Subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein

Alle experimenten met muizen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Yale University (Protocol 2021-11117) en uitgevoerd in een faciliteit die is geaccrediteerd door de Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Dierenverzorging en huisvesting voldeden aan de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals33 en werden verstrekt door het Yale Animal Resource Center (YARC). Dieren werden gehouden in een 12 uur licht/donker cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Vijf tot acht muizen of twee tot vier ratten per genotype of aandoening zijn vereist voor het volgende protocol. Er zijn minder ratten nodig vanwege hun grotere hersenvolumes. Evenzo kan de leeftijd van de proefdieren van invloed zijn op de fractieopbrengst; extra muizen kunnen nodig zijn voor leeftijden jonger dan 2 maanden. Anders zijn de geschetste procedures van toepassing op zowel muizensoorten als gezonde volwassen dieren van elke leeftijd. De representatieve gegevens die in deze studie werden gepresenteerd, maakten gebruik van wildtype (C57BL / 6J) muizen (leeftijd = 2 maanden; vier mannetjes en vier vrouwtjes per replicaat) verkregen uit een commerciële bron (zie materiaaltabel). 1. Experimentele voorbereiding OPMERKING: Dit protocol vereist ~ 11 uur voor een enkele onderzoeker om te voltooien. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de benchtop-opstelling (figuur 1), buffervoorbereiding (tabel 1), het voorkoelen van centrifuges en rotors tot 4 °C en het verzamelen en etiketteren van benodigde materialen en apparatuur (zie materiaaltabel) de dag voorafgaand aan de uitvoering van het protocol, indien van toepassing, te voltooien. Figuur 1: Benchtop setup. Voorafgaand aan hersendissecties werden (A) Dounce-glashomogenisatoren en (B) alle buffers gekoeld op ijs. (C) Proteaseremmers werden op ijs ontdooid. Een tweede container met nat ijs voor centrifugebuizen, een Dewar van vloeibare stikstof (niet afgebeeld) en (D) een container met droogijs voor kortetermijnopslag van de monsters die in vloeibare stikstof zijn bevroren, werden verkregen. (E) Microcentrifugebuizen werden voor alle monsters vooraf gelabeld, aangezien tijdens deze procedure vier aliquots van elk subcellulair fractiemonster per genotype of toestand werden verzameld (tijdbesparende tip: label alle buizen grondig de dag voordat het experiment wordt uitgevoerd). (F) Een geschikte biohazard afvalcontainer, (G) 70% ethanol, (H) chirurgische hulpmiddelen en (I) een absorberend oppervlak pad. De benodigde centrifugebuizen en disposables werden gereserveerd voor efficiënte toegang tijdens de implementatie van het protocol (niet getoond). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Bereid de benchtop voor op een operatie en verzamel de schaar en tang die nodig zijn voor hersenexcisie (zie materiaaltabel). Pre-label 1,5 ml microcentrifugebuizen voor muizenstaartbiopten en vier buizen per verzamelde fractie, zoals aangegeven in figuur 2. Verkrijg twee containers nat ijs, een container met droogijs en een benchtop vloeibare stikstof Dewar-kolf. Ontdooi fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), pepstatine A, aprotinine en leupeptine stockoplossingen op ijs (zie Materiaaltabel). Bereid de nodige buffers voor (tabel 1).OPMERKING: Sucrose-oplossingen kunnen van tevoren worden bereid en bij 4 °C worden bewaard. Proteaseremmers (ontdooide voorraden en tabletten) moeten echter aan het begin van het experiment vers aan alle buffers worden toegevoegd vanwege de instabiliteit van deze reagentia in waterige oplossingen. Verder moeten alle buffers worden bereid met wasmiddelvrij glaswerk en wasmiddelvrij water om intacte synaptokosomen te kunnen verzamelen. Koel alle buffers en glazen Dounce homogenisatoren (zie Materiaaltabel) op ijs. Zet de centrifuges op 4 °C en koel de rotoren tot 4 °C. Voeg 14 ml buffer A (tabel 1) toe aan een douncehomogenisator op ijs. Tabel 1: Samenstelling van de subcellulaire fractioneringsbuffers. Klik hier om deze tabel te downloaden. Figuur 2: Overzicht van het subcellulaire fractioneringsprotocol. Samenvatting schema van de subcellulaire fractioneringsstappen en verzamelde monsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. Hersenexcisie van muizen Figuur 3: Craniofaciale anatomie. (A) Dorsale weergave van een muizenschedel met relevante schedelstructuren aangegeven. (B) Linker zijwaartse weergave van een muizenschedel en hersenen met relevante schedelstructuren en anatomische richtingen aangegeven. De stippellijnen vertegenwoordigen de locaties waar incisies moeten worden gemaakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Verdoof elke muis diep met 100% isofluoraan in een anesthesiekamer in een zuurkast of bioveiligheidskast met behulp van een open druppelmethode34. Offer elke muis op door cervicale wervelkolomdislocatie, snel gevolgd door onthoofding. Wissel af tussen genotypen of experimentele groepen voor elk offer en dissectie12. Verkrijg staartbiopten na euthanasie door 2 mm van de distale staartpunt met een fijne schaar uit te stoten. Bewaar het weefsel voor genotypering. Spray de onthoofde kop met 70% ethanol om te voorkomen dat het haar zich tijdens de dissectie aan het weefsel en chirurgische instrumenten hecht. Breng een fijne schaar onder de huid in bij de onthoofdingsincisie tot een pericraniale diepte en maak een midsagittale incisie tot aan de interne hechting (figuur 3A) om de hoofdhuid van de schedel terug te trekken. Werk vanuit het occipitale gebied naar elk temporeel aspect en trim de fascia en spier om het externe oppervlak van de schedel bloot te leggen voorbij elke externe akoestische meatus (figuur 3B). Beveilig de hoofdhuid en het rostrale aspect van de schedel met de niet-dominante hand. Plaats met de andere een fijne schaar 2 mm in de caudale kant van het foramen magnum, waar het ruggenmerg zichtbaar is. Maak een middellijnincisie totdat de schaar het interne oppervlak van het intrapariëtale bot bereikt (figuur 3; stippellijnen).OPMERKING: Tijdens de eerste incisie moet de schaar parallel zijn aan het ruggenmerg met druk op het interne oppervlak van de schedel om schade aan de hersenstam en het cerebellum te voorkomen. Verander de hoek van de schaar zodat de messen parallel lopen met het dorsale oppervlak van de schedel. Ga door met het rostrale bevorderen van de midsagittale incisie door de pariëtale en frontale botten, met behulp van de sagittale en interfrontale hechtingen als leidraad. Gebruik constante opwaartse druk om schade aan de cortex te voorkomen. Beëindig de incisie net voorbij de interne hechting (figuur 3A). Maak een kleine loodrechte incisie (~ 3 mm) op het neusbeen, rostral op de internasale hechting, door de schaar loodrecht op de schedel te plaatsen met elk mes op een nasale-premaxillaire hechting en maak er een gelijkmatige snede (figuur 3; stippellijnen).OPMERKING: Deze stap verhoogt het gemak van het intrekken van de schedel en is van cruciaal belang voor het verzamelen van de olfactorische bol als dit gebied van belang is. Gebruik tijdens het beveiligen van het rostrale aspect één kant van een paar getextureerde tangen om de schedel voorzichtig uit de hersenen op te tillen, vervolgens lateraal en ventraal. Herhaal dit langs de middellijn als dat nodig is, dan voor de andere hemisfeer totdat het hele hersenoppervlak is blootgesteld. Gebruik een gebogen tang of een fijne spatel om de rostrale kant van de hersenen voorzichtig op te tillen. Snijd de oog- en hersenzenuwen door om de excisie uit de schedel te voltooien. Verzamel voor elke aandoening vijf tot acht muizenhersenen samen in de gekoelde glazen Dounce-homogenisator met 14 ml buffer A (tabel 1). 3. Synasptosoompreparaat OPMERKING: De schema’s van deze procedure zijn weergegeven in figuur 4. Figuur 4: Synasptosoompreparaat. Schema van stap 3, het genereren van synaptokosomen (P2′). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Homogeniseer de hersenen met behulp van een glazen Dounce-homogenisator in 12 up-down passes bij 500 tpm (totaal). Pauzeer kort bij elke downstroke om een grondige homogenisatie van het weefsel te garanderen. Homogeniseer bij voorkeur in een ijsbad om opwarming en eiwitdenaturatie te voorkomen. Neem 5 μL aliquots voor de bepaling van de eiwitconcentratie door de bicinchonininezuurtest (BCA, zie materiaaltabel). Neem 100 μL hele hersenen lysaat aliquots voor western blot (WB). Neem voor deze en alle volgende monsters (figuur 2) twee aliquots voor BCA en twee aliquots voor WB. Bevries alle verzamelde aliquots in vloeibare stikstof en bewaar ze bij −80 °C. Draai het totale hersenhomogenaat in een snelle ronde bodemcentrifugebuis (14 ml) (zie materiaaltabel) op 800 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het supernatant (S1) te verkrijgen. Breng S1 over naar een nieuwe centrifugebuis en laat de pellet achter (P1), die intacte cellen en kernen bevat. Vermijd het pipetteren van de donzige, witte, losse, oppervlakkige pellet. Neem 2 x 5 μL S1 voor BCA en 2 x 100 μL S1 voor WB. Draai S1 bij 9.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om het synaptosomale supernatant (S2) en de ruwe synaptosoompellet (P2) te verkrijgen. Neem 2 x 10 μL S2 voor BCA en 2 x 500 μL S2 voor WB. Gooi het supernatant weg na het verkrijgen van aliquots en ga verder met de volgende stap met de pellet. Resuspensie P2 in 3 ml ijskoude buffer A met proteaseremmers en centrifugeer bij 9.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om het supernatant (S2′) en gewassen synaptosomen (P2′) te verkrijgen. Gooi het supernatant weg en bewaar de pellet. Resuspendeer P2′ in 3 ml buffer A. Vermijd resuspendatie van het donkerrode gedeelte op de bodem van de pellet, dat voornamelijk mitochondriën bevat. Neem 2 x 20 μL P2′ voor BCA en 2 x 100 μL P2′ voor WB.OPMERKING: Dit kan worden bereikt door de randen en het oppervlak van de pellet voorzichtig te pipet-mengen om de witgekalkte synaftosomen te resuspenderen terwijl de pipetpunt wegleidt van het rode midden van de pellet. 4. Hypotone lysis OPMERKING: De schema’s van deze procedure zijn weergegeven in figuur 5. Figuur 5: Hypotone lysis. Schematische van stap 4, de hypotone lysis van synaptosomen om het lysis-supernatant (LS1) en synaptosomale membraanfracties (LP1) te genereren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Voeg voor de hypotone lysis van gewassen synaposomen 9 volumes gekoelde buffer B (tabel 1) toe aan geresuspendeerde P2′ (~27 ml). Homogeniseer de synaptokosomen in een glazen Dounce-homogenisator (drie up-down passages bij 500 tpm). Breng de monsters over in conische centrifugebuizen met 50 ml. Draai ze op een buis revolver in een 4 °C koude ruimte gedurende 15 min. Centrifugeer P2′ bij 25.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om het lysissupernatant (LS1) en de lysispellet met synaptosomale membranen (LP1) te verkrijgen. Neem 2 x 50 μL LS1 voor BCA en 2 x 400 μL LS1 voor WB. Breng LS1 over in een afgedekte centrifugebuis voor ultracentrifugatie (zie Materiaaltabel). 5. Synaptische vesikel isolatie OPMERKING: De schema’s van deze procedure zijn weergegeven in figuur 6. Figuur 6: Synaptische vesikelisolatie en synaptische plasmamembraanisolatie. (A) Schematische van stap 5, de isolatie van synaptische cytosol (LS2) en synaptische blaasjes (LP2) fracties, en (B) stap 6, de generatie van myeline (MF), synaptisch plasmamembraan (SPM) en mitochondriale (Mito.) fracties na de ultracentrifugatie van sucrosegradiënten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Centrifugeer LS1 in een ultracentrifugerotor met vaste hoek (zie materiaaltabel) bij 100.000 x g gedurende 60 minuten bij 4 °C om synaptisch cytosolsupernatant (LS2) en synaptische blaasjespellet (LP2) te verkrijgen. LP2 is klein, doorschijnend en sterk gehecht aan de zijkant van de centrifugebuis. Resuspend LP2 in 500 μL buffer A. Met behulp van een naald van 23 G en een spuit van 1 ml schuift u LP2 af met zachte trituratie. Neem 2 x 10 μL LP2 voor BCA en 2 x 250 μL LP2 voor WB. Breng LS2 (~30 ml) over op centrifugale filtereenheden met een afsnijding van 10 kDa (zie materiaaltabel).OPMERKING: Als eiwitten kleiner dan 10 kDa van belang zijn, zijn 4 kDa cutoff centrifugaalfiltereenheden beschikbaar, maar dit zal resulteren in langere spintijden. Concentraat LS2 tot ongeveer 0,5 ml door te draaien bij 5000 x g gedurende maximaal 1 uur bij 4 °C. Neem 2 x 10 μL geconcentreerd ls2 voor BCA en 2 x 250 μl geconcentreerd ls2 voor wb. Nadat u de spin hebt gestart, gaat u direct verder met stap 6.1. 6. Synaptische plasmamembraanisolatie Resuspendeer LP1 (stap 4.3) in 1 ml buffer B (tabel 1). Neem 2 x 10 μL LP1 voor BCA en 2 x 50 μL LP1 voor WB. Stel de resterende LP1 in op een eindvolume van 7,5 ml en een uiteindelijke sucroseconcentratie van 1,1 M met buffer B en buffer C (tabel 1). Breng 7,5 ml geresuspendeerde LP1 over in een ultracentrifugebuis van 14 ml (zie materiaaltabel). Leg LP1 voorzichtig overlay met 3,75 ml buffer D (tabel 1) en leg vervolgens over met 1,25 ml buffer A (of een groter volume om net onder de bovenkant van de centrifugebuis te vullen). Vermijd pipetteren langs de zijkant van de buis, die de sucrose gradiënt interfaces zal verstoren. Nadat u elke sucrosefractie hebt bedekt, markeert u de bovenkant van de oplossing met een pen. Balanceer de buizen voor ultracentrifugatie op gewicht, niet volume, met de druppelsgewijze toevoeging van buffer A tot binnen 10 mg. Centrifugeer bij 48.000 x g gedurende 2,5 uur bij 4 °C in een ultracentrifugerotor met zwenkbare emmer (zie Materiaaltabel). Verkrijg afbeeldingen van de intacte gradiënten na ultracentrifugatie om de onderscheidendheid van elke sucrose-interface en het succes van fractionering te documenteren. Verwijder voorzichtig de oppervlakkige laag van 320 mM sucrose (Buffer A). Herstel de myelinefractie (MF) op de sucrose-interface van 320 mM/855 mM in een volume van 800 μL. Herstel de synaptische plasmamembraanfractie (SPM) op de sucrose-interface van 855 mM/1,1 M in een volume van 1.000 μL. Pipetteer elke fractie op een cirkelvormige manier uit de wand van de buis om ervoor te zorgen dat de volledige fractie wordt verzameld. Zuig de resterende sucrose voorzichtig af en win de mitochondriale pellet (Mito.) terug door 200 μL buffer B te resuspenderen. Neem 2 x 100 μL MF voor BCA en 2 x 10 μL Mito. voor BCA; verdeel de rest van MF en Mito. monsters in tweeën voor WB. Verdun de SPM-fractie met 2 volumes buffer B (~ 2 ml) en centrifugeer vervolgens in een rotor met vaste hoek in een centrifugebuis van 3,5 ml (zie materiaaltabel) bij 25.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de SPM-pellet in buffer A voor een eindvolume van 250 μL. Neem 2 x 5 μL SPM voor BCA en verdeel de resterende SPM in tweeën voor WB. Voer een BCA uit om de eiwitconcentratie van elk monster te bepalen, rekening houdend met variabel aliquotvolume.OPMERKING: Voor WB-analyse is de voorgestelde werkeiwitconcentratie voor alle subcellulaire fracties 2 μg / μL (of zo hoog als haalbaar voor LS1 en MF).