יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.
Abstract
תאי גזע פלוריפוטנטיים יכולים לייצר אורגנואידים מורכבים של רקמות השימושיים למחקרי מודלים של מחלות חוץ גופיות ולפיתוח טיפולים רגנרטיביים. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה, חזקה ומדורגת יותר ליצירת אורגנואידים ברשתית במערכת תרבית היברידית המורכבת מתרביות חד-שכבתיות דבקות במהלך 4 השבועות הראשונים של התמיינות הרשתית עד להופעתם של אשכולות קדמוניים מובהקים של שדה העין (EFPs) המאורגנים באופן עצמאי. יתר על כן, האיים הנוירו-רשתיים בצורת סופגנייה, עגולים ושקופים בתוך כל EFP נקטפים ידנית ומתורבתים תחת תרחיף באמצעות צלחות תרבית לא דבקות במדיום התמיינות רשתית למשך 1-2 שבועות כדי ליצור כוסות אופטיות תלת-ממדיות רב-שכבתיות (OC-1M). אורגנואידים לא בשלים אלה ברשתית מכילים PAX6+ ו-ChX10+ מתרבים ומבשרי רשתית רב-עוצמה. התאים המקדימים מורכבים באופן ליניארי בתוך האורגנואידים ומופיעים כפסיעות רדיאליות נפרדות. לאחר 4 שבועות לאחר תרבית התרחיף, אבות הרשתית עוברים דום פוסט-מיטוטי והתמיינות שושלת ליצירת אורגנואידים רשתית בוגרים (OC-2M). שושלת קולטני האור מתפתחת בתוך השכבות החיצוניות ביותר של אורגנואידים ברשתית. תאים קולטי אור CRX+ ו-RCVRN+ אלה בשלים מורפולוגית כדי להציג הרחבות פנימיות דמויות סגמנט. ניתן לאמץ שיטה זו ליצירת אורגנואידים ברשתית באמצעות תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). כל השלבים והנהלים מוסברים ומודגמים בבירור כדי להבטיח שכפול וליישומים רחבים יותר במדע בסיסי ובמחקר תרגומי.
Introduction
הרשתית היא רקמה רגישה לאור הנמצאת בחלק האחורי של עין החוליות הממירה אותות אור לדחפים עצביים על ידי תופעה ביוכימית הידועה בשם מסלול פוטו-טרנסדוקציה. הדחפים העצביים הראשוניים הנוצרים בתאי הפוטורצפטור של הרשתית מתומרמים לתאי עצב אחרים ברשתית ולתאי גנגליון ברשתית (RGCs) ומגיעים לקליפת המוח הראייתית, המסייעת בתפיסת תמונה ובתגובה חזותית.
על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), כ -1.5 מיליון ילדים עיוורים, מתוכם מיליון באסיה. ניוון רשתית תורשתי (IRD) היא מחלה מסנוורת חמורה הפוגעת ב-1 מכל 4,000 אנשים ברחבי העולם בגילאי 1,2,3, בעוד ששכיחות העיוורון הקשור לניוון מקולרי תלוי גיל (AMD) נעה בין 0.6%-1.1% במדינות מתפתחות4. IRDs נגרמים על ידי פגמים גנטיים תורשתיים ביותר מ -300 גנים שונים המעורבים בהתפתחות הרשתית ותפקוד5. שינויים גנטיים כאלה גורמים לשיבוש תפקודי הרשתית התקינים ולניוון הדרגתי של תאי הרשתית, כלומר תאי קולטני האור והאפיתל הפיגמנטי ברשתית (RPE), ובכך מובילים לאובדן ראייה חמור ולעיוורון. התקדמות עצומה הושגה במצבים מסנוורים אחרים המערבים את הקרנית, העדשה וכו’. עם זאת, ניוון רשתית וניוון עצב הראייה אין כל טיפול מוכח עד כה. מכיוון שלרשתית אנושית בוגרת אין תאי גזע6, מקורות חלופיים כגון תאי גזע עובריים (ESC) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם במטופל (iPSCs) יכולים לספק אספקה בלתי מוגבלת של סוגי תאים רצויים וטומנים בחובם הבטחה גדולה לפיתוח אורגנואידים מורכבים של רקמות הדרושות למחקרי מידול מחלות חוץ גופיות ולפיתוח טיפולים רגנרטיביים7, 8,9,10.
מספר שנים של מחקר רשתית הובילו להבנה טובה יותר של אירועים מולקולריים המתזמרים התפתחות רשתית מוקדמת. רוב הפרוטוקולים ליצירת תאי רשתית ואורגנואידים תלת-ממדיים מ-PSCs שואפים לשחזר אירועים התפתחותיים אלה במבחנה, על ידי תרבית התאים בקוקטייל מורכב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות כדי לווסת את התהליכים הביולוגיים הידועים באופן מדורג. אורגנואידי הרשתית הנוצרים כך מורכבים מתאי רשתית עיקריים: תאי גנגליון רשתית (RGCs), אינטרנוירונים, פוטורצפטורים ואפיתל פיגמנטי ברשתית (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. למרות ניסיונות מוצלחים למדל IRDs באמצעות אורגנואידים ברשתית, הדרישה לקוקטייל המורכב של גורמי גדילה ומולקולות קטנות במהלך התמיינות והיעילות הנמוכה יחסית של יצירת אורגנואידים ברשתית מציבה אתגר גדול ברוב הפרוטוקולים. הם כוללים בעיקר היווצרות של גופים עובריים, ולאחר מכן התמיינות מדורגת שלהם לשושלות רשתית באמצעות תנאי תרבית מורכבים בשלבים שונים של התפתחות חוץ גופית 20,21,22.
כאן מדווחת שיטה פשוטה וחזקה לפיתוח אורגנואידים נוירו-רשתית תלת-ממדיים מורכבים מבקרה בריאה ו-hiPSCs ספציפיים למחלות רשתית. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בהבחנה ישירה של תרביות hiPSC כמעט משתלבות ללא צורך בהיווצרות גוף עוברי. כמו כן, המורכבות של מדיום התרבות היא פשוטה יותר, מה שהופך אותו טכניקה חסכונית לשחזור שניתן לאמץ בקלות על ידי חוקרים חדשים. היא כוללת מערכת תרבית היברידית המורכבת מתרביות חד-שכבתיות דבקות במהלך 4 השבועות הראשונים של התמיינות הרשתית עד להופעתם של אשכולות קדמוניים מובהקים של שדה עיניים (EFPs) המאורגנים בעצמם. יתר על כן, האיים הנוירו-רשתית המעגליים בתוך כל EFP נקטפים ידנית ומגודלים בתרביות תרחיף במשך 1-2 שבועות כדי להכין גביעי רשתית תלת-ממדיים רב-שכבתיים או אורגנואידים המורכבים ממבשרי נוירו-רשתית מתרבים PAX6+ ו-CHX10+ . תרבית ממושכת של אורגנואידים ברשתית בתווך המכיל טאורין של 100 מיקרומטר למשך 4 שבועות נוספים הביאה להופעתם של מבשרי קולטני אור RCVRN + ו-CRX+ ותאים בוגרים עם שלוחות בסיסיות דמויות מקטע פנימי.
Protocol
Representative Results
Discussion
hiPSCs הם כלי רב עוצמה לחקר התפתחות איברים ורקמות במבחנה. שחזור פנוטיפ המחלה על ידי הבחנה בין hiPSCs בריאים לעומת ספציפיים למחלה לכיוון שושלת הרשתית יכול לעזור בהשגת תובנות חדשות יותר על הפתופיזיולוגיה של צורות שונות של ניוון רשתית תורשתי. מספר פרוטוקולים תוארו ואומצו להתמיינות חוץ גופ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים על התמיכה המדעית והטכנית של ד”ר צ’יטרה קנאבירן, גנטיקאית; ד”ר סובהדרה ג’לאלי, יועצת רשתית; ד”ר מילינד נאיק, כירורג אוקולופלסטי; וד”ר סוואתי קליקי, אונקולוג עיניים במכון העיניים LV Prasad, היידראבאד לקראת יצירת קווי iPSC נורמליים וספציפיים למטופל. המחברים מודים על מענקי המו”פ של מועצת המחקר למדע והנדסה, המחלקה למדע וטכנולוגיה (IM), (SB/SO/HS/177/2013), המחלקה לביוטכנולוגיה (IM), (BT/PR32404/MED/30/2136/2019), ומלגות מחקר בכירות מ- ICMR (S.M., D.P.), UGC (T.A.) ו- CSIR (V.K.P.), ממשלת הודו.
Materials
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
References
- Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
- Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
- . RetNet – Retinal Information Network Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022)
- Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
- Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
- Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
- Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
- Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
- Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
- Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
- Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
