Aislamiento, activación y expansión de células T basadas en flotación a partir de muestras de células mononucleares de sangre periférica humana utilizando microburbujas
Summary
El objetivo de este estudio es demostrar la viabilidad de la separación basada en flotación para aislar, activar y expandir las células T humanas primarias.
Abstract
El proceso de aislamiento de células T de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para establecer cultivos ex vivo es crucial para la investigación, las pruebas clínicas y las terapias basadas en células. En este estudio, se presenta un protocolo simple y novedoso para aislar, activar y expandir las células T de PBMC ex vivo . Este estudio utiliza la tecnología de clasificación celular activada por flotabilidad funcionalizada (BACS) para aislar y activar las células T. Brevemente, el protocolo implica la selección positiva de células CD3 + de PBMC derivadas de leukopak, seguida de una coestimulación de 48 h con microburbujas de estreptavidina (SAMB) anti-CD28 unidas a CD28 antes de la transducción en placas de 24 pocillos. Las microburbujas funcionalizadas ofrecen una oportunidad única para activar las células de forma boyante, lo que lleva a fenotipos proliferativos que permiten la expansión con un agotamiento mínimo. Esta técnica ofrece un agotamiento reducido porque las microburbujas coestimuladoras permanecen flotantes y regresan a la parte superior del medio de cultivo, reduciendo así la cantidad de tiempo que las células en expansión están en contacto con los factores coestimuladores. Los resultados indican que las células T aisladas y cultivadas reciben suficiente estimulación para activarse y proliferar, pero no en una medida que conduzca a la sobreactivación, que luego conduce al agotamiento, como lo demuestra la presencia de PD-1 excesiva.
Introduction
Actualmente se están llevando a cabo más de 500 ensayos clínicos de terapia de células T con receptores de antígenos quiméricos (CAR) en todo el mundo, y cuatro productos de terapia de células CAR-T están disponibles en el mercado1. Sin embargo, todavía existen numerosas necesidades de investigación y fabricación de células CAR-T que deben abordarse para mejorar la eficacia, la escalabilidad y el éxito a largo plazo de estas terapias potencialmente curativas 2,3,4,5. La investigación clínica y la fabricación adoptiva de células CAR-T comienza con el aislamiento de células T de una muestra de sangre periférica y la posterior estimulación, transducción y expansión de las células aisladas. Parámetros como la recuperación de células T, la pureza y las señales de activación/agotamiento requieren una cuidadosa consideración al elegir las técnicas de aislamiento y estimulación celular para la investigación y fabricación de células CAR-T 3,4,6. Es importante destacar que la mejora en la persistencia terapéutica de las terapias de células CAR-T minimizando los impedimentos biológicos que resultan de los procesos de fabricación actuales, como el agotamiento de las células T, es necesaria para mejorar la eficacia terapéutica 6,7.
Como alternativa a los métodos tradicionales de aislamiento celular, como la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la clasificación celular activada magnéticamente (MACS), aquí se demuestra la clasificación celular activada por flotabilidad (BACS) con microburbujas para el aislamiento de células T. La separación de microburbujas utiliza microesferas huecas flotantes (microburbujas) para unir los objetivos y hacerlos flotar a la superficie de las muestras de fluidos 8,9. Al funcionalizar microburbujas con anticuerpos (es decir, anti-CD3), las poblaciones de células T deseadas pueden seleccionarse positivamente a partir de muestras de sangre periférica. Posteriormente, se demuestra en este trabajo el uso de una población diferente de microburbujas funcionalizadas con anticuerpos (es decir, anti-CD28) para coestimular y activar células T seleccionadas positivamente en suspensión. Las microburbujas ofrecen un flujo de trabajo de aislamiento y activación simple y altamente ajustable que genera células T listas para el cultivo de células suspendidas y aplicaciones posteriores como la modificación genética y la expansión. Críticamente, la activación celular flotante con microburbujas promueve la estimulación celular restringida para prevenir el agotamiento excesivo de las células T7.
Para este estudio, la citometría de flujo fue la principal herramienta utilizada para analizar el éxito del aislamiento, activación y transducción de las microburbujas funcionalizadas, así como para proporcionar información detallada sobre las subpoblaciones específicas presentes durante las fases de crecimiento y expansión después de la transducción. Además de la citometría de flujo, se utilizaron microscopía de campo claro y fluorescencia para confirmar la salud celular, la morfología y el éxito de la transducción. Sobre la base de estos resultados, la tecnología y el protocolo de microburbujas proporcionan una alternativa más sintonizable y suave a los métodos tradicionales de aislamiento y activación actualmente en uso; en particular, las células activadas por microburbujas muestran una expresión notablemente menor de marcadores de agotamiento de células T que la observada típicamente con herramientas y kits estándar de la industria.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito permite el aislamiento de células T de muestras de PBMC y la activación de células T suspendidas en medios de cultivo con microburbujas. Este método se basa en microburbujas funcionalizadas cuya flotabilidad inherente ofrece una oportunidad única para introducir señales coestimuladoras a las células y activarlas mientras están suspendidas en un medio de cultivo, reduciendo así la exposición de las células en expansión a la estimulación prolongada; tal sobreestimulación puede resultar e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
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