Op flotatie gebaseerde T-celisolatie, activering en uitbreiding van menselijke perifere bloedmononucleaire celmonsters met behulp van microbubbels
Summary
Het doel van deze studie is om de haalbaarheid van op flotatie gebaseerde scheiding aan te tonen om primaire menselijke T-cellen te isoleren, activeren en uitbreiden.
Abstract
Het proces van het isoleren van T-cellen uit perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) om ex vivo culturen vast te stellen, is cruciaal voor onderzoek, klinische tests en celgebaseerde therapieën. In deze studie wordt een eenvoudig, nieuw protocol gepresenteerd om T-cellen ex vivo te isoleren, activeren en uitbreiden van PBMC’s. Deze studie maakt gebruik van gefunctionaliseerde buoyancy-activated cell sorting (BACS) -technologie om T-cellen te isoleren en te activeren. In het kort omvat het protocol de positieve selectie van CD3 + -cellen uit van leukopak afgeleide PBMC’s, gevolgd door een 48 uur co-stimulatie met voorgeconjugeerde anti-CD28-gebonden streptavidin microbubbels (SAMBs) voorafgaand aan transductie in 24-well platen. Gefunctionaliseerde microbubbels bieden een unieke kans om cellen te activeren, wat leidt tot proliferatieve fenotypen die expansie mogelijk maken met minimale uitputting. Deze techniek biedt verminderde uitputting omdat de co-stimulerende microbubbels drijvend blijven en terugkeren naar de top van het kweekmedium, waardoor de hoeveelheid tijd dat de expanderende cellen in contact komen met de co-stimulerende factoren wordt verminderd. De resultaten geven aan dat de geïsoleerde en gekweekte T-cellen voldoende stimulatie ontvangen om te activeren en te prolifereren, maar niet in een mate die leidt tot overactivatie, wat vervolgens leidt tot uitputting, zoals aangetoond door de aanwezigheid van overmatige PD-1.
Introduction
Meer dan 500 chimere antigeenreceptor (CAR)-T celtherapie klinische studies worden momenteel over de hele wereld uitgevoerd, en vier CAR-T celtherapie producten zijn beschikbaar op de markt1. Er bestaan echter nog steeds tal van CAR-T-celonderzoeks- en productiebehoeften die moeten worden aangepakt om de werkzaamheid, schaalbaarheid en het succes op lange termijn van deze potentieel curatieve therapieën te verbeteren 2,3,4,5. Adoptief CAR-T-cel klinisch onderzoek en productie begint met T-celisolatie uit een perifeer bloedmonster en de daaropvolgende stimulatie, transductie en uitbreiding van de geïsoleerde cellen. Parameters zoals T-celherstel, zuiverheid en activerings- / uitputtingssignalen vereisen zorgvuldige overweging bij het kiezen van de celisolatie- en stimulatietechnieken voor CAR-T-celonderzoek en productie 3,4,6. Belangrijk is dat verbetering van de therapeutische persistentie van CAR-T-celtherapieën door het minimaliseren van de biologische belemmeringen die het gevolg zijn van de huidige productieprocessen, zoals T-celuitputting, nodig is om de therapeutische werkzaamheid te verbeteren 6,7.
Als alternatief voor traditionele celisolatiemethoden zoals fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en magnetisch-geactiveerde celsortering (MACS), wordt hier buoyancy-activated cell sorting (BACS) met microbubbels voor T-celisolatie gedemonstreerd. Microbubbelscheiding maakt gebruik van drijvende, holle microsferen (microbubbels) om de doelen te binden en ze naar het oppervlak van vloeistofmonsters telaten drijven 8,9. Door microbubbels te functionaliseren met antilichamen (d.w.z. anti-CD3), kunnen de gewenste T-celpopulaties positief worden geselecteerd uit perifere bloedmonsters. Vervolgens wordt het gebruik van een andere populatie van antilichaam-gefunctionaliseerde microbubbels (d.w.z. anti-CD28) om positief geselecteerde T-cellen in suspensie te co-stimuleren en te activeren in dit werk aangetoond. Microbubbels bieden een eenvoudige en zeer instelbare isolatie- en activeringsworkflow die T-cellen genereert die klaar zijn voor zwevende celkweek en downstream-toepassingen zoals genetische modificatie en expansie. Van cruciaal belang is dat drijvende celactivering met microbubbels terughoudende celstimulatie bevordert om overmatige T-celuitputting te voorkomen7.
Voor deze studie was flowcytometrie het primaire hulpmiddel dat werd gebruikt om het isolatie-, activerings- en transductiesucces van de gefunctionaliseerde microbubbels te analyseren, evenals om gedetailleerde informatie te verstrekken over de specifieke subpopulaties die aanwezig zijn tijdens de groei- en expansiefasen na transductie. Naast flowcytometrie werden brightfield- en fluorescentiemicroscopie gebruikt om de celgezondheid, morfologie en transductiesucces te bevestigen. Op basis van deze resultaten bieden de microbubbeltechnologie en het protocol een afstembaarder en zachter alternatief voor de traditionele isolatie- en activeringsmethoden die momenteel worden gebruikt; in het bijzonder vertonen microbubbel-geactiveerde cellen een aanzienlijk lagere expressie van T-celuitputtingsmarkers dan die gewoonlijk wordt waargenomen met industriestandaard tools en kits.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het beschreven protocol maakt de isolatie van T-cellen uit PBMC-monsters en de activering van gesuspendeerde T-cellen in kweekmedia met microbubbels mogelijk. Deze methode is gebaseerd op gefunctionaliseerde microbubbels waarvan het inherente drijfvermogen een unieke kans biedt om co-stimulerende signalen in cellen te introduceren en ze te activeren terwijl ze in een kweekmedium zijn gesuspendeerd, waardoor de blootstelling van de uitdijende cellen aan langdurige stimulatie wordt verminderd; een dergelijke overstimulatie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Geen.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Biologix Multi-Well Culture Plates 24-well plates | VWR | 76081-560 | |
| Biotin anti-human CD28 (28.2) Antibody | Biolegend | 302904 | |
| Biotin anti-human CD3 (OKT3) Antibody | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Lentiviral Particle rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| Normal Human PBMCs | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillin/Streptomycin 100X for tissue culture | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Infection/Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Pooled Human AB Serum Plasma Derived Heat Inactivated | Innovative Research | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| Streptavidin Microbubble Kit (includes Akadeum's separation buffer) | Akadeum | 11110-000 |
References
- Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
- Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
- Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223 (2019).
- Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
- Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
- Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832 (2020).
- Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580 (2017).
- Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , (2022).
- McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , (2018).
- Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93 (2020).
- Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
- Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104 (2010).
