)。 超遠心分離後のインタクトグラジエントの画像を取得して、各スクロース界面の区別と分画の成功を文書化します。 320 mMスクロース(バッファーA)の表面層を慎重に除去します。320 mM/855 mMのスクロース界面のミエリン画分(MF)を800 μLの容量で回収します。855 mM/1.1 Mショ糖界面のシナプス原形質膜(SPM)画分を1,000 μLの容量で回収します。各フラクションをチューブの壁から円形にピペットで持ち上げて、完全なフラクションを確実に収集します。残ったスクロースを注意深く吸引し、200 μLのバッファーBに再懸濁してミトコンドリアペレット(水戸)を回収します。BCAの場合はMFを2 x 100 μL、水戸の場合は2 x 10 μLを取ります。BCAの場合;MFと水戸の残りを分ける。WB用に半分のサンプル。 SPM画分を2容量のバッファーB(~2 mL)で希釈し、3.5 mL遠心チューブ( 材料表を参照)の固定角度ローターで25,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 上清を廃棄し、SPMペレットをバッファーAに再懸濁して、最終容量250 μLにします。BCA用に2 x 5 μLのSPMを取り、残りのSPMをWB用に半分に分割します。 BCAを実行して、可変アリコート量を考慮して各サンプルのタンパク質濃度を決定します。注:WB分析の場合、すべての細胞内画分の推奨作動タンパク質濃度は2 μg/μL(またはLS1およびMFで達成可能な高さ)です。