Generazione di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo sane e specifiche per malattie retiniche
Summary
Questo protocollo descrive un metodo efficiente per differenziare le hiPSC in cluster di campi oculari e generare organoidi neuro-retinici utilizzando condizioni di coltura semplificate che coinvolgono sia sistemi di coltura aderenti che in sospensione. Altri tipi di cellule oculari, come l’RPE e l’epitelio corneale, possono anche essere isolati dai campi oculari maturi nelle colture retiniche.
Abstract
Le cellule staminali pluripotenti possono generare organoidi tissutali complessi che sono utili per studi di modellizzazione di malattie in vitro e per lo sviluppo di terapie rigenerative. Questo protocollo descrive un metodo più semplice, robusto e graduale per generare organoidi retinici in un sistema di coltura ibrido costituito da colture monostrato aderenti durante le prime 4 settimane di differenziazione retinica fino alla comparsa di cluster primordiali del campo oculare distinti e auto-organizzati (EFP). Inoltre, le isole neuroretiniche a forma di ciambella, circolari e traslucide all’interno di ciascun EFP vengono raccolte manualmente e coltivate sotto sospensione utilizzando piatti di coltura non aderenti in un mezzo di differenziazione retinica per 1-2 settimane per generare coppette ottiche 3D multistrato (OC-1M). Questi organoidi retinici immaturi contengono PAX6+ e ChX10+ proliferanti, precursori retinici multipotenti. Le cellule precursori sono linearmente auto-assemblate all’interno degli organoidi e appaiono come striature radiali distinte. A 4 settimane dalla coltura in sospensione, i progenitori retinici subiscono l’arresto post-mitotico e la differenziazione del lignaggio per formare organoidi retinici maturi (OC-2M). I precursori impegnati nella linea fotorecettoriale si sviluppano all’interno degli strati più esterni degli organoidi retinici. Queste cellule fotorecettrici CRX+ e RCVRN+ maturano morfologicamente per mostrare estensioni simili a segmenti interni. Questo metodo può essere adottato per generare organoidi retinici utilizzando cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Tutti i passaggi e le procedure sono chiaramente spiegati e dimostrati per garantire la replicabilità e per applicazioni più ampie nella scienza di base e nella ricerca traslazionale.
Introduction
La retina è un tessuto sensibile alla luce presente nella parte posteriore dell’occhio vertebrato che converte i segnali luminosi in impulsi nervosi da un fenomeno biochimico noto come via di foto-trasduzione. Gli impulsi nervosi iniziali generati nelle cellule fotorecettrici della retina vengono trasdotti ad altri interneuroni retinici e cellule gangliari retiniche (RGC) e raggiungono la corteccia visiva del cervello, che aiuta nella percezione dell’immagine e nella risposta visiva.
Secondo l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), circa 1,5 milioni di bambini sono ciechi, di cui 1 milione in Asia. La distrofia retinica ereditaria (IRD) è una delle principali malattie accecanti che colpisce 1 individuo su 4.000 in tutto il mondo 1,2,3, mentre la prevalenza della cecità associata alla degenerazione maculare legata all’età (AMD) varia dallo 0,6% all’1,1% nei paesi in via di sviluppo 4. Le IRD sono causate da difetti genetici ereditari in oltre 300 diversi geni coinvolti nello sviluppo e nella funzione retinica5. Tali cambiamenti genetici provocano l’interruzione delle normali funzioni retiniche e la graduale degenerazione delle cellule retiniche, vale a dire le cellule fotorecettrici e l’epitelio pigmentato retinico (RPE), portando così a gravi perdite della vista e cecità. Sono stati fatti enormi progressi in altre condizioni di accecamento che coinvolgono la cornea, il cristallino, ecc. Tuttavia, le distrofie retiniche e le atrofie del nervo ottico non hanno alcuna terapia comprovata fino ad oggi. Poiché una retina umana adulta non dispone di cellule staminali6, fonti alternative come le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte derivate dal paziente (iPSC) possono fornire una fornitura illimitata dei tipi di cellule desiderati e sono molto promettenti per lo sviluppo di organoidi tissutali complessi necessari per studi di modellizzazione di malattie in vitro e per lo sviluppo di terapie rigenerative7, 8,9,10.
Diversi anni di ricerca sulla retina hanno portato a una migliore comprensione degli eventi molecolari che orchestrano lo sviluppo precoce della retina. La maggior parte dei protocolli per generare cellule retiniche e organoidi 3D da PSC mirano a ricapitolare questi eventi di sviluppo in vitro, coltivando le cellule in un complesso cocktail di fattori di crescita e piccole molecole per modulare i processi biologici noti in modo graduale. Gli organoidi retinici così generati sono costituiti dalle principali cellule retiniche: cellule gangliari retiniche (RGC), interneuroni, fotorecettori ed epitelio pigmentato retinico (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. Nonostante i tentativi riusciti di modellare gli IRD utilizzando organoidi retinici, la necessità del complesso cocktail di fattori di crescita e piccole molecole durante la differenziazione e l’efficienza relativamente bassa della generazione di organoidi retinici rappresenta una sfida importante per la maggior parte dei protocolli. Includono principalmente la formazione di corpi embrioidi, seguita dalla loro differenziazione graduale in linee retiniche utilizzando condizioni di coltura complesse in diversi stadi di sviluppo in vitro 20,21,22.
Qui, viene riportato un metodo semplificato e robusto per sviluppare organoidi neuro-retinici 3D complessi da hiPSC di controllo sano e specifiche per malattie retiniche. Il protocollo qui descritto utilizza la differenziazione diretta di colture hiPSC quasi confluenti senza bisogno di formazione di corpi embrioidi. Inoltre, la complessità del terreno di coltura è semplificata, rendendolo una tecnica economica e riproducibile che può essere facilmente adottata dai nuovi ricercatori. Si tratta di un sistema di coltura ibrido costituito da colture monostrato aderenti durante le prime 4 settimane di differenziazione retinica fino alla comparsa di cluster primordiali del campo oculare distinti e auto-organizzati (EFP). Inoltre, le isole neuroretiniche circolari all’interno di ciascun EFP vengono raccolte manualmente e coltivate in colture in sospensione per 1-2 settimane per preparare coppe retiniche 3D multistrato o organoidi costituiti da precursori neuro-retinici proliferanti PAX6+ e CHX10+. La coltura estesa di organoidi retinici in terreno contenente taurina da 100 μM per ulteriori 4 settimane ha portato alla comparsa di precursori dei fotorecettori RCVRN+ e CRX+ e cellule mature con estensioni rudimentali simili a segmenti interni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le hiPSC sono un potente strumento per studiare lo sviluppo di organi e tessuti in vitro. Ricapitolare il fenotipo della malattia differenziando le hiPSC sane rispetto a quelle specifiche della malattia verso la linea retinica può aiutare a ottenere nuove conoscenze sulla fisiopatologia di diverse forme di distrofie retiniche ereditarie. Diversi protocolli sono stati descritti e adottati per la differenziazione in vitro delle PSC in tipi di cellule retiniche. La maggior parte di essi prevede l’uso di t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il supporto scientifico e tecnico del Dr. Chitra Kannabiran, genetista; Dr. Subhadra Jalali, consulente della retina; Dr. Milind Naik, chirurgo oculoplastico; e il Dr. Swathi Kaliki, oncologo oculare presso il LV Prasad Eye Institute, Hyderabad verso la generazione di linee iPSC normali e specifiche per il paziente. Gli autori riconoscono le sovvenzioni di ricerca e sviluppo del Science and Engineering Research Board, Department of Science and Technology (IM), (SB/SO/HS/177/2013), Department of Biotechnology (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019) e Senior Research Fellowships di ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) e CSIR (V.K.P.), Government of India.
Materials
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
References
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