إنشاء نموذج إصابة الحبل الشوكي لكدمة الفأر بناء على تقنية طفيفة التوغل
Summary
تعمل التقنيات طفيفة التوغل وجهاز مختبري بسيط على تحسين استنساخ نموذج إصابة الحبل الشوكي عن طريق تقليل الأضرار الجراحية لحيوانات التجارب والسماح بصيانة التشكل التشريحي. هذه الطريقة جديرة بالاهتمام لأن النتائج الموثوقة والإجراءات القابلة للتكرار تسهل التحقيقات في آليات تعويض المرض.
Abstract
يمكن أن يؤدي استخدام طرق طفيفة التوغل لنمذجة إصابة الحبل الشوكي (SCI) إلى تقليل الاختلافات السلوكية والنسيجية بين التجارب ، وبالتالي تحسين قابلية استنساخ التجارب.
تحتاج هذه الطرق إلى متطلبين يجب الوفاء بهما: وضوح المسار التشريحي الجراحي وبساطة وراحة جهاز المختبر. بشكل حاسم بالنسبة للمشغل ، يوفر المسار التشريحي الواضح تعرضا طفيف التوغل ، مما يتجنب الضرر الإضافي لحيوان التجارب أثناء العمليات الجراحية ويسمح للحيوان بالحفاظ على مورفولوجيا تشريحية متسقة ومستقرة أثناء التجربة.
في هذه الدراسة ، تم البحث في استخدام منصة متكاملة جديدة تسمى منصة SCI المحورية لإصابة الحبل الشوكي في الحيوانات الصغيرة لفضح الحبل الشوكي على مستوى T9 بطريقة طفيفة التوغل وتثبيت وتثبيت فقرة الفئران باستخدام مثبت العمود الفقري ، وأخيرا ، يتم استخدام تأثير الجاذبية المحورية لضغط الحبل الشوكي للفئران على الاقتراب من درجات مختلفة من إصابة الحبل الشوكي T9. أخيرا ، يتم توفير النتائج النسيجية كمرجع للقراء.
Introduction
إصابة الحبل الشوكي الرضحية (SCI) تهيئ الفرد بسهولة لعواقب وخيمة1 ؛ ومع ذلك ، لا يوجد علاج فعال في الوقت الحاضر 1,2. تعد نماذج كدمة الحيوانات إحدى الطرق الرئيسية لدراسة اصابات النخاع الشوكي 3,4.
من عام 2004 إلى عام 2014 ، تم استخدامالفئران ككائنات نموذجية في 289 من 407 دراسة (71٪) والفئران في 69 (16.9٪). في الواقع ، زادت نسبة التجارب على الفئران تدريجيا على مر السنين بسبب مزاياها على النماذج الأخرى ، وخاصة الإمكانات الكبيرة لدراسات تنظيم الجينات3،4،5. لذلك ، هناك حاجة إلى المزيد من الأدوات المتوافقة لإجراء المزيد من الدراسات باستخدام الماوس كنموذج بسبب الأهمية الكبيرة التي تعلق على اتساق النموذج6. تعتمد الأجهزة الشائعة التي تم الإبلاغ عنها في الدراسات السابقة بشكل أساسي على مبدأ تأثير الحبل الشوكي لألن ، على سبيل المثال ، تأثير انخفاض الوزن الأساسي7,8 ، وجامعة نيويورك (NYU) / دراسات إصابة الحبل الشوكي الحيواني متعدد المراكز (MASCIS)1,9 ، وتأثير الأفق اللانهائي (IH) 10,11 . يشترك مصدم انخفاض الوزن وصدم جامعة نيويورك / MASCIS في نفس مبدأ التصويب على الحبل الشوكي المستهدف وإسقاط وزن ثابت من ارتفاعات مختلفة لإحداث شدة إصابة مختلفة. يخلق المؤثر IH إصابة الحبل الشوكي وفقا لقوى مختلفة.
للراحة في استخدام نموذج الماوس في دراسات اصابات النخاع الشوكي ولوضع الأساس لطرق العلاج الفعالة ، تم تطوير منصة متكاملة لإصابة الحبل الشوكي للفأر ، تسمى المنصة المحورية لإصابة الحبل الشوكي (SCICP). تتكون المنصة من أربعة مكونات رئيسية: (1) طاولة تشغيل حيوانية مصممة لوضع مناسب للفئران التي يتم تشغيلها ، وهي مدمجة للغاية وتوفر الراحة دون قيود على الموضع. (2) مبعدة دقيقة على كلا الجانبين لعقد عضلات الفقرية أثناء العملية ؛ (3) مثبت فقري لتثبيت الفقرة قبل إجراء اصابات النخاع الشوكي (يتوفر مثبتان فقريان للتشغيل على الحيوانات الكبيرة مثل الفئران) ؛ (4) كم ، طرف صدم ، أوزان ، ودبوس سحب. يجب تجميع الأجزاء الثلاثة على ذراع X-Y-Z قابل للإزالة. للاستهداف الدقيق ، يتم وضع طرف الصدمة على سطح الحبل الشوكي ، ويتم نزول ذراع X-Y-Z برفق إلى الارتفاع المتوقع بمساعدة العلامة بين طرف الصدمة والأكمام. يتكون طرف الصدمة من سبيكة ألومنيوم 0.12 جم لتجنب تلف الحبل الشوكي الناتج عن ضغط الوزن الكبير قبل الإجراء. دبوس السحب مخصص لتثبيت الأوزان الموجودة أعلى الغلاف لتحضير انخفاض الوزن (الشكل 1).
في الدراسات السابقة ، تم تعريف تقسيم قوة التأثير وفقا لبيانات قوة التأثير لجهاز IH ، وهي 30 Kdyn و 50 Kdyn و 70 Kdyn على التوالي 6,10. أثناء عملية البحث ، ثبت أن الدرجات التسلسلية لنماذج اصابات النخاع الشوكي قد تم تأسيسها بناء على SCICP ، والتي يمكن استخدامها في دراسات مختلفة. لذلك ، قبل بدء التجربة رسميا ، تم اختبار قوى التأثير الناتجة عن أوزان مختلفة من كتل مختلفة باستخدام جهاز اختبار ضغط الذروة. نتيجة لذلك ، تم اختيار ثلاثة نماذج تمثيلية موحدة لفئران اصابات النخاع الشوكي كثلاث درجات مختلفة من الإصابة ، بما في ذلك المجموعات الخفيفة والمتوسطة والشديدة المتدرجة ، على التوالي 6,10 ، وتم إطلاق الأوزان في نفس الارتفاع ، مع وزن 1.3 جرام للخفيف ، و 2.0 جرام للمعتدل ، و 2.7 جرام للأضرار الشديدة.
كوسيلة أخرى لضمان قابلية التشغيل والدقة ، تم الإبلاغ عن نهج تشغيلي جديد وطفيف التوغل. من خلال البحث في تشريح الفئران الطبيعية ، تم العثور على طريقة جديدة لتحديد موقع الفضاء بين العمود من T12-T13. طريقة تحديد موقع الفقرات في خطوات العملية سهلة الإتقان ودقيقة ، مما يضمن تحديد الموقع بدقة للعمليات طفيفة التوغل.
نأمل أن تساعد تقنية إصابة الكدمة هذه في البحث وفهم إصابة الحبل الشوكي ، بما في ذلك فهم الفيزيولوجيا المرضية وتقييم الإدارة وما إلى ذلك.
Protocol
Representative Results
Discussion
من خلال الإجراء الموحد ، يمكن الحصول على بيانات مستقرة ، خاصة في تجارب الحيوانات الصغيرة في الجسم الحي ، والتي يمكن أن تقلل من انحراف النتائج الناجمة عن الفروق الفردية بين الحيوانات. بناء على الشروط المذكورة أعلاه وأدوات التطبيق المريحة ، يمكن إنشاء نماذج SCI موحدة وطفيفة التوغل ودقيقة وقابلة للتكرار.
نظرا لقابليته للتطبيق العملي والراحة ، في السابق ، تم استخدام أداة تأثير انخفاض الوزن في الغالب3. يشترك المؤثر الذي تم تقديمه في هذه الدراسة في نفس المبدأ مع نموذج ألين12. لحسن الحظ ، نظرا لمزايا التصنيع الدقيقة لتكنولوجيا التصنيع الحديثة ، صمم فريق البحث أداة تصادم لانخفاض الوزن مع مزايا كونها سهلة التشغيل ومستقرة بقوة ونادرا ما تكون غير دقيقة. تم استخدام جهاز الكشف عن ضغط الذروة لقياس جاذبية الأوزان المختلفة. أفادت الدراسات السابقة6،10 حول تأثير Infinite Horizons أن نطاق ±5 Kdyn للقوة المنحرفة عن القوة المقصودة مقبول في مجموعات 30 Kdyn و 50 Kdyn و 70 Kdyn ، مما يوفر مرجعا للدراسة الحالية من حيث تقسيم المجموعة واختيار درجة الكدمة. في هذا البحث ، تم قياس القوة المحتملة للمجموعات المختلفة مسبقا ، وتم الحصول على بيانات أكثر دقة.
أكثر أهمية من الجهاز في تجارب النماذج الحيوانية هو فهم واستخدام تشريح الفأر. الاستفادة الجيدة من علم التشريح يمكن أن تجعل الإجراءات طفيفة التوغل. تؤثر الجراحة طفيفة التوغل بشكل مباشر على استقرار الحالة الوظيفية لحيوان التجارب واتساق استعادة الماوس اللاحقة. أظهرت الدراسات السابقة أن إنشاء نماذج اصابات النخاع الشوكي طفيفة التوغل يزيد من استقرار البنية الفقرية ويتجنب الضرر الإضافي الناجم عن عدم استقرار العمود الفقري أثناء الشفاء في الفئران1. فرضية الجراحة طفيفة التوغل هي الاستخدام المعقول للهياكل التشريحية الطبيعية. لذلك ، يجب أن يتم تحديد الموقع السريع والدقيق لشرائح الحبل الشوكي وفقا للهيكل التشريحي للفئران. كما ورد ، تم استخدام طريقة التصوير للعثور على الفقرة13. على الرغم من أنها تتمتع بدقة عالية ، إلا أنه في عملية التشغيل التجريبي الفعلية ، فإن طريقة التصوير لتحديد الموقع لها عيوب التشغيل غير المريح ، ووقت التشغيل الطويل ، واقتناء المعدات المعقدة ، ومتطلبات دقة المعدات العالية. وصف ماكدونو وآخرون تحديد موقع T7 من خلال الزوايا السفلية للكتف14 ، في حين أن الفئران تعمل في السجود ، لذلك من المفترض أن تكون الزوايا السفلية المذكورة زوايا خلفية. علاوة على ذلك ، فإن استخدام النصائح الكتفية السفلية للعثور على T7 هو طريقة تحديد موقع لموضع معين في علم التشريح البشري15 ، وهو غير مناسب للفئران. أخيرا ، أثبتت بيانات Micro-CT أيضا صحة الفرضية القائلة بأن الزوايا الخلفية للكتف لا تتدفق مع T7 بغض النظر عما إذا كان الفأر في وضع جسمه الطبيعي أو المحدد. ذكر McDonough et al.14 أيضا تحديد أعلى نقطة في الخلف عندما يكون الماوس مقوسا وتحديد أعلى نقطة على أنها T12. نسبيا ، في هذا البحث ، يقع T9 بمساعدة الفضاء بين العمود T12-T13 ، والذي لا يرتبط ولا يتأثر بوضعية الماوس. إلى جانب ذلك ، مع هذه الطريقة ، يمكن تحديد موقع الفقرة المستهدفة وتشغيلها بسهولة. يجب على المرء أن يسبر الضلع الثالث عشر تحت المجهر ، ويلمس بلطف منطقة الزاوية الضلعية الفقرية ، ويرسم خطا نحو العملية الشائكة ، ثم يسبر المسافة بين العمليات الشائكة ل T12-T13 باتجاه الرأس. استخدم فريق البحث الفضاء بين الشوكتين T12-T13 لتحديد موقع T9 من 12 فئران. أخيرا ، خضعت 12 أنثى من الفئران C57BL / 6J لفحص Micro-CT بعد موقع T9 واستئصال الصفيحة الفقرية. أشارت نتيجة الفحص بالأشعة المقطعية الدقيقة إلى أن الصفيحة التي تمت إزالتها في جميع الفئران ال 12 كانت T9. أظهرت نتائج التصوير المقطعي المحوسب الدقيق أن جميع T9 تم تحديد موقعها بدقة ، وكانت الدقة أعلى بكثير من طريقة تحديد موقع لوح الكتف. توفر لنا هذه الطريقة طريقة سريعة ودقيقة لتحديد الموقع ، مما يساهم في اتساق نموذج الإصابة.
الحد الأدنى من غزو البروتوكول الحالي واضح في ثلاثة جوانب رئيسية. أولا ، بعد تحديد الموقع ، يتم سحب العضلات المجاورة للعمود الفقري عند مستوى T9 فقط عن طريق المبعدات الدقيقة ، دون الإضرار بالعضلات عند مستويات T8 أو T10. إلى جانب ذلك ، فإن تعرض الصفيحة بواسطة المبعدات الدقيقة لا يتداخل مع المجال البصري. ثانيا ، فقدان الدم ، والذي يكون في الغالب من استئصال الصفيحة الفقرية ، والذي قد يتسبب في تدفق الدم من العظم الملغي ، منخفض جدا في إجراء العملية ، ولا يزيد تقريبا عن حجم تلطيخ قطعة قطن مثلثة 2 مم × 2 مم × 3 مم. ثالثا ، تم إجراء استئصال الصفيحة الفقرية على المنطقة المطلوبة إلى أقصى حد ، مع الحفاظ على استمرارية الجزء الجانبي من الصفيحة وتخفيف عدم استقرار الفقرة بشكل كبير. مقارنة بالبروتوكولات السابقة16,17 ، يقلل البروتوكول الحالي من الكثير من الأضرار غير الضرورية.
لتقييم الدرجات المختلفة ل SCI ، تمت مقارنة النتائج بين جميع المجموعات في علم أمراض الأنسجة مع ما أظهرته الدراسات السابقة بالفعل9،11،18. هذه النتائج كافية لإكمال دراسة رصدية لدرجات مختلفة من الإصابة والتغيرات في فترات مختلفة. أظهر HE و immunofluorescence أنه مع زيادة شدة اصابات النخاع الشوكي ، ظهر مورفولوجيا أكثر شذوذا في أنسجة الحبل الشوكي ، كما أدت الزيادة في درجة الضرر إلى زيادة في درجة الاضطراب الهيكلي للحبل الشوكي. من منظور مراقبة مورفولوجيا الأنسجة ، فإن درجة وانتظام تغيرات مورفولوجيا الأنسجة في كل مجموعة تجريبية في هذه الدراسة تتفق إلى حد كبير مع الدراسات السابقة.
وفقا لنتائج الاختبار النسيجي الحالية ، يشار إلى تغييرات واضحة في المؤشرات المختلفة بعد درجات مختلفة من اصابات النخاع الشوكي المؤلمة ، مما يؤكد بشكل أكبر موثوقية النموذج المحدد في هذه الدراسة.
على الرغم من دقة وفعالية هذه التقنية ، يمكن أن توجد قيود محتملة على الأساليب. فيما يتعلق باستئصال الصفيحة الفقرية ، يجب أن يكون المشغل ماهرا في العمليات تحت المجهر لمنع تلف الحبل الشوكي عن طريق الخطأ. أيضا ، يعتمد إعداد النظام الأساسي بأكمله على الهياكل الميكانيكية ، مما يؤدي إلى زيادة الطلب على المشغل مقارنة بالمعدات الآلية. في الواقع ، يمكن تحسين جميع المشاكل المذكورة عن طريق التدريب المتكرر للعملية.
يمكن ملاحظة أن النمذجة طفيفة التوغل والموحدة مفيدة في جعل النتائج أكثر اتساقا واستقرارا وقابلية للتكرار ، وتقييم فعالية خطط العلاج المختلفة بدقة ، وتحسين خطة البحث لإصابات النخاع الشوكي المؤلمة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج الدولة الرئيسي للعلوم الطبيعية الوطنية في الصين (81930070).
Materials
| 4% fixative solution | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide antibody | abcam | ab8135 | Dilution ratio (1: 2000) |
| Eosin Staining Solution (water soluble) | biosharp | BL727B | |
| Ethanol | Fuyu Reagent | 64-17-5 | |
| Fluorescent microscope | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Frozen Slicer | leica | CM3050 S | |
| GFAP (GA5) Mouse mAb | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | Dilution ratio (1: 600) |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | Dilution ratio (1: 1000) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Dilution ratio (1: 1000) |
| Hematoxylin Staining Solution | biosharp | BL702A | |
| Mice | Jinan Pengyue Experimental AnimalCompany | C57BL/6J | |
| Microsurgery apparatus | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | All the surgey instruments are custom-made | Ophthalmic scissors, micro mosquito forceps, microsurgery forceps, micro scissors |
| Normal sheep serum for blocking (working solution) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | working solution |
| O.C.T. Compound | SAKURA | 4583 | |
| PBS (phosphate buffered solution) | Solarbio | P1020 | pH 7.2-7.4 |
| RWD Laboratory inhalation anesthetic station | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Small animal in vivo microCT imaging system | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Spinal cord injury coaxial platform | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Custom-made(Feng's standard) | (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1~ b0yRFKOq&alg_id=0&slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId&components_style_ layout=1&reft=1659409105184&sp m=g.930111970_f.81386274&alias =367x5ovgn69q18g&from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a&sf=qq_sm&is_share=1&shopAuto Enter=1&share_cmpt=native_ wechat&is_silence_auth=1) |
| Surgery microscope | Zumax Medical Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| TBST (Tris Buffered Saline+Tween) | Solarbio | T1082 | Dilution ratio (1: 19) |
| Xylene | Fuyu Reagent | 1330-20-7 |
References
- Duan, H., et al. A novel, minimally invasive technique to establish the animal model of spinal cord injury. Annals of Translational Medicine. 9 (10), 881 (2021).
- Piao, M. S., Lee, J. -. K., Jang, J. -. W., Kim, S. -. H., Kim, H. -. S. A mouse model of photochemically induced spinal cord injury. Journal of Korean Neurosurgical Society. 46 (5), 479-483 (2009).
- Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: A systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
- Zhang, N., Fang, M., Chen, H., Gou, F., Ding, M. Evaluation of spinal cord injury animal models. Neural Regeneration Research. 9 (22), 2008-2012 (2014).
- Borges, P. A., et al. Standardization of a spinal cord lesion model and neurologic evaluation using mice. Clinics. 73, 293 (2018).
- Ghasemlou, N., Kerr, B. J., David, S. Tissue displacement and impact force are important contributors to outcome after spinal cord contusion injury. Experimental Neurology. 196 (1), 9-17 (2005).
- Siddall, P., Xu, C. L., Cousins, M. Allodynia following traumatic spinal cord injury in the rat. Neuroreport. 6 (9), 1241-1244 (1995).
- Ford, J. C., et al. MRI characterization of diffusion coefficients in a rat spinal cord injury model. Magnetic Resonance in Medicine. 31 (5), 488-494 (1994).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139 (2), 244-256 (1996).
- Nishi, R. A., et al. Behavioral, histological, and ex vivo magnetic resonance imaging assessment of graded contusion spinal cord injury in mice. Journal of Neurotrauma. 24 (4), 674-689 (2007).
- Ma, M., Basso, D. M., Walters, P., Stokes, B. T., Jakeman, L. B. Behavioral and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57Bl/6 mouse. Experimental Neurology. 169 (2), 239-254 (2001).
- Allen, A. R. Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column. The Journal of the American Medical Association. (11), 878-880 (1911).
- Kuhn, P. L., Wrathall, J. R. A mouse model of graded contusive spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 15 (2), 125-140 (1998).
- McDonough, A., Monterrubio, A., Ariza, J., Martinez-Cerdeno, V. Calibrated forceps model of spinal cord compression injury. Journal of Visualized Experiments. (98), e52318 (2015).
- Ernst, M. J., Rast, F. M., Bauer, C. M., Marcar, V. L., Kool, J. Determination of thoracic and lumbar spinal processes by their percentage position between C7 and the PSIS level. BMC Research Notes. 6, 58 (2013).
- Wu, X., et al. A tissue displacement-based contusive spinal cord injury model in mice. Journal of Visualized Experiments. (124), e54988 (2017).
- Bhalala, O. G., Pan, L., North, H., McGuire, T., Kessler, J. A. Generation of mouse spinal cord injury. Bio-protocol. 3 (17), 886 (2013).
- Shinozaki, M., et al. Novel concept of motor functional analysis for spinal cord injury in adult mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 157458 (2010).
