Summary

Flotationsbasierte T-Zell-Isolierung, -Aktivierung und -Expansion aus mononukleären Blutproben des menschlichen peripheren Blutes unter Verwendung von Mikrobläschen

Published: December 23, 2022
doi:

Summary

Ziel dieser Studie ist es, die Machbarkeit einer flotationsbasierten Trennung zur Isolierung, Aktivierung und Erweiterung primärer humaner T-Zellen zu demonstrieren.

Abstract

Der Prozess der Isolierung von T-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zur Etablierung von Ex-vivo-Kulturen ist für Forschung, klinische Tests und zellbasierte Therapien von entscheidender Bedeutung. In dieser Studie wird ein einfaches, neuartiges Protokoll zur Isolierung, Aktivierung und Expansion von T-Zellen aus PBMCs ex vivo vorgestellt. Diese Studie verwendet die funktionalisierte Auftriebs-aktivierte Zellsortierung (BACS) -Technologie, um T-Zellen zu isolieren und zu aktivieren. Kurz gesagt, beinhaltet das Protokoll die positive Selektion von CD3 + -Zellen aus Leukopak-abgeleiteten PBMCs, gefolgt von einer 48-stündigen Kostimulation mit präkonjugierten Anti-CD28-gebundenen Streptavidin-Mikrobläschen (SAMBs) vor der Transduktion in 24-Well-Platten. Funktionalisierte Mikrobläschen bieten eine einzigartige Möglichkeit, Zellen schwimmfähig zu aktivieren, was zu proliferativen Phänotypen führt, die eine Expansion mit minimaler Erschöpfung ermöglichen. Diese Technik bietet eine reduzierte Erschöpfung, da die co-stimulatorischen Mikrobläschen schwimmfähig bleiben und an die Spitze des Kulturmediums zurückkehren, wodurch die Zeit, in der die expandierenden Zellen mit den kostimulierenden Faktoren in Kontakt sind, verkürzt wird. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die isolierten und kultivierten T-Zellen genügend Stimulation erhalten, um sich zu aktivieren und zu vermehren, aber nicht in einem Ausmaß, das zu einer Überaktivierung führt, die dann zu Erschöpfung führt, wie das Vorhandensein von übermäßigem PD-1 zeigt.

Introduction

Weltweit werden derzeit mehr als 500 klinische Studien zur chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zelltherapie durchgeführt, und vier CAR-T-Zelltherapieprodukte sind auf dem Markt erhältlich1. Es bestehen jedoch noch zahlreiche Forschungs- und Herstellungsbedürfnisse für CAR-T-Zellen, die angegangen werden müssen, um die Wirksamkeit, Skalierbarkeit und den langfristigen Erfolg dieser potenziell kurativen Therapien zu verbessern 2,3,4,5. Die klinische Forschung und Herstellung von adoptiven CAR-T-Zellen beginnt mit der Isolierung von T-Zellen aus einer peripheren Blutprobe und der anschließenden Stimulation, Transduktion und Expansion der isolierten Zellen. Parameter wie T-Zell-Regeneration, Reinheit und Aktivierungs-/Erschöpfungssignale erfordern eine sorgfältige Berücksichtigung bei der Auswahl der Zellisolierungs- und Stimulationstechniken für die CAR-T-Zellforschung und -herstellung 3,4,6. Wichtig ist, dass die Verbesserung der therapeutischen Persistenz von CAR-T-Zelltherapien durch Minimierung der biologischen Hindernisse, die sich aus den aktuellen Herstellungsprozessen ergeben, wie z.B. die T-Zell-Erschöpfung, erforderlich ist, um die therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen 6,7.

Als Alternative zu herkömmlichen Zellisolierungsmethoden wie Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und magnetisch-aktivierte Zellsortierung (MACS) wird hier die Auftriebs-aktivierte Zellsortierung (BACS) mit Mikrobläschen zur T-Zell-Isolierung demonstriert. Die Mikroblasentrennung verwendet schwimmfähige, hohle Mikrokugeln (Mikrobläschen), um die Ziele zu binden und sie an die Oberfläche von Flüssigkeitsproben zu treiben 8,9. Durch die Funktionalisierung von Mikrobläschen mit Antikörpern (d.h. Anti-CD3) können die gewünschten T-Zellpopulationen positiv aus peripheren Blutproben selektiert werden. Anschließend wird in dieser Arbeit die Verwendung einer anderen Population von Antikörper-funktionalisierten Mikrobläschen (d.h. Anti-CD28) zur Co-Stimulation und Aktivierung positiv ausgewählter T-Zellen in Suspension demonstriert. Mikrobläschen bieten einen einfachen und hochgradig abstimmbaren Isolations- und Aktivierungs-Workflow, der T-Zellen erzeugt, die für suspendierte Zellkulturen und nachgelagerte Anwendungen wie genetische Modifikation und Expansion bereit sind. Entscheidend ist, dass die Aktivierung von Auftriebszellen mit Mikrobläschen eine gehemmte Zellstimulation fördert, um eine übermäßige Erschöpfung der T-Zellen zu verhindern7.

Für diese Studie war die Durchflusszytometrie das primäre Werkzeug, um den Isolierungs-, Aktivierungs- und Transduktionserfolg der funktionalisierten Mikrobläschen zu analysieren und detaillierte Informationen über die spezifischen Subpopulationen zu liefern, die während der Wachstums- und Expansionsphasen nach der Transduktion vorhanden waren. Neben der Durchflusszytometrie wurden Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um die Zellgesundheit, Morphologie und den Transduktionserfolg zu bestätigen. Basierend auf diesen Ergebnissen bieten die Mikroblasentechnologie und das Mikroblasenprotokoll eine abstimmbarere und schonendere Alternative zu den derzeit verwendeten traditionellen Isolations- und Aktivierungsmethoden. Insbesondere zeigen mikroblasenaktivierte Zellen eine deutlich geringere Expression von T-Zell-Erschöpfungsmarkern als die, die typischerweise mit branchenüblichen Werkzeugen und Kits beobachtet wird.

Protocol

1. Isolierung von T-Zellen mit Mikrobläschen mittels positiver Selektion HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt einen kleinen CD3+ -positiven Selektionsansatz unter Verwendung von SAMBs. Inkubieren Sie 3 x 108 kommerziell erhältliche PBMCs in 2,5 ml Trennpuffer mit biotinyliertem Anti-CD3 (OKT3) Antikörper in einer Konzentration von 25 ng Antikörper pro 1 Million Zellen (25 ng / M). Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren auf und ab und inkub…

Representative Results

T-Zellen wurden aus gekauften PBMCs isoliert und zur Aktivierung plattiert, wie im Protokoll beschrieben. Die Negativkontrollproben (gekaufte PBMCs) wurden nicht aktiviert. Diese Kontrollproben wurden eingeschlossen, um die Wirkung zu demonstrieren, die der Mikroblasenaktivierungsprozess auf die experimentellen Proben im Vergleich zu den unberührten und nicht stimulierten T-Zell-Kontrollen hatte, um sicherzustellen, dass die beobachteten Aktivierungsmarker das Ergebnis der hinzugefügten Aktivierungsfaktoren waren und n…

Discussion

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die Isolierung von T-Zellen aus PBMC-Proben und die Aktivierung suspendierter T-Zellen in Kulturmedien mit Mikrobläschen. Diese Methode beruht auf funktionalisierten Mikrobläschen, deren inhärenter Auftrieb eine einzigartige Gelegenheit bietet, ko-stimulatorische Signale in Zellen einzuführen und sie zu aktivieren, während sie in einem Kulturmedium suspendiert sind, wodurch die Exposition der expandierenden Zellen gegenüber längerer Stimulation reduziert wird. Eine solche Üb…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nichts.

Materials

2-Mercaptoethanol Gibco 21985-023 CAS: 60-24-2
Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates VWR  76081-560
Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody Biolegend 302904
Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody Biolegend 317320
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
GlutaMAX Supplement Thermofisher 35050061
Human Recombinant IL2  BioVision (vwr) 10006-122
Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 Takara Bio 0038VCT
Leukopak BioIVT HUMANLMX100-0001129
Normal Human PBMCs BioIVT HUMANHLPB-0002562
Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture VWR 97063-708 CAS: 8025-06-7
Polybrene Infection/Transfection Reagent Millipore Sigma TR-1003-G CAS:28728-55-4
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated Innovative Research ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES Gibco 72400047
Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) Akadeum 11110-000

References

  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).

Play Video

Cite This Article
Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Flotation-Based T Cell Isolation, Activation, and Expansion from Human Peripheral Blood Mononuclear Cell Samples Using Microbubbles. J. Vis. Exp. (190), e64573, doi:10.3791/64573 (2022).

View Video