Summary

Isolamento, attivazione ed espansione delle cellule T basate sulla flottazione da campioni di cellule mononucleate del sangue periferico umano utilizzando microbolle

Published: December 23, 2022
doi:

Summary

L’obiettivo di questo studio è dimostrare la fattibilità della separazione basata sulla flottazione per isolare, attivare ed espandere le cellule T umane primarie.

Abstract

Il processo di isolamento delle cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) per stabilire colture ex vivo è cruciale per la ricerca, i test clinici e le terapie basate sulle cellule. In questo studio, viene presentato un protocollo semplice e nuovo per isolare, attivare ed espandere le cellule T dalle PBMC ex vivo . Questo studio utilizza la tecnologia di selezione cellulare attivata dalla galleggiabilità (BACS) funzionalizzata per isolare e attivare le cellule T. In breve, il protocollo prevede la selezione positiva di cellule CD3+ da PBMC derivate da leukopak, seguita da una co-stimolazione di 48 ore con microbolle di streptavidina pre-coniugate anti-CD28-legate (SAMB) prima della trasduzione in piastre a 24 pozzetti. Le microbolle funzionalizzate offrono un’opportunità unica per attivare le cellule, portando a fenotipi proliferativi che consentono l’espansione con un esaurimento minimo. Questa tecnica offre un esaurimento ridotto perché le microbolle co-stimolatorie rimangono galleggianti e ritornano in cima al terreno di coltura, riducendo così la quantità di tempo in cui le cellule in espansione sono in contatto con i fattori co-stimolatori. I risultati indicano che le cellule T isolate e coltivate ricevono una stimolazione sufficiente per attivarsi e proliferare ma non in misura tale da portare a una sovraattivazione, che porta quindi all’esaurimento, come dimostrato dalla presenza di PD-1 eccessivo.

Introduction

Più di 500 studi clinici sulla terapia cellulare del recettore dell’antigene chimerico (CAR)-T sono attualmente condotti in tutto il mondo e quattro prodotti di terapia cellulare CAR-T sono disponibili sul mercato1. Tuttavia, esistono ancora numerose esigenze di ricerca e produzione di cellule CAR-T che devono essere affrontate per migliorare l’efficacia, la scalabilità e il successo a lungo termine di queste terapie potenzialmente curative 2,3,4,5. La ricerca clinica e la produzione di cellule CAR-T adottive inizia con l’isolamento delle cellule T da un campione di sangue periferico e la successiva stimolazione, trasduzione ed espansione delle cellule isolate. Parametri come il recupero delle cellule T, la purezza e i segnali di attivazione/esaurimento richiedono un’attenta considerazione quando si scelgono le tecniche di isolamento e stimolazione cellulare per la ricerca e la produzione di cellule CAR-T 3,4,6. È importante sottolineare che è necessario migliorare la persistenza terapeutica delle terapie cellulari CAR-T riducendo al minimo gli impedimenti biologici derivanti dagli attuali processi di produzione, come l’esaurimento delle cellule T, per migliorare l’efficacia terapeutica 6,7.

In alternativa ai tradizionali metodi di isolamento cellulare come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS), qui viene dimostrata la selezione cellulare attivata dalla galleggiabilità (BACS) con microbolle per l’isolamento delle cellule T. La separazione delle microbolle utilizza microsfere galleggianti e cave (microbolle) per legare i bersagli e farli galleggiare sulla superficie dei campioni di fluido 8,9. Funzionalizzando le microbolle con anticorpi (cioè anti-CD3), le popolazioni di cellule T desiderate possono essere selezionate positivamente da campioni di sangue periferico. Successivamente, in questo lavoro viene dimostrato l’uso di una diversa popolazione di microbolle funzionalizzate con anticorpi (cioè anti-CD28) per co-stimolare e attivare cellule T selezionate positivamente in sospensione. Le microbolle offrono un flusso di lavoro di isolamento e attivazione semplice e altamente sintonizzabile che genera cellule T pronte per la coltura cellulare sospesa e applicazioni a valle come la modificazione genetica e l’espansione. Criticamente, l’attivazione cellulare galleggiante con microbolle promuove la stimolazione cellulare trattenuta per prevenire un eccessivo esaurimento delle cellule T7.

Per questo studio, la citometria a flusso è stato lo strumento principale utilizzato per analizzare l’isolamento, l’attivazione e il successo della trasduzione delle microbolle funzionalizzate, nonché per fornire informazioni dettagliate sulle sottopopolazioni specifiche presenti durante le fasi di crescita ed espansione post-trasduzione. Oltre alla citometria a flusso, sono stati utilizzati microscopi a campo chiaro e a fluorescenza per confermare la salute cellulare, la morfologia e il successo della trasduzione. Sulla base di questi risultati, la tecnologia e il protocollo a microbolle forniscono un’alternativa più sintonizzabile e delicata ai tradizionali metodi di isolamento e attivazione attualmente in uso; in particolare, le cellule attivate da microbolle mostrano un’espressione notevolmente inferiore dei marcatori di esaurimento delle cellule T rispetto a quella tipicamente osservata con strumenti e kit standard del settore.

Protocol

1. Isolamento delle cellule T con microbolle mediante selezione positiva NOTA: questo protocollo descrive in dettaglio un approccio di selezione positiva CD3+ su piccola scala utilizzando SAMB. Incubare 3 x 108 PBMC ottenute commercialmente in 2,5 mL di tampone di separazione con anticorpo anti-CD3 biotinilato (OKT3) ad una concentrazione di 25 ng di anticorpo per 1 milione di cellule (25 ng/M). Mescolare delicatamente pipettando su e giù e inc…

Representative Results

Le cellule T sono state isolate dalle PBMC acquistate e placcate per l’attivazione come descritto nel protocollo. I campioni di controllo negativi (PBMC acquistati) non sono stati attivati. Questi campioni di controllo sono stati inclusi per dimostrare l’effetto che il processo di attivazione delle microbolle ha avuto sui campioni sperimentali rispetto ai controlli delle cellule T non toccati e non stimolati, assicurando che i marcatori di attivazione osservati fossero il risultato dei fattori di attivazione aggiunti e n…

Discussion

Il protocollo descritto consente l’isolamento delle cellule T da campioni di PBMC e l’attivazione di cellule T sospese in terreni di coltura con microbolle. Questo metodo si basa su microbolle funzionalizzate la cui galleggiabilità intrinseca offre un’opportunità unica per introdurre segnali co-stimolatori alle cellule e attivarli mentre sono sospesi in un terreno di coltura, riducendo così l’esposizione delle cellule in espansione alla stimolazione prolungata; tale sovrastimolazione può comportare un aumento dell’es…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nessuno.

Materials

2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023 CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates VWR  76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody Biolegend 302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody Biolegend 317320
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
GlutaMAX Supplement Thermofisher 35050061
Human Recombinant IL2  BioVision (vwr) 10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 Takara Bio 0038VCT
Leukopak BioIVT HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs BioIVT HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture VWR 97063-708 CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent Millipore Sigma TR-1003-G CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated Innovative Research ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES Gibco 72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) Akadeum 11110-000

References

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Cite This Article
Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles. J. Vis. Exp. (190), e64573, doi:10.3791/64573 (2022).

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