Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme
Summary
Bu çalışmanın amacı, primer insan T hücrelerini izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için yüzdürme bazlı ayırmanın fizibilitesini göstermektir.
Abstract
T hücrelerini ex vivo kültürler oluşturmak için periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC’ler) izole etme süreci, araştırma, klinik testler ve hücre bazlı tedaviler için çok önemlidir. Bu çalışmada, PBMC’lerden T hücrelerini ex vivo olarak izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için basit, yeni bir protokol sunulmuştur. Bu çalışma, T hücrelerini izole etmek ve aktive etmek için işlevselleştirilmiş yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) teknolojisini kullanmaktadır. Kısaca, protokol, lökopak türevi PBMC’lerden CD3 + hücrelerinin pozitif seçimini içerir, ardından 24 delikli plakalarda transdüksiyondan önce önceden konjuge anti-CD28’e bağlı streptavidin mikrokabarcıkları (SAMB’ler) ile 48 saatlik bir birlikte stimülasyon yapılır. İşlevselleştirilmiş mikro kabarcıklar, hücreleri yüzdürücü bir şekilde aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunarak, minimum tükenme ile genişlemeye izin veren proliferatif fenotiplere yol açar. Bu teknik, yardımcı uyarıcı mikro kabarcıklar yüzer kalır ve kültür ortamının tepesine geri döner, böylece genişleyen hücrelerin birlikte uyarıcı faktörlerle temas halinde olduğu süreyi azaltır. Sonuçlar, izole edilmiş ve kültürlenmiş T hücrelerinin aktive etmek ve çoğalmak için yeterli stimülasyon aldığını, ancak aşırı PD-1’in varlığının gösterdiği gibi aşırı aktivasyona yol açacak ölçüde değil, daha sonra tükenmeye yol açtığını göstermektedir.
Introduction
Şu anda dünya çapında 500’den fazla kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücre tedavisi klinik çalışması yürütülmektedir ve piyasada dört CAR-T hücre tedavisi ürünü bulunmaktadır1. Bununla birlikte, bu potansiyel olarak iyileştirici tedavilerin etkinliğini, ölçeklenebilirliğini ve uzun vadeli başarısını artırmak için ele alınması gereken çok sayıda CAR-T hücre araştırması ve üretim ihtiyacı hala mevcuttur 2,3,4,5. Evlat edinilmiş CAR-T hücresi klinik araştırması ve üretimi, periferik bir kan örneğinden T hücresi izolasyonu ve ardından izole hücrelerin uyarılması, transdüksiyonu ve genişlemesi ile başlar. T hücresi geri kazanımı, saflık ve aktivasyon / tükenme sinyalleri gibi parametreler, CAR-T hücre araştırması ve üretimi için hücre izolasyonu ve stimülasyon tekniklerini seçerken dikkatli bir şekilde dikkate alınmalıdır 3,4,6. Önemli olarak, terapötik etkinliği arttırmak için T hücresi tükenmesi gibi mevcut üretim süreçlerinden kaynaklanan biyolojik engelleri en aza indirgeyerek CAR-T hücre tedavilerinin terapötik kalıcılığında iyileşme gereklidir 6,7.
Floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve manyetik aktive hücre sıralama (MACS) gibi geleneksel hücre izolasyon yöntemlerine alternatif olarak, burada, T hücresi izolasyonu için mikro kabarcıklarla yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) gösterilmektedir. Mikrokabarcık ayırma, hedefleri bağlamak ve bunları sıvı numunelerinin yüzeyine yüzdürmek için yüzdürücü, içi boş mikrosferler (mikro kabarcıklar) kullanır 8,9. Mikrokabarcıkları antikorlarla (yani anti-CD3) işlevselleştirerek, istenen T hücresi popülasyonları periferik kan örneklerinden pozitif olarak seçilebilir. Daha sonra, süspansiyonda pozitif seçilmiş T hücrelerini birlikte uyarmak ve aktive etmek için farklı bir antikor işlevselleştirilmiş mikrokabarcık popülasyonunun (yani, anti-CD28) kullanımı bu çalışmada gösterilmiştir. Mikrokabarcıklar, askıya alınmış hücre kültürü ve genetik modifikasyon ve genişleme gibi aşağı akış uygulamaları için hazır T hücreleri üreten basit ve oldukça ayarlanabilir bir izolasyon ve aktivasyon iş akışı sunar. Kritik olarak, mikro kabarcıklarla yüzdürücü hücre aktivasyonu, aşırı T hücresi tükenmesini önlemek için kısıtlanmış hücre stimülasyonunu teşvik eder7.
Bu çalışma için, akış sitometrisi, işlevselleştirilmiş mikrokabarcıkların izolasyon, aktivasyon ve transdüksiyon başarısını analiz etmek ve transdüksiyon sonrası büyüme ve genişleme aşamalarında mevcut olan spesifik alt popülasyonlar hakkında ayrıntılı bilgi sağlamak için kullanılan birincil araçtır. Akım sitometrisine ek olarak, hücre sağlığını, morfolojisini ve transdüksiyon başarısını doğrulamak için parlak alan ve floresan mikroskobu kullanıldı. Bu sonuçlara dayanarak, mikrokabarcık teknolojisi ve protokolü, günümüzde kullanılmakta olan geleneksel izolasyon ve aktivasyon yöntemlerine daha ayarlanabilir ve daha yumuşak bir alternatif sunmaktadır; Özellikle, mikrokabarcıkla aktive olmuş hücreler, T hücresi tükenme belirteçlerinin ekspresyonunu, endüstri standardı aletler ve kitlerle tipik olarak gözlemlenenden önemli ölçüde daha düşük gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tanımlanan protokol, PBMC örneklerinden T hücrelerinin izolasyonuna ve mikrokabarcıklarla kültür ortamındaki askıya alınmış T hücrelerinin aktivasyonuna izin verir. Bu yöntem, doğal kaldırma kuvveti hücrelere eş-uyarıcı sinyaller vermek ve bir kültür ortamında askıya alınırken bunları aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunan işlevselleştirilmiş mikro kabarcıklara dayanır, böylece genişleyen hücrelerin uzun süreli stimülasyona maruz kalmasını azaltır; Bu tür aşırı uyarım, T h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiç kimse.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
- Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
- Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
- Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
- Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
- Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
- Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , (2022).
- McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , (2018).
- Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
- Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
- Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).
