Bağırsak Mikrobiyom-Sinir Sistemi Eksenini İncelemek için Çip Üzerinde Bağırsak Modeli

1. Hücre kültürü ve sıralama İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı enterik nöronlarNOT: Koşunun başlamasından 6 hafta önce kültür iPSC’leri. EN’ler için farklılaşma protokolü Fattahi ve ark.6’dan uyarlanmıştır.iPSC’leri,% 1 penisilin-streptomisin (P / S) ile desteklenmiş 2 mL / oyuklu iPSC kültür ortamında matris jel kaplı 6 oyuklu bir plaka üzerinde kültürleyin. -90 birleşmede, hücreleri geçirin, aynı ortamı kullanarak matris jel kaplı bir plakada tohumlayın, 37 °C, O2 ve bağıl nemde (RH) inkübe edin. iPSC türevi için, çözüldükten sonra iki pasajı takiben,% 80 -% 90 birleşmede, hücreleri 100.000 hücre / kuyu yoğunluğunda matris jel kaplı 6 oyuklu bir plakaya tohumlayın. Yukarıda tarif edilen ortam + ROCK inhibitörü Y-27632 (1: 2.000) içinde 37 ° C’de 24 saat inkübe edin. 24 saat sonra, süpernatan ortamı Tablo 0’e göre Gün 1 ortamıyla değiştirin. Türetme işlemi için hücre sıralaması sırasında negatif kontrol olarak kullanılacak bir kontrol kuyusu ekleyin. Tüm türetme dönemi boyunca 0. gün medya bileşiminde kontrolü iyi tutun. Tablo 1’e göre ortamı 2. günden 10. güne kadar her gün değiştirin. 11. Günde, bu protokolün sonraki adımlarında kullanılacak olan CD49d pozitif hücreler için hücreleri sıralayın.CD49d pozitif hücrelere ve kontrol kuyusuna göre sıralanacak hücreleri bir araya getirin. Hücreleri 300 × g’da 3 dakika santrifüj edin. Hücre peletini 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 2 sığır serum albümini (BSA) +% 1 P / S içinde yeniden süspanse edin. Her hücre lotunu (havuzlanmış ve kontroller) ikiye bölün: bir fraksiyonu anti-insan CD49d antikoru ile ve diğer fraksiyonu bir izotip kontrol antikoru ile boyayın. Ana hücre popülasyonunu kapatın ve ardından yüzeylerinde CD49d sunan hücrelerin seçileceği tek hücreleri kapılayın. Farklılaşmanın bir sonraki adımı için bu hücreleri toplayın.NOT: Genellikle, sıralanan hücrelerin% 30-40’ı CD49d pozitiftir. Sıralanan hücrelerin iki ila dört milyonunu, küresel oluşumuna izin vermek için 4 gün boyunca N2B27 ortamında (bkz. Tablo 2) + FGF2 + CHIR’de ultra düşük bir bağlantı plakasının 6 oyuklu bir plakasına aktarın. 15. günde, sferoidleri GDNF ve askorbik asit (AA) ile 2 mL/oyuklu N2B27 ortamında poli L-ornitin/laminin/fibronektin (P/L/F) kaplı 6 oyuklu plaka üzerinde yeniden plakalayın. Ortamı 2-3 günde bir değiştirin.NOT: Kaplama oranı: poli L-ornitin, 15 μg/mL; laminin, 2 μg/mL; fibronektin, 1x PBS’de 2 μg/mL. 3 hafta sonra, hücreleri cihazda aşılama için kullanın. Caco-2NOT: Caco-2 hücrelerini çalıştırmadan en az 1 hafta önce çözün.RPMI 1640 glutamin takviyesi + HEPES +% 10 fetal sığır serumu (FBS) içinde 1 ×10 6 Caco-2 hücreli bir T75 şişesi tohumlayın; 37 °C, O2 ve RH’de inkübe edin.NOT: Bu deneyler için ideal olarak Caco-2’yi çözüldükten sonra birinci veya ikinci geçişlerinde kullanın. 2. HuMiX çalıştırma hazırlığı Polikarbonat kapak hazırlama ve kaplamaİlk cihaz enstrüman döngüsünü kullanarak bir çift polikarbonat (PC) kapağı (Şekil 2) dört vidayla birlikte otoklavlayın (ayrıntılar için Tablo 3’e bakın). Bir biyogüvenlik kabininde, alt PC kapağının her bir köşesine dört vida yerleştirin (bkz. Şekil 3) ve iki aşamalı bir kaplama işlemi için steril bir kare Petri kabına aktarın.İlk gün, PC kapağının ortasına PBS’de (1x) 2 mL %1.5 poli L-ornitin ekleyin. Gece boyunca 37 °C, O2 ve RH’de inkübe edin. Ertesi gün, çözeltiyi çıkarın ve nöronal hücre odasının yüzeyini kaplamak için PBS’de (1x) %0.2 laminin ve %0.2 fibronektin içeren bir çözelti ile değiştirin. Kapağı gece boyunca 37 °C, O2 ve bağıl nemde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kaplama solüsyonunu PC kapağında tutun ve Petri kabını bir sızdırmazlık filmi ile kapatın. Kullanana kadar saklamak için 4 °C’ye koyun. Kullanmadan önce, kaplama solüsyonunu çıkarın ve kaplama tamamen kuruyana kadar bir biyogüvenlik kabininde 30 dakika havayla kurutun. Conta hazırlama ve kaplamaNOT: Bu bölümde, silikon contalara yarı geçirgen membranlar yapıştırılarak contaların nasıl hazırlanacağı açıklanmaktadır. İlk otoklavlama adımından sonra, contalar bağırsak epitel hücrelerinin veya bakterilerin yapışmasına izin vermek için kollajen veya müsin ile kaplanır. Müsin kaplı zar, insan bağırsağında bulunan mukus bariyerini taklit eder.Kollajen contaya 1 μm gözenek boyutunda polikarbonat membran ve alt ve üst sandviç contalar arasına 50 nm gözenek boyutunda polikarbonat membran takın. İlk cihaz alet döngüsünü kullanarak contaları ekli membranlarla otoklavlayın (bkz. Tablo 3). Membranları kaplamak için, her bir contayı steril bir kare tabağa yerleştirin.NOT: Kaplama, biyogüvenlik kabininde steril koşullarda yapılır.Kollajen conta için membrana 3 mL kollajen (50 μg/mL) ekleyin ve 37 °C’de 3 saat inkübe edin.NOT: Membrana zarar vermemek için kolajeni eklerken pipet ucuyla membrana dokunmamaya dikkat edin. Müsin kaplaması için, membranın üst tarafını 3 mL müsin (0.025 mg/mL) ile kaplamak için sandviç contayı üst conta tarafı yukarı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirin. Contaları 37 °C’de 1 saat inkübe edin. İnkübasyon süresinden sonra, kollajen ve müsin solüsyonlarını ilgili contalarından aspire edin ve membranı bir biyogüvenlik kabininde 30 dakika havayla kurutun. Bulaşıkları kapatın, laboratuvar sızdırmazlık filmi ile kapatın ve contaları kullanana kadar 4 °C’de saklayın. Boru montajıNOT: Bu bölüm, cihazın perfüzyonu için borunun nasıl monte edileceğini açıklar. Montajdan önce, tüm parçaları otoklavlayın ve/veya steril bir pakette ayrı ayrı paketlenmiş olanları satın alın. Tüm bileşenleri bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin.Her cihaz ve her tüp hattı için üç boru hattı, bir adet pompa boru hattı, iki adet uzun Marprene boru (20 cm), iki adet kısa Marprene boru (8 cm), çıkış şişesi için bir adet 40 mm iğne, 250 mL giriş şişeleri için bir adet 120 mm iğne veya daha küçük giriş şişeleri için 80 mm iğne kullanın, üç erkek ve yedi dişi Luer – dikenli konektör, üç Luer adaptörü ve iki üç vana. Yukarıda listelenen otoklavlanmış ve sterilize edilmiş bileşenleri kullanarak boru hatlarını soldan sağa monte edin (Şekil 4).NOT: Her bağlantı adımı arasında her bileşene etanol püskürtün. Medya hazırlığıNOT: Bu bölüm, besiyerinin cihazdaki farklı hücre tipleri için nasıl hazırlanacağını ve besiyerinin steril bir şekilde serum şişelerine nasıl aktarılacağını açıklar.RPMI 1640’ı 0,22 μm filtrelenmiş, ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS ile destekleyin. N2B27 ortamını GDNF ve AA ile taze bir şekilde destekleyin. Ortamı steril koşullar altında serum şişelerine aktarın. 200 mL RPMI 1640 ortamını 250 mL’lik şişelere ve 30 mL N2B27 ortamını 50 mL’lik şişelere aktarın.Bakteri ortamını (RPMI 1640 +% 10 FBS +% 5 De Man, Rogosa ve Shapre kültür ortamı [MRS]) daha sonraki bir aşamada hazırlayın, çünkü bu yalnızca deneyin son 24 saatinde gereklidir. Şişeleri bir septum ile kapatın, alüminyum kıvırın ve otoklavlayın. Ortamı aktarmak için, uygun bir decapper (çap = 20 mm) kullanarak alüminyum kıvrımı çıkarın. Septumu da çıkarın. Hazırlanan besiyerini şişeye dokunmadan dikkatlice serum şişelerine dökün. Sterilize etmek için, portatif bir Bunsen brülörü kullanarak şişenin açıklığını alevlendirin. Septuma% 70 etanol püskürterek, şişeye ekleyerek ve bir conta kıvırıcı kullanarak alüminyum bir kıvrımla kapatarak şişeleri kapatın. Ortamı 37 °C’ye ısıtmak için kapalı şişeleri 37 °C, O2’de 24 saat boyunca inkübatöre yerleştirin ve ayrıca cihaz için ortam şişelerini kullanmadan önce görünür kontaminasyon belirtisi olmadığından emin olun. 3. HuMiX başlangıcı NeuroHuMiX montajıNOT: Bu bölüm, cihazın nasıl monte edileceğini açıklamaktadır. Kısacası, sıkıştırma sistemi sterilize edilir ve yeniden sıkılır, ardından alt PC kapağı kelepçenin tabanına yerleştirilir. Daha sonra, kaplanmış contalar ve üst PC kapakları birbiri üzerine istiflenir, ardından kelepçenin üst kısmı gelir. Son olarak, contaları sıkıştırmak ve sistemi sızdırmaz ve gaz geçirmez hale getirmek için kelepçe sıkılır. Şekil 4 , montaj için gereken farklı parçaları göstermektedir.cl’yi otoklavlayınampmontajdan önce ve iki PC kapağı (üst ve alt). cl’nin üst ve alt kısımlarını monte etmek için kullanılan vidaları sıkınamp (Şekil 4C,D). Otoklavlama işleminden önce vidaları açın ve daha sonra tekrar sıkın. Kaplanmış ve kurutulmuş (adım 2.2.3) alt PC kapağını (Şekil 4 A1) kare Petri kabından cl’nin üstüne aktarın.amp PC kapağının köşelerindeki dört vidayı tutarak temel.NOT: Kontaminasyon riskini azaltmak için PC kapağına dokunmaktan kaçının. Epitel haznesi contasını yukarı bakacak şekilde (yani membran üstte olacak şekilde) steril cımbız kullanarak PC kapağına yerleştirin. Kapağın köşelerindeki giriş ve çıkış portlarının contadaki açıklıklarla hizalandığından emin olmak için contayı ve PC kapağını hizalamak için vidaları kullanın (Şekil 3). Steril cımbız kullanarak, sandviç contayı üst tarafı yukarı bakacak şekilde kollajen contanın üzerine yerleştirin. Üst PC kapağını sandviç contanın üzerine yerleştirin. Kontaminasyon riskini azaltmak için bunu yalnızca kapağın kenarlarına dokunarak yapın (kapağın üst veya alt kısmına dokunmayın). cl cl üzerindeki dikenleramp kapağı, membran tertibatındaki giriş ve çıkış açıklığı ile hizalanır ve alt PC kapağındaki vidaların üst PC kapağının açıklığına oturur. Cihazı kapatmak için, cl’yi yerleştirinamp kapağı (cl’nin üst kısmıamp) PC kapağının üstüne. Kapağın açıklıklarının üst PC kapağının giriş ve çıkış çubuklarıyla çakıştığından emin olun. Mandalları kapatın. Astarlanmış boru hatlarına bağlanmak için kapalı cihazı (Şekil 5) kaputun altında tutun (adım 3.2.6). Boru hatlarının astarlanmasıNOT: Bu bölüm, borunun giriş ve çıkış şişelerine ve ayrıca pompaya nasıl bağlanacağını, ardından temizlik ve sterilizasyon sırasında kullanılan artık ürünleri çıkarmak için boruyu ortamla nasıl dolduracağınızı ve boruda kabarcık bulunmadığından nasıl emin olunacağını açıklar.Boru hatlarının astarlanması biyogüvenlik kabininde yapılır. Her giriş ve çıkış şişesinin septumuna filtreli havalandırma iğneleri yerleştirin. Temiz, steril cımbız kullanarak 120 mm’lik iğneleri 250 mL’lik serum şişelerine yerleştirin. 80 mm’lik iğneleri 50 mL’lik serum şişelerine yerleştirin. Her boru hattının sonundaki 40 mm’lik iğneleri bir çıkış serum şişesine yerleştirin. Cihaz başına, üç boru hattı için iki çıkış şişesi vardır. Epitelyal ve nöronal boru hatlarının 40 mm’lik iğneleri, orta atma için aynı çıkış şişesine bağlanır. Bakteri tüpü hattı ikinci çıkış şişesine gider. Pompa boru hatlarını pompa kasetlerine yerleştirin. Boru hatlarının üç vanalarının hepsinin açık olduğundan emin olun. Başlangıçta, peristaltik pompayı, ortamı girişten çıkış şişesine 5 rpm hızında yönlendirecek şekilde ayarlayın (bkz. Tablo 4).NOT: Boru hattı hazırlama sırasında, işlemi hızlandırmak için hız 10 rpm’ye kadar artırılabilir. Başlat düğmesine basarak pompayı çalıştırın ve pompalama hareketinin yönünün saat yönünde olduğundan emin olun. Medya çıkış şişelerine düştüğünde, boru hatlarında ve bağlantı noktalarında sızıntı olmadığından ve hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Boruya ve konektörlere dokunarak veya pompa hızını artırarak kalan kabarcıkları çıkarın. Tüm boru hatları çıkış şişelerine düştüğünde, ilk cihazı bağlamak için akış hızını 2 rpm’ye ayarlayın. Cihazın astarlanmasıNOT: Bu bölüm, sistemde kabarcık kalmaması ve hücrelerin aşılama sırasında kolayca yapışabilmesi için tüm odaların ortamla doldurulmasını ve önceden kaplanmasını sağlamak için cihazın hücre kültürü ortamıyla nasıl doldurulacağını açıklar.Cihazın astarlama işlemi steril şartlarda biyogüvenlik kabininde yapılır. Cihazı bağlamak için, cihazın alt odası olan nöronal hattı bağlayarak başlayın. Bir hattı bağlamak için, üç vanaları kapatın (Şekil 5C), önce kısa borunun dişi Luer konektöründen ayrıldığı ve cihazdan çıkış portuna bağlandığı çıkış tarafından başlayarak, boruyu diken üzerinden iterek. Doğru bağlantıyı sağlamak ve sızıntı ve/veya kirlenme olasılığını azaltmak için, hortumu konektörün üzerinden sonuna kadar iterek kapakla temas halinde olduğundan emin olun. Giriş borusunu da aynı şekilde bağlayın. Bir hat cihaza tamamen bağlandığında (giriş ve çıkış), üç muslukları açın. Önceki adımı epitel çizgisi ve ardından bakteri çizgisi ile tekrarlayın. Pompayı 2 rpm akış hızında tutun. Basınç oluşumundan kaynaklanan sızıntıları önlemek için pompa hızını 2,5 rpm’ye yükseltin, ancak daha yükseğe çıkarmayın. Pompanın cihazdaki odaları doldurmasına izin verin. Çıkış serum şişelerini her zaman izleyin. Hava kabarcıkları odalara, hatlara veya konektöre sıkışırsa, içinde hava kabarcığı bulunan bir boru hattı artık çıkış odasına düşmeyecektir. Hava kabarcıklarından kurtulmak için önce cihazların birkaç dakika çalışmasına izin verin. Bu sorunu çözmezse, çıkışın üç vanasını kapatarak kısa bir süre için düşen diğer hatlardan birini kapatın. Cihazın tüm bölmeleri tamamen doldurulduktan sonra – tüm bölmeler hücre kültürü ortamı ile doldurulur ve cihazda kabarcık kalmaz – pompa hızını 0,5 rpm’ye düşürün. Cihaz artık hücre aşılaması için hazırdır. 4. Hücre hazırlama ve aşılama NOT: Bu bölüm, cihazı aşılamak için gereken farklı hücre tiplerinin nasıl hazırlanacağını ve bunların cihazda steril bir şekilde ve hava kabarcığı oluşturmadan nasıl aşılanacağını açıklar. Ayrıca, nöronal hücreler için ortam tazelemesinin nasıl gerçekleştirileceğini ve cihazdaki bakteri kültürü için ortamın nasıl hazırlanacağını açıklar. Epitel hücreleriTripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kullanarak Caco-2 hücrelerini şişeden ayırın, RPMI 1640 +% 10 FBS’de yeniden süspanse edin ve tripan mavisi dışlama testini kullanarak bir Neubauer hücre sayacında sayın. Caco-2 hücre süspansiyonunu (3 dakika, 300 × g) santrifüjleyin ve kalan tripsin-EDTA’yı çıkarmak için süpernatanı atın. 350.000 hücre/mL’lik bir süspansiyon elde etmek için Caco-2 hücrelerini RMPI 1640 +% 10 FBS’de yeniden süspanse edin. Her cihaz için 1,5 mL’lik bir hacme ihtiyaç vardır. 1.5 mL Caco-2 hücre süspansiyonunu steril 2 mL’lik bir şırıngaya aktarın ve şırıngada kalan hava veya kabarcıkları çıkarın. Bakteri ve nöronal odaların borularının üç vanalarını kapatın. İlgili boruya sahip kasetleri rotordan çıkararak bakteri ve nöronal odaların borularını pompadan ayırın. Epitel odasına giden giriş borusunun üç vanasının kapağını açın ve orta akışı cihazdan ‘açık konektöre’ yönlendirmek için üç vanayı çevirin (Şekil 5C). Üç vananın açık ucunda bir damla ortam görünene kadar ortamın akmasına izin verin. Epitel hücrelerini içeren şırıngayı, şırınganın hava kabarcığı girmeden konektöre yerleştirilmesine izin vermek için damla-damla bağlantı yöntemini kullanarak ‘açık konektöre’ yerleştirin. Ortamın giriş şişesinden (pompa aracılığıyla ) akışını durdurmak ve bağlı şırıngadan ilk cihaza akışa izin vermek için üç vananın valfini çevirin. Epitel kanalını pompadan ayırın. Epitel odasını hücre süspansiyonu ile aşılamak için şırıngaya yavaşça bastırın. Çıkış şişesine her 3 saniyede yaklaşık bir damla damladığından emin olun. 1,5 mL hücre süspansiyonu ekleyin, ardından çıkış üç vananın valfini kapatın. Şırıngayı ayırın ve üç musluğun açık ucunu kapakla kapatın. Hazneyi en az 2 saat kapalı tutun. Bu arada, nöronal hücreleri aşılayın. Nöronal hücrelerOrtamdaki hücreleri bir pipet kullanarak ilgili kuyulardan yeniden süspanse ederek nöronal hücreleri kuyudan ayırın. Her cihazı, 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğundan (9,6cm2) tamamen birleşik hücrelerle aşılayın. Hücre peletini karşılık gelen N2B27 orta hacminde (cihaz başına 1.5 mL ortam) + 1 μL fibronektin/mL hücre süspansiyonunda yeniden süspanse edin. 1.5 mL askıya alınmış hücre süspansiyonunu 2 mL’lik bir şırıngaya aktarın ve şırıngada kalan hava kabarcıklarını çıkarın. Doldurulmuş şırıngayı steril 50 mL’lik konik bir tüpe yerleştirin ve astarlanmış HuMiX cihazını içeren biyogüvenlik kabinine aktarın. Tüp hattı değişikliği dışında, epitel odası aşılaması için daha önce tarif edilenle aynı aşılama sürecini izleyin. Burada, bakteri ve epitel tüp hatlarını pompadan ayırın. Nöronal hücre aşılamasından sonra, tüp hatlarının tüm üç vanalarını kapatın ve pompadan ayırın. Cihazı 37 °C ve %5 CO2’de inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin yapışmasına izin vermek için tüm kanalları 2 saat kapalı tutun. 2 saat sonra, bakteri ve epitel kanallarını pompaya bağlayın ve her iki hattın giriş ve çıkış üç vanalarını açın. Nöronal odayı, orta değişim dışında, ilk cihaz çalışmasının önümüzdeki 14 günü boyunca kapalı tutun. 14 günlük çalışma sırasında, her 3-4 günde bir nöronal odanın ortamını değiştirin. Orta tazeleme için, cihaz başına 3 mL taze N2B27 ortamı hazırlayın ve 20 mL’lik steril bir serum şişesine aktarın. Serum şişesini steril bir septum ve alüminyum kıvrımlı bir conta kullanarak ortamla kapatın. Yeni şişenin septumuna bir havalandırma ve 80 mm’lik bir iğne yerleştirin. Erkek Luer’i eski şişenin iğnesinden yeni şişenin iğnesine ayırarak eski medya şişesini inkübatördeki yenisiyle değiştirin. Kaseti nöronal haznenin pompa borusuna bağlayın ve üç vanaları açın. Nöronal borunun üç vanalarını kapatmadan ve bir sonraki ortam değişimine kadar pompadan ayrılmadan önce ortamın 2 saat boyunca 0,5 rpm’de akmasına izin verin. 5. Bakteri kültürü ve aşılama NOT: Bu çalışmada, 12. günde, sıvı bir Limosilactobacillus reuteri suşu F275 kültürü, bir gliserol stoğundan yeniden canlandırıldı. İhtiyaca veya çalışma tasarımlarına bağlı olarak, diğer bakteri türleri kullanılabilir. 5 mL MRS et suyu içeren üç tüp hazırlayın – bir steril kontrol tüpü ve L. reuteri aşısı için iki. Bir aşılama döngüsü ile gliserol stoğunun üst kısmını kazıyın ve bir tüpe aktarın. İkinci bir aşılama tüpü ile tekrarlayın. Tüpleri gece boyunca 37 °C, 170 rpm’de inkübe edin.NOT: Gliserol stoğunun çözülmesine izin vermeyin. Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 + FBS’yi %5 MRS suyu ile karıştırarak ilk cihazlar için taze ortam hazırlayın. Cihaz başına 25 mL hazırlayın ve steril koşullar altında 100 mL’lik serum şişelerine aktarın. Şişeleri steril bir septum ve alüminyum kıvrımla kapatın. Şişeleri gece boyunca 37 °C, O2’de inkübatöre yerleştirin. Şişeleri bakteri tüpü hattına bağlamadan önce, her bir RPMI 1640/MRS ortamı şişesine bir havalandırma iğnesi ve 80 mm’lik iğne ekleyin. Her biri 3 mL RPMI 1640 + FBS + %5 MRS suyu içeren yeni tüpler hazırlayın. Cihaz başına bir kontrol ve bir tüp olmak üzere en az iki tüp hazırlayın. Yeni hazırlanan tüplerin ikisine 15 μL L. reuteri gece kültürü (optik yoğunluk [OD] > 2) aşılayın. Tüpleri 37 °C, 170 rpm’de 1 saat inkübe edin, ardından ~1 × 107 koloni oluşturan birim (CFU)/mL’ye karşılık gelen 0.05-0.10’luk bir OD’ye ulaşılır. 1,5 mL’yi 2 mL’lik bir şırıngaya aktarın (cihaz başına bir tane). CFU kaplama ve canlı/ölü boyama için bakteri süspansiyonunun geri kalanını kullanın. Cihazın bakteriyel aşılanması için, burada nöronal ve epitelyal tüp hatlarının kapalı olması dışında, adım 4.1’de belirtilenle aynı prosedürü izleyin. Aşılamadan sonra, vanaları kapatarak ve pompadan 30 dakika ayırarak bakteri tüpü hattını da kapatın. Epitel ve bakteri tüp hatlarını bağlayın ve tekrar açın. Cihazları 37 °C ve 0,5 rpm’de 24 saat daha çalıştırın. 6. HuMiX açılışı ve örneklemesi NOT: Aşağıdaki bölümde, farklı hücre tiplerinin örneklemesi açıklanmaktadır. Örneğin, nöronal hücre peletleri, RNA ekstraksiyonu ve müteakip kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), DNA ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen dizilimi için bakteriyel peletler ve enzime bağlı immünosorbent testleri (ELISA’lar) ve diğer testler (örneğin, laktat testi) için süpernatanlar kullanılır. Açılış günü olan 14. günde, tüm üç muslukları kapatın, boruları pompadan ayırın ve inkübatörün cihazını laboratuvar tezgahına çıkarın.NOT: Cihazı taşırken, gerçek cihazı yatay tuttuğunuzdan emin olun. cl’yi yavaşça açmadan önce cihaza bağlı boru hatlarını çıkarın.amp ve cl’yi çıkarınamp kapak. Dikkatli bir şekilde üst PC kapağını çıkarın, ortamı 1,5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Ortamı epitel odasından toplarken sandviç contayı yavaşça çıkarın; Hücre katmanına dokunmamaya dikkat edin. Sandviç contayı kare bir Petri kabına yerleştirin ve hazne tamamen kaplanana kadar (yaklaşık 1 mL) bakteri odasına H2O içinde steril% 0.9 NaCl çözeltisi ekleyin. Ortamı nöronal odadan toplarken ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarırken kollajen contayı yavaşça çıkarın. Tüm medya tüplerini buzun üzerine yerleştirin. Kollajen contayı kare bir tabağa yerleştirin ve hücre tabakası tamamen kaplanana kadar Caco-2 tabakasına birkaç mililitre 1x PBS ekleyin. Alt PC kapağını kare bir Petri kabına yerleştirin ve nöronal hücrelerin üzerine nazikçe yaklaşık 2 mL 1x PBS ekleyin, böylece örnekleme işlemi sırasında kurumazlar. Bakteriyel ortam tüpünü 5,000 ° C’de 5 dakika boyunca 4 × g’da santrifüjleyin. Epitelyal ve nöronal ortam tüplerini 300 × g’da 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, her tüpün süpernatanını yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve hemen kuru buz üzerine yerleştirin. Epitel hücreleriPBS’yi contadan yavaşça çıkarın ve 15 mL’lik konik bir tüpte toplayın. Hücrelere 2 mL tripsin ekleyin ve contayı 37 °C, O2’de 5 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra contaya 2 mL RPMI 1640 ekleyin, hücreleri yeniden süspanse edin ve başka bir 15 mL konik tüpte toplayın. Her iki tüpü de 300 × g’da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın. Peleti PBS yıkamasından 300 μL PBS’de ve hücre peletini 1 mL PBS’de yeniden süspanse edin. Otomatik hücre sayacı ve tripan mavisi dışlama testi hücre sayımı için her tüpün 50 μL’sini 0.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Yeniden süspanse hücre peletini (1 mL) 1.5 mL’lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 300 × g’da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 250 μL lizis tamponu +% 1 beta-merkaptoetanol içinde yeniden süspanse edin ve tüpü kuru buz üzerine yerleştirin. Nöronal hücrelerBir önceki adımdan (6.5) nöronal hücrelere sahip alt, şeffaf PC kapaklı kare Petri kabını ters faz kontrast mikroskobuna alın.NOT: Üzerinde PBS bulunan PC kapağını hareket ettirirken, nöronal ağ çok kolay ayrıldığı için çok nazik olun. Parlak alan mikroskobu kullanarak nöronal hücrelerin morfolojisini ve hücre yoğunluğunu gözlemleyerek aşılamadan önce son bir kalite kontrolü yapın. Hücrelerin sferoidlerden göç ettiğini ve bir nöronal ağın oluştuğunu doğrulayın. Nöronal ağ yaklaşık% 90 birleşik olmalıdır. Daha fazla ayrıntı için Fattahi ve ark.6’ya bakın. Tezgahta, hücreleri PBS’de yeniden süspanse edin ve 1.5 mL’lik bir tüpte toplayın. Tüpü 300 × g’da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, hücre peletini 250 μL lizis tamponu +% 1 beta-merkaptoetanol içinde yeniden süspanse edin ve kuru buz üzerine yerleştirin.NOT: PC kapağındaki nöronal hücrelerde immünofloresan (IF) boyama yapılabilir. Nöronal ağı tahrip etmemek için IF boyama tercih edilen test ise, hücreler %4 paraformaldehit (PFA) ile PC kapağına sabitlenmelidir, bu da gelecekteki deneylerde PC kapağının tekrar kullanılmasını engeller. Bakteri hücreleriMembrana bağlı bakteri hücrelerini% 0.9 NaCl çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Hücreler sıkıca tutturulmuşsa, bakteri hücrelerini zardan ayırmak için nazikçe bir hücre kazıyıcı kullanın.NOT: Kazıyıcı kullanmak hücrelere zarar verebilir ve daha fazla ölü hücre görme olasılığını artırabilir. Hücre süspansiyonunu 15 mL’lik konik bir tüpte toplayın. Önceden toplanan ortamdan arta kalan peleti 15 mL’lik konik tüpe ekleyin. 5.000 × g’da 4 °C’de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL% 0.9 NaCl çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Bu hacmi üç parçaya bölün: biri nükleik asit ekstraksiyonu (650 μL) için bir bakteri peletini dondurmak için, biri MRS plakalarında CFU kaplama (50 μL) için ve diğeri canlı/ölü boyama (300 μL) için. Peletin nükleik asit ekstraksiyonu için hazırlanması için, hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, 5,000 ° C’de 5 dakika boyunca 4 × g’da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre peletini kuru buzun üzerine yerleştirin. Numune alma işleminin sonunda, daha sonraki sonraki analizler için saklamak üzere kuru buz üzerindeki tüm tüpleri -80 °C’lik bir dondurucuya aktarın.NOT: Süpernatant ayrıca gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS) analizi için de kullanılabilir. Ayrıca, açılma sırasında, kollajen kaplı membran farklı analizler için farklı parçalara bölünebilir – bir yarısı IF oklüdin boyama için kullanılacak, başka bir kısım daha fazla gen ekspresyon analizi için RNA ekstraksiyonu için ve hücre sayımı için başka bir kısım.