Динамический сбор внеклеточной жидкости гиппокампа у крыс, находящихся в сознании, в режиме реального времени с использованием системы микродиализа
Summary
Протокол обеспечивает подробный динамический отбор проб внеклеточной жидкости из гиппокампа бодрствующих крыс в режиме реального времени с использованием системы микродиализа.
Abstract
Различные заболевания центральной нервной системы (ЦНС) связаны с изменениями состава внеклеточной жидкости гиппокампа (HECF). Однако трудности с получением HECF в режиме реального времени от крыс, находящихся в сознании, долгое время ограничивали оценку прогрессирования заболевания ЦНС и эффективность этномедицинской терапии. Обнадеживает то, что метод микродиализа мозга может быть использован для непрерывного отбора проб с преимуществами динамического наблюдения, количественного анализа и небольшого размера выборки. Это позволяет отслеживать изменения содержания во внеклеточной жидкости соединений из традиционных трав и их метаболитов в мозге живых животных. Таким образом, цель этого исследования состояла в том, чтобы точно имплантировать зонд микродиализа спинномозговой жидкости в область гиппокампа крыс Sprague Dawley (SD) с трехмерным стереотаксическим аппаратом мозга, отсекая молекулярные массы более 20 кДа. Затем высококачественный HECF был получен от крыс, находящихся в сознании, с использованием системы контроля отбора проб при микродиализе с регулируемой частотой отбора проб от 2,87 нл / мин до 2,98 мл / мин. В заключение, наш протокол обеспечивает эффективный, быстрый и динамичный метод получения HECF у бодрствующих крыс с помощью технологии микродиализа, что дает нам неограниченные возможности для дальнейшего изучения патогенеза заболеваний, связанных с ЦНС, и оценки эффективности лекарств.
Introduction
Заболевания центральной нервной системы (ЦНС) с высокой заболеваемостью, такие как нейродегенеративные заболевания, черепно-мозговые травмы, черепно-мозговая травма, вызванная высотной гипоксией, и ишемический инсульт, являются основными причинами роста смертности во всем мире 1,2,3. Мониторинг цитокинов и белковых изменений в определенных областях мозга в режиме реального времени способствует диагностической точности заболеваний ЦНС и фармакокинетических исследований мозга после приема лекарств. В традиционных научных исследованиях используется гомогенат мозговой ткани или ручной сбор интерстициальной мозговой жидкости животных для обнаружения специфических веществ и для фармакокинетических исследований. Однако это имеет некоторые недостатки, такие как ограниченный размер выборки, невозможность динамического наблюдения за изменениями показателей и неравномерное качество выборки 4,5,6. Спинномозговая жидкость, интерстициальная жидкость, защищает головной и спинной мозг от механических повреждений. Его состав отличается от состава сыворотки из-за наличия гематоэнцефалического барьера (ГЭБ)7. Прямой анализ образцов спинномозговой жидкости в большей степени способствует раскрытию механизма поражения ЦНС и открытию лекарств. Неизбежно, что образцы спинномозговой жидкости, полученные вручную непосредственно из большой цистерны и желудочков головного мозга через шприц, имеют недостатки, связанные с загрязнением крови, случайной вероятностью сбора пробы, неопределенностью количества и почти отсутствием возможности многократного извлечения 8,9. В частности, традиционные методы забора интерстициальной мозговой жидкости не могут получить образцы из поврежденных областей мозга, что препятствует изучению патогенеза заболеваний ЦНС в определенных областях мозга и оценке эффективности таргетной этномедицинской терапии 9,10.
Микродиализ головного мозга — это метод отбора проб интерстициальной мозговой жидкости у бодрствующих животных11. Система микродиализа имитирует проницаемость сосудов с помощью зонда, имплантированного в мозг. Зонд для микродиализа оснащен полупроницаемой мембраной и имплантируется в определенные области мозга. После перфузии изотонической искусственной спинномозговой жидкостью (ACSF) диализованная интерстициальная мозговая жидкость может быть благоприятно собрана с преимуществами небольших размеров выборки, непрерывного отбора проб и динамического наблюдения12,13. С точки зрения расположения, зонды для микродиализа мозга могут быть выборочно имплантированы в структуры мозга или краниальные цистерны, представляющие интерес14. Наблюдение аномальных уровней эндогенного вещества во внеклеточной жидкости гиппокампа (HECF) предполагает возникновение заболеваний ЦНС или патогенез заболевания. Несколько исследований показали, что биомаркеры заболеваний ЦНС, такие как D-аминокислоты при шизофрении, β-амилоидные и тау-белки при болезни Альцгеймера, легкие цепи нейрофиламентов при черепно-мозговой травме и убиквитинкарбокси-концевая гидролаза L1s при гипоксической ишемической энцефалопатии, могут быть проанализированы в спинномозговой жидкости15,16,17 . Метод химического анализа, основанный на методе отбора проб микродиализа мозга, может быть использован для мониторинга динамических изменений экзогенных соединений, таких как активные ингредиенты этномедицины, которые диффундируют и распределяются в определенных областях мозга14.
В этой статье представлен специфический процесс динамического приобретения HECF у бодрствующих крыс и измерено его осмотическое давление для обеспечения качества образца.
Protocol
Representative Results
Discussion
Патогенез заболеваний ЦНС до сих пор до конца не изучен, что препятствует разработке новых методов лечения и лекарств. Исследования показали, что большинство заболеваний ЦНС тесно связаны с поражениями гиппокампа20,21,22. Предлагаемый ме…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82104533), Департаментом науки и технологий провинции Сычуань (2021YJ0175) и Китайским фондом постдокторантуры (2020M683273). Авторы хотели бы поблагодарить г-на Юньчэн Хонга, старшего инженера по оборудованию в Tri-Angels D&H Trading Pte. Ltd. (Сингапур) за оказание технических услуг по методике микродиализа.
Materials
| Air-drying oven | Suzhou Great Electronic Equipment Co., Ltd | GHG-9240A | |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Artificial cerebrospinal fluid | Beijing leagene biotech. Co., Ltd | CZ0522 | |
| Brain microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Covance infusion harness | Instech Laboratories, Inc. | CIH95 | |
| Denture base resins | Shanghai Eryi Zhang Jiang Biomaterials Co., Ltd | 190732 | |
| Electric cranial drill | Rayward Life Technology Co., Ltd | 78001 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Heparin sodium injection | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd | H51021208 | |
| Iodophor | Sichuan Lekang Pharmaceutical Accessories Co., Ltd | 202201 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Microdialysis catheter stylet | CMA Microdialysis AB | 8011205 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Osmometer | Löser | OM 807 | |
| Sodium hyaluronate eye drops | URSAPHARM Arzneimittel GmbH | H20150150 | |
| Stereotaxie apparatus | Rayward Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T56518 | |
| Trypsin solution | Boster Biological Technology, Ltd. |
PYG0107 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. O., Geschwind, M. D. Clinical neurology and epidemiology of the major neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 033118 (2018).
- Salehi, A., Zhang, J. H., Obenaus, A. Response of the cerebral vasculature following traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2320-2339 (2017).
- Kurtzman, R. A. e. m. 3., Caruso, J. L. High-altitude illness death investigation. Academic Forensic Pathology. 8 (1), 83-97 (2018).
- Matsumoto, T., et al. Pharmacokinetic study of Ninjin’yoeito: Absorption and brain distribution of Ninjin’yoeito ingredients in mice. Journal of Ethnopharmacology. 279, 114332 (2021).
- Mahat, M. Y., et al. An improved method of transcutaneous cisterna magna puncture for cerebrospinal fluid sampling in rats. Journal of Neuroscience Methods. 211 (2), 272-279 (2012).
- Ceaglio, N., et al. High performance collection of cerebrospinal fluid in rats: evaluation of erythropoietin penetration after osmotic opening of the blood-brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 219 (1), 70-75 (2013).
- Bothwell, S. W., Janigro, D., Patabendige, A. Cerebrospinal fluid dynamics and intracranial pressure elevation in neurological diseases. Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 9 (2019).
- Barthel, L., et al. A step-by-step guide for microsurgical collection of uncontaminated cerebrospinal fluid from rat cisterna magna. Journal of Neuroscience Methods. 352, 109085 (2021).
- Zhao, Y., Yang, Y., Wang, D. X., Wang, J., Gao, W. Y. Cerebrospinal fluid amino acid metabolite signatures of diabetic cognitive dysfunction based on targeted mass spectrometry. Journal of Alzheimer’s Disease. 86 (4), 1655-1665 (2022).
- Lim, N. K., et al. An improved method for collection of cerebrospinal fluid from anesthetized mice. Journal of Visualized Experiments. (133), e56774 (2018).
- Hendrickx, S., et al. A sensitive capillary LC-UV method for the simultaneous analysis of olanzapine, chlorpromazine and their FMO-mediated N-oxidation products in brain microdialysates. Talanta. 162, 268-277 (2017).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Current Protocols in Neuroscience. , (2009).
- Hammarlund-Udenaes, M. Microdialysis as an important technique in systems pharmacology-a historical and methodological review. The AAPS Journal. 19 (5), 1294-1303 (2017).
- Anderzhanova, E., Wotjak, C. T. Brain microdialysis and its applications in experimental neurochemistry. Cell and Tissue Research. 354 (1), 27-39 (2013).
- Mohammadi, A., Rashidi, E., Amooeian, V. G. Brain, blood, cerebrospinal fluid, and serum biomarkers in schizophrenia. Psychiatry Research. 265, 25-38 (2018).
- Lashley, T., et al. Molecular biomarkers of Alzheimer’s disease: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 11 (5), 031781 (2018).
- Kawata, K., Tierney, R., Langford, D. Blood and cerebrospinal fluid biomarkers. Handbook of Clinical Neurology. 158, 217-233 (2018).
- Zhao, Q. P., et al. Protective effects of dehydrocostuslactone on rat hippocampal slice injury induced by oxygen-glucose deprivation/reoxygenation. International Journal of Molecular Medicine. 42 (2), 1190-1198 (2018).
- Wang, X. B. . Protective effects of dehydrocostuslactone on oxygen-glucose deprivation injury in rat hippocampal slices. , (2017).
- Coimbra-Costa, D., Alva, N., Duran, M., Carbonell, T., Rama, R. Oxidative stress and apoptosis after acute respiratory hypoxia and reoxygenation in rat brain. Redox Biology. 12, 216-225 (2017).
- Liu, H. Y., Chou, K. H., Chen, W. T. Migraine and the Hippocampus. Current Pain and Headache Reports. 22 (2), 13 (2018).
- Toda, T., Parylak, S. L., Linker, S. B., Gage, F. H. The role of adult hippocampal neurogenesis in brain health and disease. Molecular Psychiatry. 24 (1), 67-87 (2019).
- Wang, P., Lo Cascio, F., Gao, J., Kayed, R., Huang, X. F., F, X. Binding and neurotoxicity mitigation of toxic tau oligomers by synthetic heparin like oligosaccharides. Chemical Communications. 54 (72), 10120-10123 (2018).
- Han, J. Y., Li, Q., Ma, Z. Z., Fan, J. Y. Effects and mechanisms of compound Chinese medicine and major ingredients on microcirculatory dysfunction and organ injury induced by ischemia/reperfusion. Pharmacology & Therapeutics. 177, 146-173 (2017).
- Peng, T. M., et al. Anti-inflammatory effects of traditional Chinese medicines on preclinical in vivo models of brain ischemia-reperfusion-injury: Prospects for neuroprotective drug discovery and therapy. Frontiers in Pharmacology. 10, 204 (2019).
- König, M., Thinnes, A., Klein, J. Microdialysis and its use in behavioural studies: Focus on acetylcholine. Journal of Neuroscience Methods. 300, 206-215 (2018).
- Liu, M. Z., Wang, P., Yu, X. M., Dong, G. C., Yue, J. Intracerebral microdialysis coupled to LC-MS/MS for the determination tramadol and its major pharmacologically active metabolite O-desmethyltramadol in rat brain microdialysates. Drug Testing and Analysis. 9 (8), 1243-1250 (2017).
- de Lima Oliveira, M., et al. Cerebral microdialysis in traumatic brain injury and subarachnoid hemorrhage: state of the art. Neurocritical Care. 21 (1), 152-162 (2014).
- Amiridze, N., Dang, Y., Brown, O. R. Hydroxyl radicals detected via brain microdialysis in rats breathing air and during hyperbaric oxygen convulsions. Redox Report. 4 (4), 165-170 (1999).
- Chang, H. Y., Morrow, K., Bonacquisti, E., Zhang, W., Shah, D. K. Antibody pharmacokinetics in rat brain determined using microdialysis. MABS. 10 (6), 843-853 (2018).
- Wan, H. Y., et al. Pharmacokinetics of seven major active components of Mahuang decoction in rat blood and brain by LC-MS/MS coupled to microdialysis sampling. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 393 (8), 1559-1571 (2020).
- Zheng, H. Z., et al. Pharmacokinetic analysis of Huangqi Guizhi Wuwu decoction on blood and brain tissue in rats with normal and cerebral ischemia-reperfusion Injury by microdialysis with HPLC-MS/MS. Drug Design Development and Therapy. 14, 2877-2888 (2020).
- Bongaerts, J., et al. Sensitive targeted methods for brain metabolomic studies in microdialysis samples. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 161, 192-205 (2018).
- Zhang, Y. Q., Jiang, N., Yetisen, A. K. Brain neurochemical monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 189, 113351 (2021).
