التجزئة تحت الخلوية لعزل المكونات المتشابكة من دماغ الفئران
Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة قوية ومفصلة للحصول على تشابك عصبي عالي النقاء ، وحويصلات متشابكة ، وكسور متشابكة أخرى من دماغ الفأر. تتيح هذه الطريقة تقييم العمليات المشبكية ، بما في ذلك التحليل الكيميائي الحيوي لتوطين البروتين ووظيفته بدقة مجزأة.
Abstract
المحطات المشبكية هي المواقع الرئيسية للاتصال العصبي. الخلل الوظيفي المشبكي هو السمة المميزة للعديد من الاضطرابات العصبية والنفسية والعصبية. وبالتالي ، فإن توصيف الأجزاء الفرعية المشبكية عن طريق العزل الكيميائي الحيوي هو طريقة قوية لتوضيح القواعد الجزيئية للعمليات المشبكية ، سواء في الصحة أو المرض. يصف هذا البروتوكول عزل المحطات المشبكية والمقصورات الفرعية المشبكية من أدمغة الفئران عن طريق التجزئة تحت الخلوية. أولا ، يتم عزل الهياكل الطرفية المشبكية المختومة ، والمعروفة باسم المشابك العصبية ، بعد تجانس أنسجة المخ. المشبك العصبي عبارة عن مقصورات عصبية قبل وبعد مشبكي مع أغشية مقروصة ومختومة. تحتفظ هذه الهياكل بحالة نشطة أيضيا وهي ذات قيمة لدراسة التركيب والوظيفة المشبكية. ثم تخضع الجيبتوسومات لتحلل منخفض التوتر وطرد مركزي فائق للحصول على مقصورات فرعية متشابكة غنية للحويصلات المشبكية ، والعصارة الخلوية المشبكية ، وغشاء البلازما المشبكي. يتم تأكيد نقاء الكسر عن طريق الفحص المجهري الإلكتروني وتحليل التخصيب الكيميائي الحيوي للبروتينات الخاصة بالمقصورات شبه المشبكية. الطريقة المقدمة هي أداة مباشرة وقيمة لدراسة الخصائص الهيكلية والوظيفية للمشابك والمسببات الجزيئية لاضطرابات الدماغ المختلفة.
Introduction
نقاط الاشتباك العصبي هي الوحدات الحسابية الأساسية للدماغ التي تتواصل من خلالها الخلايا العصبية وتمارس وظائف متنوعة ومعقدة بشكل رائع. وبالتالي ، فإن نقاط الاشتباك العصبي أساسية لصحة الدماغ1 ؛ الخلل الوظيفي المشبكي متورط كمصدر أو نتيجة للعديد من الاضطرابات2. تتكون نقاط الاشتباك العصبي من أطراف قبل وبعد المشبكي ، وهي امتدادات لخليتين عصبيتين مختلفتين يتم وضعهما بشكل وثيق وفصلهما عن طريق شق متشابك تجتازه جزيئات الالتصاق المشبكية. تتدفق المعلومات من حجرة ما قبل المشبكي إلى ما بعده في شكل رسل كيميائي يسمى الناقلات العصبية1. العمليات الجزيئية المشاركة في النقل العصبي هي مجالات نشطة للبحث3،4،5. يعد فهم العمليات المسببة للأمراض داخل المحطات المشبكية واستجابة نقاط الاشتباك العصبي للأمراض في المقصورات الفرعية العصبية الأخرى خطوات حاسمة لمعالجة اضطرابات الدماغ 1,2. العديد من التطورات المنهجية ، المطبقة في الغالب على نماذج الفئران ، قد عززت هذا السعي6. إن عزل الكسور المشبكية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي هو أحد طرق تغيير النموذج التي مكنت من التقييم التفصيلي للعمليات المشبكية في الصحة والمرض.
يتكون الدماغ البشري البالغ من 80-90 مليار خلية عصبية 7,8. من بين أنواع الفئران ، يحتوي دماغ الفئران على ما يقرب من ~ 200 مليون خلية عصبية ، بينما تحتوي الفئران على ~ 70 مليون 9,10. تشكل كل خلية عصبية الآلاف من الوصلات المشبكية المحددة مع شبكة من الخلايا العصبية شديدة الاستقطاب المخلوطة بالخلايا الدبقية والأوعية الدموية الكثيفة. في مثل هذه الأنسجة المعقدة وغير المتجانسة ، كان من غير المعقول عزل ودراسة نقاط الاشتباك العصبي كنظام مستقل. في 1960s ، جعل فيكتور ويتاكر ، كاثرين هيب ، وآخرون هذا ممكنا عن طريق عزل المحطات المشبكية السليمة باستخدام التجزئة تحت الخلوية11،12،13،14. في محاولة لعزل الحويصلات المشبكية (SVs) ، قاموا بتجانس الأدمغة من خلال قوة القص السائل في السكروز متساوي التناضح (0.32 M) متبوعا بالطرد المركزي الفائق. لقد حصلوا على أطراف عصبية أو دوالي مقروصة أو مغلقة بغشاء البلازما ، والتي أطلقوا عليها اسم الجسيمات العصبية (NEPs)11,13. نظرا للحفاظ على الخصائص الهيكلية والوظيفية للمشبك في هذه الهياكل ، فقد أطلق على NEPs لاحقا اسم “synaptosomes” للتطابق مع العضيات تحت الخلوية الأخرى13,15. تجدر الإشارة إلى أن عمل إدواردو دي روبرتيس وزملائه ، الذين صاغوا مصطلح “الحويصلة المشبكية” ، تداخل مع عمل ويتاكر وزملائه وساهم في التحقق من صحة عزل وتوصيف “المشبك”16،17،18.
Synaptosomes هي هياكل نشطة من الناحية الفسيولوجية تحتوي على جميع الخصائص الخلوية والجزيئية اللازمة لتخزين وإطلاق وإعادة امتصاص الناقلات العصبية13,18. يساهم الحفاظ على الخصائص المشبكية الرئيسية في المختبر والتحرر من المكونات غير المشبكية أيضا في فائدة طريقة العزل هذه. ساهمت السينابتوسومات بشكل كبير في فهم الخصائص الكيميائية والفسيولوجية للنقل العصبي ويتم استخدامها الآن لدراسة العمليات الجزيئية المشبكية وتغييراتها في المرض19،20،21،22،23. Synaptosomes هي أيضا مادة المصدر الأولية لعزل المكونات المشبكية مثل SVs ، والحويصلات المغلفة بالكلثرين (CCVs) ، والعصارة الخلوية المشبكية ، وغشاء البلازما المشبكي ، والميتوكوندريا المشبكية ، وجزيئات الالتصاق المشبكي ، والمكونات الأخرى ذات الأهمية ، والتي يمكن أن تسهل فهم الآليات الجزيئية للوظيفة المشبكية18،19،20،24،25،26 ، 27,28. يمكن الحصول على هذه المكونات شبه المشبكية عن طريق التحلل التناضحي للتشابك العصبي والطرد المركزي الفائق المتدرجلكثافة السكروز 15,29. على الرغم من أن طريقة التجزئة تحت الخلوية الأصلية من قبل مجموعة أبحاث ويتاكر معروفة بأنها فعالة في عزل المشبك العصبي عالي الجودة و SVs13،30 ، إلا أن التحسينات الحديثة تعزز نقاء الكسور تحت الخلوية 22،23،31،32. توفر هذه المقالة نسخة مفصلة للغاية ويمكن الوصول إليها من بروتوكول كلاسيكي للتجزئة تحت الخلوية لأنسجة دماغ الفئران لعزل التشابك العصبي و SVs والمكونات شبه المشبكية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
في دراساتهم الأساسية ، استخدم ويتاكر وزملاؤه أربعة معايير مورفولوجية لتحديد المشابك العصبية: (1) الهياكل لها غشاء بلازما مختوم. (2) تحتوي الهياكل على SVs تشبه تلك الموجودة في النهايات العصبية والدوالي في الموقع من حيث الحجم والعدد ؛ (3) تحتوي الهياكل على واحد أو أكثر من الميتوكوندريا الصغيرة ؛ و (4) غالبا ما يتم الالتزام بالغشاء قبل المشبكي بمكون ما بعد المشبكي11،12،13. على الرغم من أن المعيارين الأولين ينطبقان بشكل عام على كل طريقة عزل ، في أحدث البروتوكولات الموضحة في هذه المقالة ، لن تحتوي جميع التفاعلات الناتجة على الميتوكوندريا ومحطات ما بعد المشبكية المرفقة. ما يقرب من 60 ٪ من المشابك سيكون لها الميتوكوندريا ، ويقدر أن ما يصل إلى 15 ٪ فقط قد تعلق محطات ما بعد المشبكي37. إذا كانت مكونات ما بعد المشبكي ذات أهمية خاصة ، فمن المعروف أن استخدام مخزن التجانس الشبيه ب Krebs متساوي التوتر وترشيح الضغط للتخصيب ينتج تركيزات عالية من synaptosomes مع أطراف ما بعد المشبكي (تسمى أيضا synaptoneurosomes)22،38.
يمكن أن تؤثر طريقة التضحية بالحيوان على جودة التشابك العصبي والجزئيات المشبكية. الحيوانات البالغة التي يتم التضحية بها باستخدام طريقة القتل الرحيم التي لا تتطلب التخدير ستؤدي إلى أفضل جودة للكسر. علاوة على ذلك ، يجب تشريح الأدمغة حديثا ، وليس تجميدها ، وتجانسها باستخدام نسبة 1:10 من مخزن التجانس (الوزن / الحجم) للكسور المشبكية الأكثر قابلية للحياة22. يحتوي الدماغ على مجموعة غير متجانسة من نقاط الاشتباك العصبي التي يمكن تمييزها حسب نوع الناقلات العصبية التي تحملها. لا يتأثر تكوين المشبك بشكل عام بنوع المشبك العصبي أو محتوى الناقل العصبي13. الاستثناء هو الألياف المطحونة في المخيخ ، والتي من المعروف أنها تتعطل في الظروف المثلى للحصول على المشابك العصبية من بقية الدماغ39,40. وبالتالي ، يوصى بإزالة المخيخ قبل تجانس الدماغ إذا كان استبعاد هذه المنطقة لا يؤثر على الهدف التجريبي. إذا كنت مهتما بعزل التشابك العصبي لشخصية ناقل عصبي معين ، فيمكن أولا عزل مناطق الدماغ المخصب للخلايا العصبية التي تحتوي على الناقل العصبي محل الاهتمام. ومع ذلك ، فإن هذا النهج سيفرض قيودا على عائد الكسر النهائي ، اعتمادا على حجم المنطقة محل الاهتمام (وبالتالي ، فإن عمر الحيوانات هو أيضا اعتبار). هناك طرق مناعية لعزل المشابك العصبية الخاصة بالناقل العصبي ، ولكن سيتم اختراق الجدوى والعائد بشكل كبير22. إذا كان تقييم الجدوى الأيضية للمتشابكة أمرا مهما ، فيمكن استخدام قياس إطلاق الناقل العصبي 41,42 أو بعض المقايسات الأنزيمية43.
تشمل الملوثات الشائعة في مستحضرات المشبك الميكروسومات والميتوكوندريا الحرة و SVs والأغشية العصبية والدبقية. يمكن تقليل التلوث عن طريق زيادة عدد عمليات الغسيل في الكسور P1 و P222 وتجنب إعادة تعليق حبيبات الميتوكوندريا الحمراء في الخطوات اللاحقة. في التجارب التي تكون فيها قابلية التمثيل الغذائي والوقت أمرا بالغ الأهمية ، فإن تقليل عدد عمليات الغسل واستخدام تدرجات Ficoll أو Percoll على تدرجات السكروز سيكون مفيدا44،45،46. هذه الطرق أيضا تقلل التلوث بشكل كبير. أسفر بروتوكول ويتاكر الأصلي عن SVs عالية الجودة. مزيد من التحسين بواسطة Nagy et al.23 ، المتضمن في هذه الطريقة ، ينتج SVs بتجانس ونقاء ملحوظين دون المساومة بشكل كبير على المحصول36. إذا كانت أنواع فرعية معينة من SV ذات أهمية ، مثل الجلوتاماترجيك (المحتوي على VGLUT-1) أو GABAergic (المحتوية على VGAT-1) SVs ، فيمكن إجراء العزل المناعي باستخدام أجسام مضادة محددة47,48. تتوفر أيضا طرق بديلة لعزل CCVs عن التشابك العصبي ، والتي ، بسبب الكثافة التفاضلية ، قد لا تكون موجودة في نفس الواجهة مثل SVs التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة20،49،50.
بشكل عام ، يمكن تحسين البروتوكول الحالي لعزل المكونات المشبكية للحصول على كسور ذات تجانس وقابلية أفضل بناء على جودة وكمية أنسجة المخ المصدر والأهداف التجريبية. لمزيد من تفاصيل استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، ينبغي للمرء الرجوع إلى فصول كتاب Dunkley و Robinson22 و Ganzella et al.36.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر P. Colosi على إعداد صورة EM. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 NS064963, SSC; R01 NS110354 ، SSC ؛ R01 NS083846 ، SSC ؛ R21 NS094971 ، SSC ؛ T32 NS007224 ، SMT ؛ T32 NS041228, SMT)، وزارة الدفاع الأمريكية (W81XWH-17-1-0564, SSC; W81XWH-19-1-0264 ، VDJ) ، مواءمة العلوم عبر شبكة الأبحاث التعاونية لمرض باركنسون (ASAP) ، وبرنامج النهوض بالهدف لمؤسسة مايكل جيه فوكس (MJFF-020160 ، SSC و VDJ). أنشأنا رسوما توضيحية رسومية باستخدام BioRender.com.
Materials
| 1 mL TB Syringe | BD | 309649 | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | |
| 14 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube | Beckman Coulter | 344060 | Compatible with SW 40 Ti |
| 23 Gauge Precision Glide Hypodermic Needle | BD | 305145 | |
| 26.3 mL, Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | Compatible with Ti70 |
| 3.5 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube | Beckman Coulter | 349623 | Compatible with TLA-100.3 |
| 50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901024 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | 1 mg/mL in diH2O |
| Avanti J-26 XP Centrifuge | Beckman Coulter | B22984 | <26,000 rpm |
| Benchtop HDPE Dewar Flask | Thermo Scientific | 5028U19 | |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Labs | 000664 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | EP022628168 | <14,000 rpm |
| complete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11873580001 | Add 1 tablet per 50 mL of solution |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
| Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 8r | |
| Glas-Col Tissue Homogenizing System | Cole-Parmer | UX-04369-15 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 3117-0500 | Compatible with JA20 |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
| JA-20 Rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Leupeptin | American Bio | AB01108 | 1 mg/mL in diH2O |
| N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | American Bio | AB00892 | |
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <100,000 rpm | |
| Optima TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <120,000 rpm | |
| Pepstatin A | Thermo Scientific | 78436 | 1 mg/mL in DMSO |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | American Bio | AB01620 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23335 | For determination of protein concentration |
| Pipette Tips | |||
| Serological Pipettes | |||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| SW 40 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
| Teflon-Coated Pestle and Mortar Tissue Grinder | Thomas Scientific | 3431D94 | |
| Ti70 Rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| TLA-100.3 Rotor | Beckman Coulter | 349490 | |
| Tube Revolver | Dot Scientific | DTR-02VS |
References
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J., Education, A. J. Synaptic Transmission. Principles of Neural Science, Fifth Edition. , (2014).
- Lepeta, K., et al. Synaptopathies: synaptic dysfunction in neurological disorders – A review from students to students. Journal of Neurochemistry. 138 (6), 785-805 (2016).
- Südhof, T. C., Malenka, R. C. Understanding synapses: Past, present, and future. Neuron. 60 (3), 469-476 (2008).
- Südhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12696-12717 (2014).
- Jahn, R., Boyken, J., Pfaff, D. W. Molecular Regulation of Synaptic Release. Neuroscience in the 21st Century: From Basic to Clinical. , 351-401 (2013).
- Xiong, H., Gendelman, H. E. . Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , (2014).
- Azevedo, F. A., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 10661-10668 (2012).
- Herculano-Houzel, S., Lent, R. Isotropic fractionator: A simple, rapid method for the quantification of total cell and neuron numbers in the brain. Journal of Neuroscience. 25 (10), 2518-2521 (2005).
- Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. Journal of Anatomy. 96, 79-88 (1962).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of synaptic vesicles from the central nervous system. Journal of Physiology. 153, 35-37 (1960).
- Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. Journal of Neurocytology. 22 (9), 735-742 (1993).
- Jahn, R., Fasshauer, D. Molecular machines governing exocytosis of synaptic vesicles. Nature. 490, 201-207 (2012).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles (‘synaptosomes). Biochemical Journal. 90 (2), 293-303 (1964).
- De Robertis, E., Rodriguez De Lores Arnaiz, G., Pellegrino De Iraldi, A. Isolation of synaptic vesicles from nerve endings of the rat brain. Nature. 194, 794-795 (1962).
- De Robertis, E., Pellegrino De Iraldi, A., Rodriguez, G., Gomez, C. J. On the isolation of nerve endings and synaptic vesicles. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (1), 229-235 (1961).
- Zimmermann, H., Whittaker, V. P., Murphy, K. M. The Discovery of the Synaptosome and Its Implications. Synaptosomes. , 9-26 (2018).
- Gorenberg, E. L., et al. Identification of substrates of palmitoyl protein thioesterase 1 highlights roles of depalmitoylation in disulfide bond formation and synaptic function. PLoS Biology. 20 (3), 3001590 (2022).
- Vidyadhara, D. J., et al. Dopamine transporter and synaptic vesicle sorting defects initiate auxilin-linked Parkinson’s disease. bioRxiv. , (2022).
- Schrimpf, S. P., et al. Proteomic analysis of synaptosomes using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Proteomics. 5 (10), 2531-2541 (2005).
- Dunkley, P. R., Robinson, P. J., Murphy, K. M. Synaptosome Preparations: Which Procedure Should I Use. Synaptosomes. , 27-53 (2018).
- Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Research. 109 (2), 285-309 (1976).
- Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127 (4), 831-846 (2006).
- Wagner, J. A., Kelly, R. B. Topological organization of proteins in an intracellular secretory organelle: the synaptic vesicle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (8), 4126-4130 (1979).
- Jahn, R., Schiebler, W., Ouimet, C., Greengard, P. A 38,000-dalton membrane protein (p38) present in synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (12), 4137-4141 (1985).
- Binotti, B., Jahn, R., Pérez-Lara, &. #. 1. 9. 3. ;. An overview of the synaptic vesicle lipid composition. Archives of Biochemistry and Biophysics. 709, 108966 (2021).
- Siegel, D. P., Ware, B. R. Electrokinetic properties of synaptic vesicles and synaptosomal membranes. Biophysical Journal. 30 (1), 159-172 (1980).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from disrupted nervending particles. Biochemical Pharmacology. 12 (3), 300-302 (1963).
- Clementi, F., Whittaker, V. P., Sheridan, M. N. The yield of synaptosomes from the cerebral cortex of guinea pigs estimated by a polystyrene bead "tagging" procedure. Zeitschrift für Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 72, 126-138 (1966).
- Carlson, S. S., Wagner, J. A., Kelly, R. B. Purification of synaptic vesicles from elasmobranch electric organ and the use of biophysical criteria to demonstrate purity. Biochemistry. 17 (7), 1188-1199 (1978).
- Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. Journal of Cell Biology. 96 (5), 1374-1388 (1983).
- Hawkins, P., et al. A guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory animals: eleventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Laboratory Animals. 45 (1), 1-13 (2011).
- Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Canadian Veterinary Journal. 53 (3), 299-302 (2012).
- Deutsch, C., Drown, C., Rafalowska, U., Silver, I. A. Synaptosomes from rat brain: Morphology, compartmentation, and transmembrane pH and electrical gradients. Journal of Neurochemistry. 36 (6), 2063-2072 (1981).
- Ganzella, M., Ninov, M., Riedel, D., Jahn, R. Isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Methods in Molecular Biology. 2417, 131-145 (2022).
- Dunkley, P. R., et al. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Research. 441 (1-2), 59-71 (1988).
- Schwartz, R. D., Skolnick, P., Hollingsworth, E. B., Paul, S. M. Barbiturate and picrotoxin-sensitive chloride efflux in rat cerebral cortical synaptoneurosomes. FEBS Letters. 175 (1), 193-196 (1984).
- Pittaluga, A., Thellung, S., Maura, G., Raiteri, M. Characterization of two central AMPA-preferring receptors having distinct location, function and pharmacology. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 349 (6), 555-558 (1994).
- Israël, M., Whittaker, V. P. The isolation of mossy fibre endings from the granular layer of the cerebellar cortex. Experientia. 21 (6), 325-326 (1965).
- Khvotchev, M., Lonart, G., Südhof, T. C. Role of calcium in neurotransmitter release evoked by alpha-latrotoxin or hypertonic sucrose. Neuroscience. 101 (3), 793-802 (2000).
- Lonart, G., Janz, R., Johnson, K. M., Südhof, T. C. Mechanism of action of rab3A in mossy fiber LTP. Neuron. 21 (5), 1141-1150 (1998).
- Nicholls, D. G., Sihra, T. S. Synaptosomes possess an exocytotic pool of glutamate. Nature. 321 (6072), 772-773 (1986).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nature Protocols. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Cotman, C. W., Matthews, D. A. Synaptic plasma membranes from rat brain synaptosomes: Isolation and partial characterization. Biochimica et Biophysica Acta. 249 (2), 380-394 (1971).
- Booth, R. F., Clark, J. B. A rapid method for the preparation of relatively pure metabolically competent synaptosomes from rat brain. Biochemical Journal. 176 (2), 365-370 (1978).
- Takamori, S., Riedel, D., Jahn, R. Immunoisolation of GABA-specific synaptic vesicles defines a functionally distinct subset of synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 20 (3), 4904-4911 (2000).
- Burger, P. M., et al. Synaptic vesicles immunoisolated from rat cerebral cortex contain high levels of glutamate. Neuron. 3 (6), 715-720 (1989).
- Blondeau, F., et al. Tandem MS analysis of brain clathrin-coated vesicles reveals their critical involvement in synaptic vesicle recycling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3833-3838 (2004).
- Maycox, P. R., Link, E., Reetz, A., Morris, S. A., Jahn, R. Clathrin-coated vesicles in nervous tissue are involved primarily in synaptic vesicle recycling. Journal of Cell Biology. 118 (6), 1379-1388 (1992).
