Isolamento, ativação e expansão de células T baseadas em flotação de amostras de células mononucleares do sangue periférico humano usando microbolhas
Summary
O objetivo deste estudo é demonstrar a viabilidade da separação baseada em flotação para isolar, ativar e expandir células T humanas primárias.
Abstract
O processo de isolamento de células T de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) para estabelecer culturas ex vivo é crucial para pesquisa, testes clínicos e terapias baseadas em células. Neste estudo, um protocolo simples e novo para isolar, ativar e expandir células T de PBMCs ex vivo é apresentado. Este estudo utiliza a tecnologia funcionalizada de classificação celular ativada por flutuabilidade (BACS) para isolar e ativar células T. Resumidamente, o protocolo envolve a seleção positiva de células CD3+ de PBMCs derivados de leucopacos, seguida por uma co-estimulação de 48 horas com microbolhas de estreptavidina pré-conjugadas anti-CD28 (SAMBs) antes da transdução em placas de 24 poços. As microbolhas funcionalizadas oferecem uma oportunidade única de ativar células de forma flutuante, levando a fenótipos proliferativos que permitem a expansão com o mínimo de exaustão. Esta técnica oferece exaustão reduzida, pois as microbolhas co-estimulatórias permanecem flutuantes e retornam ao topo do meio de cultura, reduzindo assim a quantidade de tempo que as células em expansão estão em contato com os fatores co-estimulatórios. Os resultados indicam que as células T isoladas e cultivadas recebem estimulação suficiente para ativar e proliferar, mas não a um ponto que leva à superativação, o que leva à exaustão, como demonstrado pela presença de PD-1 excessiva.
Introduction
Mais de 500 ensaios clínicos de terapia celular T com receptor de antígeno quimérico (CAR)-T estão sendo conduzidos em todo o mundo, e quatro produtos de terapia celular CAR-T estão disponíveis no mercado1. No entanto, ainda existem inúmeras necessidades de pesquisa e fabricação de células CAR-T que devem ser abordadas para melhorar a eficácia, a escalabilidade e o sucesso a longo prazo dessas terapias potencialmente curativas 2,3,4,5. A pesquisa e fabricação clínica adotiva de células CAR-T começa com o isolamento de células T de uma amostra de sangue periférico e a subsequente estimulação, transdução e expansão das células isoladas. Parâmetros como recuperação de células T, pureza e sinais de ativação/exaustão requerem consideração cuidadosa ao escolher as técnicas de isolamento e estimulação celular para pesquisa e fabricação de células CAR-T 3,4,6. É importante ressaltar que a melhora na persistência terapêutica das terapias com células CAR-T, minimizando os impedimentos biológicos decorrentes dos atuais processos de fabricação, como a exaustão das células T, é necessária para aumentar a eficácia terapêutica 6,7.
Como alternativa aos métodos tradicionais de isolamento celular, como a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) e a classificação de células ativadas por magnetismo (MACS), aqui é demonstrada a classificação de células ativadas por flutuabilidade (BACS) com microbolhas para isolamento de células T. A separação de microbolhas utiliza microesferas flutuantes e ocas (microbolhas) para ligar os alvos e flutuá-los na superfície de amostras de fluidos 8,9. Ao funcionalizar microbolhas com anticorpos (ou seja, anti-CD3), as populações de células T desejadas podem ser selecionadas positivamente a partir de amostras de sangue periférico. Posteriormente, o uso de uma população diferente de microbolhas funcionalizadas por anticorpos (ou seja, anti-CD28) para co-estimular e ativar células T positivamente selecionadas em suspensão é demonstrado neste trabalho. As microbolhas oferecem um fluxo de trabalho de isolamento e ativação simples e altamente ajustável que gera células T prontas para cultura de células suspensas e aplicações a jusante, como modificação genética e expansão. Criticamente, a ativação celular flutuante com microbolhas promove estimulação celular contida para evitar a exaustão excessiva das células T7.
Para este estudo, a citometria de fluxo foi a principal ferramenta utilizada para analisar o sucesso de isolamento, ativação e transdução das microbolhas funcionalizadas, bem como para fornecer informações detalhadas sobre as subpopulações específicas presentes durante as fases de crescimento e expansão pós-transdução. Além da citometria de fluxo, a microscopia de campo brilhante e fluorescência foi usada para confirmar a saúde celular, morfologia e sucesso da transdução. Com base nesses resultados, a tecnologia e o protocolo de microbolhas fornecem uma alternativa mais ajustável e mais suave aos métodos tradicionais de isolamento e ativação atualmente em uso atualmente; em particular, as células ativadas por microbolhas apresentam uma expressão notavelmente menor de marcadores de exaustão de células T do que a normalmente observada com ferramentas e kits padrão da indústria.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito permite o isolamento de células T de amostras de PBMC e a ativação de células T suspensas em meios de cultura com microbolhas. Este método baseia-se em microbolhas funcionalizadas cuja flutuabilidade inerente oferece uma oportunidade única de introduzir sinais co-estimulatórios nas células e ativá-los enquanto estão suspensos em um meio de cultura, reduzindo assim a exposição das células em expansão à estimulação prolongada; essa superestimulação pode resultar no aumento da express…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nenhum.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
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