抗生物質の持続性は、敏感な同質遺伝子集団内の小さな亜集団が高用量の殺菌性抗生物質に一時的に耐える能力を表します。.本プロトコルは、 大腸菌 を致死量のオフロキサシンに曝露した後の分子および細胞レベルで抗生物質持続表現型を特徴付けるためのアプローチを組み合わせたものです。
抗生物質の持続性とは、少量の細菌亜集団が高用量の殺菌性抗生物質に一時的に耐える能力を指します。.殺菌性抗生物質処理により、細菌集団の大部分は急速に殺されます。この最初の急速な殺傷段階に続いて、持続性細胞が生存し続けるにつれて、殺傷率が大幅に低下します。古典的には、持続性は、高用量の抗生物質で、定義された曝露時間に対して実行される時間/キルアッセイによって集団レベルで決定されます。この方法は、持続性細胞のレベルと殺傷動態に関する情報を提供しますが、持続性現象の根底にある固有の細胞間の不均一性を反映していません。ここで説明するプロトコルは、従来のTime/Killアッセイとリアルタイム蛍光顕微鏡を使用したシングルセル分析を組み合わせたものです。適切な蛍光レポーターを使用することにより、生細胞の顕微鏡イメージングは、染色体の複製と分配、細胞伸長、細胞分裂などの細胞プロセスに対する抗生物質の影響に関する情報を提供できます。集団解析とシングルセル解析を組み合わせることで、持続性表現型の分子的および細胞的特性評価が可能になります。
このプロトコルは、単一細胞および集団レベルでの特定の抗生物質治療に応答した細菌持続表現型を分析することを目的としています。持続性とは、同質遺伝子集団内の小さな亜集団が高用量の殺菌性抗生物質(フルオロキノロン、アミノグリコシド、βラクタムなど)に耐える能力を表し、いわゆる持続性細胞の最小阻害濃度(MIC)は集団の大部分と同じです。抗生物質の存在下で細菌の生存を経時的に測定する場合、二相性殺傷動態は、非持続性細胞の最初の急速な根絶、続いて持続性細胞のはるかに遅い殺傷率を伴う、一過性の薬剤耐性細胞の存在を明らかにする。抗生物質を除去すると、これらの細胞は遺伝的に同一の集団を生じさせ、同じ抗生物質で処理した場合と同様の殺傷動態を示します1,2。持続性とは対照的に、抗生物質耐性は集団レベルで定義され、一般にde novo変異または耐性付与プラスミド3の水平遺伝子導入のいずれかの結果です。耐性の原因となる変異は、主に薬物の標的または薬物排出ポンプのプロモーター領域にありますが、ゲノムワイドおよび標的変異体解析アプローチによって特定された持続頻度を変化させる遺伝子は、多数かつ多様であることが証明されています2,3,4,5,6,7,8 .したがって、細菌細胞は複数の経路9,10,11を介して持続性状態に入る可能性があり、これらの持続性細胞の生理機能を特徴付けるには、単一細胞レベルで持続現象を調べるアプローチが必要です。
蛍光顕微鏡と組み合わせて使用されるマイクロ流体ツールの最近の開発は、持続性表現型の特性評価への道を開き、染色体複製12、DNA修復13、細胞分裂14などの重要な細胞プロセスの役割を強調しました。この論文では、高用量のオフロキサシンで処理された指数関数的に成長する大腸菌培養物で生成された持続性細胞を特徴付けるために、古典的な微生物学アッセイとシングルセルライブイメージングを組み合わせた統合アプローチについて説明します。ここで説明するプロトコルは、枯草菌などの他の細菌種における抗生物質持続現象を研究するために適用することができ15、または条件(例えば、βラクタム治療後の抗生物質持続性16)を研究することができ、表現型の不均一性を含む多くの現象を調査するために容易に変更することができる17、18、19.さらに、この論文に記載されているセットアップを他の蛍光レポーターと組み合わせて、単一細胞レベルでのpH20またはATP21の細胞内レベルなど、関心のある明確な細胞パラメーターを調べることができ、抗生物質の持続現象に関する新しい洞察を生み出す可能性があります。
この論文で提示されたプロトコルは、集団および単一細胞レベルでの抗生物質治療に応答して観察された持続表現型の分析を可能にします。実験は、化学的に定義された培地(MOPSグリセロール0.4%)で増殖させた大腸菌MG1655株を用いて行った。タイムキルアッセイおよび顕微鏡実験は、指数相培養で実施した。フルオロキノロンであるOFXを5 μg・mL−1の濃度で使用し、持続性細胞を明らかにしました。ここで説明するアプローチは、他の殺菌性抗生物質、例えばβ−ラクタム、アミノグリコシド、または抗菌化合物に適用することができる31。したがって、他の細菌株、培地、または増殖条件を使用することができる。ここで説明したものと同様の設定で異なる蛍光融合をモニタリングすることは、抗生物質治療の前、最中、および後に、DNA複製32、DNA修復25、33、および細胞分裂34などの細胞プロセスを追跡するのに役立ちます。同様に、蛍光レポーターを利用して、細胞内pH35、ATP36、またはROS37レベルなどの細胞生理学の異なる側面を調べることができます。蛍光融合の代わりに、化学染料も適用できます。例えば、hupA-mCherry融合は、DNA38を染色する蛍光色素である4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)に置き換えることができます。ただし、このような蛍光色素と組み合わせてタイムラプス顕微鏡を行うことは、これらの染色技術がタイムラプス実験中の細胞周期のダイナミクスを乱す可能性があるため、避ける必要があります。あるいは、そのような実験は、関連する時点でのスナップショット画像の時間経過分析に置き換えることができる。
このような蛍光レポーターは役に立ちますが、位相差画像の解析で抽出できる情報量も無視してはなりません。ここでは、増殖、OFX処理、および回復段階を通じて細胞長の進化を監視しました。細胞幅、位相差強度、細菌細胞の曲率など、位相差画像に基づく他のパラメータも、MicrobeJ27などの適切なソフトウェアを使用して簡単に抽出できます。
要約すると、ここで説明する手順は、変化する環境またはストレッサーに対する細胞応答をモニターするために、他の条件および細菌種に適用することができる18、19。他の蛍光レポーター(転写および翻訳レポーター、化学色素)をフローサイトメトリー/FACSなどのポピュレーション解析と組み合わせて使用 することにより、興味深い質問にマルチスケールフレームワークで対処できます。
The authors have nothing to disclose.
ヴァンメルダーレンラボでの作業は、ARCアクション2018-2023、国立科学研究センター財団(FNRS CDR J.0182.21F)によってサポートされています。T.O.はULBフェローシップによってサポートされています。T.S.はFRIAフェローシップ(FNRS)によってサポートされています。JCは、ポスドクフェローシップ「シャルジェデレシェルシュ」(FNRS)によってサポートされています。
Axio Observer | Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
CaCl2.2H2O | Merck | 1.02382.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
CellASIC ONIX2 FG | Merck | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck | CAX2-MBC20 | Manifold system |
CoCl2.6H2O | Merck | 1.02539.0100 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
CuSO4.5H2O | Merck | 1.02790.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
D-(+)-glucose | Sigma Aldrich | G7021-1KG | Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium |
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) | BE10 | wt reference strain, lab strain | |
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT | BE16 | HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain | |
FeSO4.7H2O | VWR Chemicals | 24244.232 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software; Schindelin et al. if used in publication |
Glycerol | Merck | 56815 | Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium |
Greiner CELLSTAR® multiwell culture plate | Merck | M8812-100EA | 24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader |
H3BO3 | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Digital Image Acqusition |
K2HPO4 | Merck | 1.05099.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
KOH | Merck | 1.05029.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
K2SO4 | Merck | 1.05153.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
Luria-Broth agar medium | Invitrogen | 22700041 | Growth medium for plating assay |
Luria-Broth medium | Invitrogen | 12780029 | Growth medium for MIC determination |
MgCl2.6H2O | Merck | 1.05832.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
MgSO4 | Merck | 7487-88-9 | Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM |
MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. |
Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck | B04A-03-5PK | Plate for microfluidic system |
MnCl2.4H2O | Merck | 1.05927.0100 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
MOPS, Free Acid ULTROL® Grade | Merck | 475898-500GM | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
NaCl | SIgma-Aldrich | S5886-1KG | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
(NH4)6Mo7O24.4H2O | Merck | 1.01180.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
Ofloxacin | Merck | 82419-36-1 | Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells |
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x | Merck | P3813 | Dilution buffer |
GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | 840-208200 | UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm |
SoftMax Pro | Molecular Devices | Microplate reader software | |
SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
N-[Tris(hydroxyméthyl)-méthyl]-glycine | Merck | 1.08602.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
Zeiss® immersion Oil 518F | Zeiss | Immersion oil to increase resolution of microscope | |
Zen3.2 Pro | Zeiss | Microscopic image acquisition and processing software | |
ZnSO4.7H2O | Merck | 1.08883.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |