低侵襲法に基づくマウス挫傷脊髄損傷モデルの確立

注:すべての実験は、山東大学チールー医科大学の実験動物倫理福祉委員会(承認番号:21L60)によって承認され、国立衛生研究所が発行した実験動物の世話と使用に関するガイド(NIH出版物第85-23号、改訂1996)に従って実施されました。 1.脊髄損傷同軸プラットフォームのメカニズムと機械的試験 外科手術台、脊椎安定装置、およびインパクターチップでプラットフォームを組み立てます(図1)。注意: 重量落下やスリーブの汚れがプラットフォームの精度に影響を与える可能性があるため、重量が気流に遭遇するのを防ぐ重量落下スロットと排気スロットを清潔に保ちます。 正確な脊髄の位置特定を可能にする先端をスリーブに入れます。 実験の体重減少の適切な質量(軽度、中等度、重度のグループでそれぞれ1.3 g、2.0 g、2.7 g)を選択します。 プルピンをウェイトドロップの穴に差し込みます。 X-Y-Zアームの溝にプルピンを取り付けて、ウェイトドロップをスリーブの上部に組み立て、位置決めが完了すると、ウェイトが解放されてインパクターの先端に当たり、その結果、脊髄が擦り傷になり、脊髄の変化が顕微鏡で観察されます。 取り外し可能な0.1mm精密X-Y-Zアームをオペレーターの便宜に合わせて調整し、十分な作業スペースを確保します(図1D、E)。注意: 研究結果の一貫性を確認するために、実験を開始する前に、ピーク圧力検出装置を使用して、ウェイトがスリーブ内に落下したときに発生する力を測定します。確認の繰り返しは、将来の研究には必要ありません。 デバイスの電源を入れ、金属圧力受容体を先端の下に置き、アダプターをゼロにし、プルピンを解放し、実際の衝撃力を記録します。 2. 第9胸椎(T9)の位置特定と椎弓切除術 注:9〜10週齢の雌C57BL / 6Jマウスは、済南彭越実験動物会社(中国済南)から購入しました。 実験用の一連の手術器具をオートクレーブし、手術前に手術台を75%アルコールで滅菌します。 鎮痛のためにブプレノルフィンを注射します (0.05-2.0 mg / kg, SQ) 傷害手術のための麻酔の30分前に.次に、マウスをイソフルランで麻酔します(誘導:~3%-5%、維持:~1.5%-2%)。動物が尾またはつま先のつまみの反射によって完全に麻酔されているかどうかを確認します。麻酔が有効になったら、マウスを手術台の指定された部分に腹臥位に置き、角膜に眼軟膏をコーティングします(手術中の目の乾燥を防ぐために角膜に眼軟膏を塗布します)。胸腰椎の上に電気シェーバーで尾から吻側まで髪を剃ります。ヨードフォアで30秒間円運動で皮膚を数回殺菌し、続いて75%アルコールを殺菌します。滅菌外科用ドレープを適用し、メスと刃で約T6からT13までの皮膚に約1.5 cmの縦切開を行います。注:T12-T13棘間腔が位置する正中線までの肋骨縁に沿って触診します。吻側に1.5 cmの切開を行い、切開はT6-T13椎骨とほぼ同じ高さになります。 手術顕微鏡下で骨部分から片側の13番目の肋骨を探索します。正中線の棘突起を調べるには、肋骨角の領域に軽く触れ、次に吻側に向かってT12-T13の棘間腔を見つけます。T9-T10の棘間空間をT12-T13の空間から吻側まで探索します。(図2A、3A) T9の棘突起に沿って傍脊髄筋をマイクロハサミで両側の前部および後部の椎間関節まで解剖します(図3B)。マイクロリトラクターで傍脊髄筋を引っ込め、マイクロハサミで椎弓板上およびT8-T9およびT9-T10の棘間腔内の軟組織を洗浄します。 T9椎弓切除術を行い、顕微手術鉗子でT9の棘突起をクランプし、わずかに持ち上げ、脊髄の損傷を避けて椎弓板の右側に沿ってマイクロハサミを平行に挿入し、マイクロハサミで椎弓板を切り取ります。左側で繰り返すと、脊髄が露出する可能性があります(図2B、3C)。 椎骨を固定する前に、ユニバーサルアームを緩め、椎骨安定化装置のマイクロ蚊鉗子で椎骨の両側にある9番目から10番目のファセットジョイントをゆっくりとクランプします。マイクロ蚊鉗子のネジを締めると、椎骨が安定します。脊髄を水平面に調整し、ユニバーサルアームを締めると、椎骨が固定されます(図3D)。 3. T9挫傷 T9レベルの脊髄が露出し、椎骨が固定されたら、手術顕微鏡の下のスリーブの内側の先端で脊髄を狙います(図3E)。 脊髄と先端の関係を顕微鏡で観察しやすく、手術台を回しやすいため、脊髄の後部と外側から先端の表面が脊髄と平行になっているか確認してください。 脊髄に平行な自然な基準面であるため、椎弓切除後に先端が脊髄と接触する前に、先端の表面が温存椎弓板の両側境界と平行であるかどうかを確認してください。 T12-T13の棘間腔を見つけた後、インパクターの端が観察窓のマークと一致し、指定された高さ22mmに達するまでスリーブを下げます。プルピンを引き出して重量を解放します(グループに応じて1.3 g、2.0 g、または2.7 g、各グループには3匹のマウスが含まれ、各グループは各時点で1匹のマウスを持ちます)。注意: 脊髄は地面と平行で先端に垂直である必要があります。テーブルは非常にコンパクトなので、顕微鏡の視野を確保するために手術台を動かしてください。 挫傷が終わったらインパクターを取り外し、手術顕微鏡でSCIの程度を観察します。軽度のグループでは、淡赤色の色の変化が見られますが、中等度のグループでは、損傷部位は3〜4秒で暗赤色を示し、おそらく隆起が観察されます。重症群では、暗赤色の徴候がすぐに現れ、硬膜の明らかな隆起が現れることがありますが、硬膜はまだ一貫した形状です(図3F)。 表在性筋膜および皮膚を縫合糸(ポリプロピレン非吸収性縫合糸、サイズ:6〜0)で縫合する。 縫合が完了したら、手術領域を滅菌し、完全な意識が回復するまで温度制御されたパッドにマウスを置き、マウスをマウスケージに入れます。 4.動物の世話 回復のために動物を加熱パッドの上に置き、両方の後肢の動きを観察します。注:手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒に戻さないでください。 動物が簡単に食べ物に届くように、ケージの床に高水分の食事を置きます。または、下部の給餌テーブルを備えたケージを使用してください。 中等度および重度の損傷グループが膀胱機能を回復することは困難であるため、手術後にマウスの膀胱を1日2回空にします。鎮痛のためにブプレノルフィンを注射します (0.05-2.0 mg / kg, SQ) 8-12 時間 / 日 3日間. 5.経心灌流、染色、免疫染色 受傷後1日目、28日目、56日目に、灌流により各群のマウスをそれぞれ1匹ずつ屠殺する。過度の麻酔後、60 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と20 mLの4%パラホルムアルデヒド(4%〜6%イソフルラン)でマウスを灌流します。 背骨をマイクロハサミで集め、病変の中心から吻側と尾側にそれぞれ1 cm伸ばします。 余分な筋肉を切除し、器具がステップ5.1.4で保持できるように部分的な肋骨で無傷の脊椎セグメントを予約し、4%パラホルムアルデヒドに24時間浸します。 固定のために止血鉗子で肋骨をクランプし、切除された椎弓板と脊髄の病変中心の色の変化に従って顕微鏡下で病変の中心を定義します。 尾からマイクロハサミですべての椎弓板と関節突起を切除します。 マイクロハサミで神経根を切り取り、脊髄を取り出します。 マイクロハサミで病変の中心からそれぞれ尾側と吻側に伸びる0.5 cmの脊髄を収集します。 脊髄を30%スクロースに4°Cで48時間入れます。 組織学的検査の種類に従って、凍結後に組織を6μmの厚さの切片に切断します。 ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色を行う。切片を室温に再加熱し、厚さ6 μmの切片を4%ホルムアルデヒドに約15分間浸した後、1x PBSに1分間4回浸して残留OCTを除去します。 切片をヘマトキシリンで90秒間染色し、二重蒸留水ですすいでください。 次に、切片を流水で3分間洗います。 エオジンで4分間染色し、95%アルコールに30秒間2回浸して、余分なエオジンを洗い流します。 最後に、勾配アルコール(95%アルコールと50%アルコールを連続して1回ずつ)で30秒間脱水し、キシレンに浸して透明化を2分間行います。その後、試験片を樹脂ゲルで密封する(冠状面断面:図 4;矢状面断面: 図5)。 免疫蛍光染色を行う。切片を室温に再加熱し、厚さ6 μmの切片を4%ホルムアルデヒドに約2分間浸します。 切片をTBSTで5分間3回洗浄します。 切片をブロッキング溶液(PBS中の10%ヤギ正常血清)でインキュベートし、1時間ブロックして免疫グロブリンの非特異的結合をブロックします。 マウス抗グリア線維性酸性タンパク質(GFAP、反応性アストロサイトのマーカー)、ポリクローナル抗体(1:600)、およびニューロフィラメントのマーカーであるウサギ抗NF200抗体(1:2000)の両方を0.4 mLのブロッキング溶液中で脊髄切片を4°Cで一晩インキュベートします。 切片をPBSですすぎ、ヤギ抗ウサギAlexa 594結合IgG(1:1,000)およびヤギ抗マウスAlexa 488結合IgG(1:1,000)二次抗体を含むブロッキング溶液0.4 mLを室温で1時間加えます。 蛍光顕微鏡で10倍の波長594nmと488nmの自動パノラマスキャンで撮影します(図6)。蛍光顕微鏡の電源を入れ、スライドを顕微鏡ステージに置き、蛍光チャンネルに切り替え、ポジショニングキーを使用して組織上の3〜4点を配置し、焦点を合わせて撮影を完了します。撮影が終了したら、さまざまなチャンネルの画像を目的の形式で保存し、マージされた画像を保存します。