Анализ флуоресценции кальция с двойным добавлением для высокопроизводительного скрининга рекомбинантных рецепторов, связанных с G-белком
Summary
В этой работе описан высокопроизводительный внутриклеточный флуоресцентный анализ кальция для 384-луночных пластин для скрининга библиотек малых молекул на рекомбинантных рецепторах, связанных с G-белком (GPCR). Мишень, рецептор кинина от клеща лихорадки крупного рогатого скота, Rhipicephalus microplus, экспрессируется в клетках CHO-K1. Этот анализ идентифицирует агонисты и антагонисты, используя одни и те же клетки в одном анализе «двойного добавления».
Abstract
Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), представляют собой крупнейшее надсемейство рецепторов и являются мишенями многочисленных лекарств человека. Высокопроизводительный скрининг (HTS) случайных библиотек малых молекул против GPCR используется фармацевтической промышленностью для обнаружения целевых лекарств. В этом исследовании HTS был использован для идентификации новых низкомолекулярных лигандов специфических для беспозвоночных нейропептидных GPCR в качестве зондов для физиологических исследований векторов смертельных человеческих и ветеринарных патогенов.
Специфический для беспозвоночных рецептор кинина был выбран в качестве мишени, потому что он регулирует многие важные физиологические процессы у беспозвоночных, включая диурез, питание и пищеварение. Кроме того, фармакология многих беспозвоночных GPCR плохо характеризуется или не характеризуется вообще; таким образом, дифференциальная фармакология этих групп рецепторов по отношению к родственным GPCR у других метазоанов, особенно у людей, добавляет знания о структурно-активных отношениях GPCR как надсемейства. Анализ HTS был разработан для клеток в 384-луночных пластинах для открытия лигандов рецептора кинина от клеща лихорадки крупного рогатого скота или южного клеща крупного рогатого скота, Rhipicephalus microplus. Рецептор клещевого кинина стабильно экспрессировался в клетках CHO-K1.
Рецептор кинина при активации эндогенными нейропептидами кинина или другими агонистами малых молекул вызывает высвобождение Ca2+ из запасов кальция в цитоплазму. Этот анализ флуоресценции кальция в сочетании с подходом «двойного добавления» может обнаруживать функциональные агонисты и антагонисты, «поражающие» молекулы в одной и той же пластине анализа. Каждый анализ проводился с использованием лекарственных пластин, несущих массив из 320 случайных малых молекул. Был получен надежный Z’-фактор 0,7, и три молекулы агониста и два антагониста были идентифицированы, когда HTS находился в конечной концентрации 2 мкМ. Анализ флуоресценции кальция, представленный здесь, может быть адаптирован для скрининга других GPCR, которые активируют сигнальный каскад Ca2+ .
Introduction
Рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), которые присутствуют от дрожжей к человеку, представляют собой крупнейшее надсемейство рецепторов во многих организмах1. Они играют решающую роль в регулировании почти всех биологических процессов у животных. В геноме членистоногих насчитывается 50-200 GPCR, что означает, что они представляют собой самое большое надсемейство мембранных рецепторов2. Они классифицируются на шесть основных классов, A-F, на основе их сходства последовательностей и функций3. GPCR трансдуцируют различные внеклеточные сигналы, такие как гормоны, нейропептиды, биогенные амины, глутамат, протон, липогликопротеины и фотоны4. GPCR соединяются с гетеротримерными G-белками (Gα, Gβ и Gγ) для передачи последующих сигналов. GPCR в сочетании с белками Gαs или Gαi/o увеличивают или уменьшают, соответственно, внутриклеточные 3′, 5′-циклические уровни аденозинмонофосфата (цАМФ) путем активации или ингибирования аденилциклазы. GPCR, связанные с Gαq/11, индуцируют высвобождение кальция из эндоплазматических ретикулумных запасов кальция путем активации пути фосфолипазы C (PLC)-инозитол-1,4,5-трифосфата (IP3). GPCR в сочетании с Gα12/13 активируют RhoGTPase нуклеотидные обменные факторы 5,6. GPCR являются мишенью более 50% лекарств для человека и акарицида, амитраза4. Поскольку GPCR передают такие разнообразные сигналы, они являются многообещающими целями для разработки новых пестицидов, которые нарушают физиологические функции, специфичные для беспозвоночных.
Целью HTS является идентификация пораженных молекул, которые могут модулировать функции рецепторов. HTS включает в себя разработку анализов, миниатюризацию и автоматизацию7. Членистоногие нейропептидные GPCR участвуют в большинстве физиологических функций, таких как развитие, линька и экдиз, экскреция, мобилизация энергии и размножение4. Большинство нейропептидных GPCR членистоногих и метазоев сигнализируют через кальциевый сигнальный каскад 2,6,8,9,10, например, в миоингибиторных пептидных и SIFамидных рецепторах черноногих клещей Ixodes scapularis; их лиганды антагонистичны в анализах моторики задней кишки, при этом SIF вызывает сокращение, а MIP ингибирует его11,12. NPY-подобный рецептор комара желтой лихорадки, Aedes aegypti, регулирует женщину-хозяина, ищущего13. По сравнению с другими альтернативными анализами мобилизации кальция, такими как анализ биолюминесценции кальция экворина14, анализ флуоресценции кальция прост в выполнении, не требует трансфекции других рекомбинантных белков, обнаруживающих кальций, и является экономически эффективным. Анализ флуоресценции кальция дает пролонгированный сигнал по сравнению с быстрым кинетическим сигналом, полученным в анализе биолюминесценции кальция экворина14,15.
В приведенном здесь примере кининовый рецептор от клеща лихорадки крупного рогатого скота, Rhipicephalus microplus, был рекомбинантно экспрессирован в клеточной линии CHO-K1 и использовался для анализа флуоресценции кальция. Существует только один ген рецептора кинина, обнаруженный в R. microplus; рецептор сигнализирует через Gq белок-зависимый сигнальный путь и запускает отток Ca2+ из запасов кальция во внутриклеточное пространство16. Этот процесс может быть обнаружен и количественно определен флуорофором, который вызывает флуоресцентный сигнал при связывании ионов кальция (рисунок 1).
Кининовый рецептор представляет собой специфический для беспозвоночных GPCR, который относится к родопсиноподобным рецепторам класса А. Кинин является древним сигнальным нейропептидом, который присутствует в моллюсках, ракообразных, насекомых и акари 4,17,18. У колеоптерянов (жуков) отсутствует кининовая сигнальная система; у комара Aedes aegypti есть только один рецептор кинина, который связывает три эдескинина, в то время как Drosophila melanogaster имеет один рецептор кинина с дросокинином в качестве уникального лиганда 19,20,21. У позвоночных нет гомологичных кининов или кининовых рецепторов. Хотя точная функция кинина у клещей неизвестна, у женщин R. microplus, заглушенных рецептором RNAi, значительно снижается репродуктивная пригодность22. Кинины являются плеотропными пептидами у насекомых. У Drosophila melanogaster они участвуют как в центральной, так и в периферической нервной регуляторной системах23, преэкдисисе24, питании25,метаболизме 26 и паттернах активности сна 26,27, а также личиночной локомоции28. Кинины регулируют сокращение задней кишки, диурез и питание у комара A. aegypti 29,30,31. Кининовые пептиды имеют законсервированный С-концевой пентапептид Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH2, который является минимально необходимой последовательностью для биологической активности32. Специфичность членистоногих, малый размер эндогенного лиганда, который делает их поддающимися низкомолекулярной интерференции, и плейотропные функции у насекомых делают кининовый рецептор перспективной мишенью для борьбы с вредителями4.
Анализ «двойного сложения» (рисунок 2) позволяет идентифицировать агонисты или антагонисты в том же анализе HTS15. Он адаптирован из анализа «двойного добавления», который обычно используется в фармацевтической промышленности для открытия лекарств33. Короче говоря, первое добавление лекарств в клеточную пластину позволяет идентифицировать потенциальные агонисты в химической библиотеке при обнаружении более высокого флуоресцентного сигнала по сравнению с применением контроля растворителя. После 5 мин инкубации с этими небольшими молекулами на все скважины наносится известный агонист (кининовый пептид). Те скважины, которые случайным образом получили антагонист из лекарственной пластины, показывают более низкий флуоресцентный сигнал при добавлении агониста по сравнению с контрольными лунками, которые получили растворитель при первом добавлении. Этот анализ позволяет идентифицировать потенциальные агонисты и антагонисты с одними и теми же клетками. В стандартном проекте HTS эти пораженные молекулы будут дополнительно проверены с помощью анализов «доза-реакция» и дополнительных анализов биологической активности, которые здесь не показаны.
Рисунок 1: Иллюстрация механизма анализа флуоресценции кальция. Белок Gq запускает внутриклеточный сигнальный путь кальция. Рецептор кинина (рецептор, связанный с G-белком) был рекомбинантно экспрессирован в клетках CHO-K1. Когда лиганд агониста связывается с рецептором, белок Gq, связанный с рецептором кинина, активирует PLC, который катализирует превращение молекулы PIP2 в IP3 и DAG. Затем IP3 связывается с IP3R на поверхности эндоплазматического ретикулума, что приводит к высвобождению Ca2+ в цитоплазму, где ионы Ca2+ связываются с флуорофорами и вызывают флуоресцентный сигнал. Флуоресцентный сигнал может быть получен возбуждением при 490 нм и обнаружен при 514 нм. Сокращения: GPCR = рецептор, связанный с G-белком; PLC = фосфолипаза C; PIP2 = фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат; IP3 = инозитолтрисфосфат; DAG = диацилглицерин; IP3R = IP3 рецептор. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Рабочий процесс для высокопроизводительного скрининга малых молекул на рецепторе, связанном с G-белком, экспрессируемом в клетках CHO-K1. (A) Рекомбинантные клетки CHO-K1, стабильно экспрессирующие рецептор кинина, добавляли к 384-луночной пластине (10 000 клеток/лунка) с помощью жидкостной системы обработки (25 мкл/лунка) и инкубировали в увлажненном инкубатореCO2 в течение 12-16 ч. (B) ) Буфер анализа, содержащий флуоресцентный краситель (25 мкл/лунка), добавляли в клеточную пластину с помощью системы обработки жидкости. Пластину инкубировали в течение 30 мин при 37 °C в течение 30 мин и уравновешивали при RT еще 30 мин. (C) Фоновый флуоресцентный сигнал клеток в каждой скважине измеряли с помощью пластинчатого считывателя. (D) Растворы лекарственных средств из 384-луночной библиотечной пластины и пустого растворителя (все при 0,5 мкл/лунку) добавляли в пластину клеточного анализа с использованием системы обработки жидкости. (E) Клеточные реакции флуоресценции кальция измеряли с помощью считывателя пластин сразу после добавления растворов лекарственного средства; соединение (соединения), вызывающее сигналы флуоресценции выше среднего, были выбраны в качестве агониста удара (ударов). Удары антагониста, блокирующие GPCR (значок ниже), были выявлены после добавления агониста пептидов во время шага G. (F) В той же пробирной пластине после 5 мин инкубации клеток с экранирующими соединениями к каждой лунке добавляли эндогенный агонистический пептид Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) клещевого кининового рецептора (1 мкМ). (G) Клеточные флуоресцентные реакции после добавления агониста пептида немедленно измерялись считывателем пластин. Соединение(я), ингибирующее флуоресцентный сигнал, было выбрано в качестве удара(ов) антагониста. Сокращения: GPCR = рецептор, связанный с G-белком; RT = комнатная температура; РФС = относительные единицы флуоресценции. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целью HTS является идентификация пораженных молекул путем скрининга огромного количества малых молекул. Поэтому результаты этого примера представляют собой лишь небольшую часть обычного эксперимента HTS. Кроме того, идентифицированные пораженные молекулы должны быть проверены в после…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана премией USDA-NIFA-AFRI Animal Health and Well-Being Award (Номер награды 2022-67015-36336, PVP [Директор проекта]) и конкурсными фондами из Техасской программы грантов A&M AgriLife Research Insect Vector Diseases (FY’22-23) P.V.P. Группа преподавателей A.W.E.S.O.M.E. Колледжа сельского хозяйства и наук о жизни, TAMU, признана за помощь в редактировании рукописи. Дополнительная таблица S2 содержит данные из собственной, случайной, низкомолекулярной библиотеки, полученной из лаборатории доктора Джеймса Саккеттини в Техасском университете A & M и Texas A & M AgriLife Research.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco Invitrogen | 15050-065 | with phenol red |
| 0.4% trypan blue | MilliporeSigma | T8154 | liquid, sterile |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher | AM12400 | RNase-free Microfuge Tubes |
| 5 mL serological pipette | Corning | 29443-045 | Corning Costar Stripette individually wrapped |
| 10 mL serological pipette | Corning | 29443-047 | Corning Costar Stripette individually wrapped |
| 15 mL conical tubes | Falcon | 352196 | sterile |
| 20 µL filter tips | USA Scientifc Inc. | P1121 | sterile, barrier |
| 25 mL serological pipette | Corning | 29443-049 | Corning Costar Stripette individually wrapped |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430828 | graduated, sterile |
| 150 mL auto-friendly reservior | Integra Bioscience | 6317 | sterile, individually wrapped for cell seeding in day 1 |
| 150 mL auto-friendly reservior | Integra Bioscience | 6318 | sterile, stacked, for loading dye in day 2 |
| 384/ 12.5 µL low retention tips | Integra Bioscience | 6405 | long, sterile filter |
| 384/ 12.5 µL tips | Integra Bioscience | 6404 | long, sterile filter |
| 384-well plate | Greiner | 781091 | CELLSTAR, clear polystyrene, µClear, Black/Flat |
| Aluminum plate seals | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | polyester-based |
| Aluminum foil wrap | Walmart | ||
| Biosafty cabinet II | NuAire | NU-540-300 | |
| Cell counter | Nexcelom | AutoT4 | |
| cell counting slides | Nexcelom | SD-100 | 20 µL chamber |
| CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Forma Series II | |
| Desk Lamp | SunvaleeyTEK | RS1000B | |
| Dimethyl sulfoxide | MilliporeSigma | 276855 | anhydous, >99.9% |
| Drug plate | Corning | 3680 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CV | DPBS, 1x without calcium amd magnesium |
| Ethanol | Koptec | 2000 | |
| F-12K Nutrient Mixture | Corning | 45000-354 | (Kaighn's Mod.) with L-glutamine |
| Fetal bovine serum | Equitech-Bio | SFBU30 | |
| Fluorescent calcium assay kit | ENZO Lifescience | ENZ-51017 | 10×96 tests |
| G418 sulfate | Gibco Invitrogen | 10131-027 | Geneticin selective antibiotic 50 mg/mL |
| Hank's buffer | MilliporeSigma | 55037C | HBSS modified, with calcium, with magnesium, without phenol read |
| HEPES buffer | Gibco Invitrogen | 15630-080 | 1 Molar |
| HTS data storage plateform | CDD vault | https://www.collaborativedrug.com/ | |
| Liquid handling system | Integra Bioscience | Viaflo | 384/12.5 µL |
| Plate centrifuge | Thermo Fisher | Sorvall ST8 | |
| Plate reader | BMG technology | Clariostar | |
| Poly-D-lysine | MilliporeSigma | P6407 | |
| Rhimi-K-1 agonist peptide | Genscript | custom order | QFSPWGamide |
| T-75 flask | Falcon | 353136 |
References
- Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling – A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
- Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S. G-protein coupled receptors (GPCRs) in insects-A potential target for new insecticide development. Molecules. 26 (10), 2993 (2021).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 639-650 (2002).
- Pietrantonio, P. V., Xiong, C., Nachman, R. J., Shen, Y. G protein-coupled receptors in arthropod vectors: Omics and pharmacological approaches to elucidate ligand-receptor interactions and novel organismal functions. Current Opinion in Insect Science. 29, 12-20 (2018).
- Hilger, D., Masureel, M., Kobilka, B. K. Structure and dynamics of GPCR signaling complexes. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (1), 4-12 (2018).
- Liu, N., Wang, Y., Li, T., Feng, X. G-protein coupled receptors (GPCRs): Signaling pathways, characterization, and functions in insect physiology and toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (10), 5260 (2021).
- Hansen, K. B., Bräuner-Osborne, H., Leifert, W. FLIPR® assays of intracellular calcium in GPCR drug discovery. G Protein-Coupled Receptors in Drug Discovery. , (2009).
- Bauknecht, P., Jekely, G. Large-scale combinatorial deorphanization of Platynereis neuropeptide GPCRs. Cell Reports. 12 (4), 684-693 (2015).
- Frooninckx, L., et al. Neuropeptide GPCRs in C. elegans. Frontiers in Endocrinology. 3, 167 (2012).
- Caers, J., et al. More than two decades of research on insect neuropeptide GPCRs: An overview. Frontiers in Endocrinology. 3, 151 (2012).
- Šimo, L., Koči, J., Park, Y. Receptors for the neuropeptides, myoinhibitory peptide and SIFamide, in control of the salivary glands of the blacklegged tick Ixodes scapularis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (4), 376-387 (2013).
- Šimo, L., Park, Y. Neuropeptidergic control of the hindgut in the black-legged tick Ixodes scapularis. International Journal for Parasitology. 44 (11), 819-826 (2014).
- Liesch, J., Bellani, L. L., Vosshall, L. B. Functional and genetic characterization of neuropeptide Y-like receptors in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (10), 2486 (2013).
- Lu, H. L., Kersch, C. N., Taneja-Bageshwar, S., Pietrantonio, P. V. A calcium bioluminescence assay for functional analysis of mosquito (Aedes aegypti) and tick (Rhipicephalus microplus) G protein-coupled receptors. Journal of Visualized Experiments. (50), e2732 (2011).
- Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. The cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, as a model for forward pharmacology to elucidate kinin GPCR function in the Acari. Frontiers in Physiology. 10, 1008 (2019).
- Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12 (1), 27-38 (2003).
- Cox, K. J., et al. Cloning, characterization, and expression of a G-protein-coupled receptor from Lymnaea stagnalis and identification of a leucokinin-like peptide, PSFHSWSamide, as its endogenous ligand. Journal of Neuroscience. 17 (4), 1197-1205 (1997).
- Dircksen, H., Kastin, A. J. Chapter 32 – Crustacean bioactive peptides. Handbook of Biologically Active Peptides (Second Edition). , 209-221 (2013).
- Halberg, K. A., Terhzaz, S., Cabrero, P., Davies, S. A., Dow, J. A. Tracing the evolutionary origins of insect renal function. Nature Communications. 6, 6800 (2015).
- Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14 (1), 55-67 (2005).
- Radford, J. C., Davies, S. A., Dow, J. A. Systematic G-protein-coupled receptor analysis in Drosophila melanogaster identifies a leucokinin receptor with novel roles. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38810-38817 (2002).
- Brock, C. M., et al. The leucokinin-like peptide receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is localized in the midgut periphery and receptor silencing with validated double-stranded RNAs causes a reproductive fitness cost. International Journal for Parasitology. 49 (3-4), 287-299 (2019).
- Nässel, D. R. Leucokinin and associated neuropeptides regulate multiple aspects of physiology and behavior in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1940 (2021).
- Kim, Y. -. J., et al. Central peptidergic ensembles associated with organization of an innate behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14211-14216 (2006).
- Al-Anzi, B., et al. The leucokinin pathway and its neurons regulate meal size in Drosophila. Current Biology. 20 (11), 969-978 (2010).
- Yurgel, M. E., et al. A single pair of leucokinin neurons are modulated by feeding state and regulate sleep-metabolism interactions. PLoS Biology. 17 (2), 2006409 (2019).
- Nässel, D. R., Zandawala, M. Recent advances in neuropeptide signaling in Drosophila, from genes to physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 179, 101607 (2019).
- Okusawa, S., Kohsaka, H., Nose, A. Serotonin and downstream leucokinin neurons modulate larval turning behavior in Drosophila. Journal of Neuroscience. 34 (7), 2544-2558 (2014).
- Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding. FEBS letters. 585 (22), 3507-3512 (2011).
- Kwon, H., et al. Leucokinin mimetic elicits aversive behavior in mosquito Aedes aegypti (L.) and inhibits the sugar taste neuron. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 6880-6885 (2016).
- Xiong, C., Baker, D., Pietrantonio, P. V. A random small molecule library screen identifies novel antagonists of the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus (Acari: Ixodidae). Pest Management Science. 77 (5), 2238-2251 (2021).
- Torfs, P., et al. The kinin peptide family in invertebrates. Annals of the New York Academy of Sciences. 897 (1), 361-373 (1999).
- Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (5), 511-523 (2017).
- Zhang, J. -. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
- Offermanns, S., Simon, M. I. Gα15 and Gα16 couple a wide variety of receptors to phospholipase C. Journal of Biological Chemistry. 270 (25), 15175-15180 (1995).
- Murgia, M. V., et al. High-content phenotypic screening identifies novel chemistries that disrupt mosquito activity and development. Pesticide Biochemistry and Physiology. 182, 105037 (2022).
- Lismont, E., et al. Can BRET-based biosensors be used to characterize G-protein mediated signaling pathways of an insect GPCR, the Schistocerca gregaria CRF-related diuretic hormone receptor. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 122, 103392 (2020).
