Un modelo de intestino en un chip para estudiar el eje microbioma intestinal-sistema nervioso

1. Cultivo y clasificación celular Neuronas entéricas derivadas de células madre pluripotentes inducidasNOTA: Cultive iPSC 6 semanas antes del inicio de una ejecución. El protocolo de diferenciación de las ENs ha sido adaptado de Fattahi et al.6.Cultive las iPSC en una placa de 6 pocillos recubierta de gel en matriz en 2 ml/pocillo de medio de cultivo iPSC suplementado con penicilina-estreptomicina (P/S) al 1%. A 80%-90% de confluencia, pasar las células, sembrar en una placa de matriz recubierta de gel utilizando el mismo medio, incubar a 37 °C, 5% de CO2 y 90% de humedad relativa (HR). Para la derivación de iPSC, después de dos pasadas después de la descongelación, con una confluencia del 80%-90%, siembra las células en una placa de 6 pocillos recubierta de gel de matriz a una densidad de 100.000 células/pocillo. Incubar en los medios descritos anteriormente + inhibidor de ROCK Y-27632 (1:2.000) durante 24 h a 37 °C. Después de 24 h, reemplace el medio sobrenadante por el medio del día 0, de acuerdo con la Tabla 1. Incluya un pocillo de control que se utilizará como control negativo durante la clasificación de celdas para el proceso de derivación. Mantenga el control bien en la composición de medios del día 0 durante todo el período de derivación. Cambie el medio cada dos días desde el día 2 hasta el 10, de acuerdo con la Tabla 1. En el día 11, clasifique las celdas para las células positivas para CD49d, que se utilizarán en los siguientes pasos de este protocolo.Agrupe las células que se van a clasificar en función de las células CD49d positivas, así como del pozo de control. Centrifugar las células durante 3 min a 300 × g. Resuspender el gránulo celular en albúmina sérica bovina (BSA) al 2% + 1% P/S en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Divida cada lote de células (agrupadas y controles) en dos: tiña una fracción con un anticuerpo anti-CD49d humano y la otra fracción con un anticuerpo de control de isotipo. Controlar la población de células principales y, a continuación, controlar las células individuales, en función de las cuales se seleccionarán las células que presenten CD49d en su superficie. Recoja estas células para el siguiente paso de diferenciación.NOTA: Por lo general, entre el 30% y el 40% de las células ordenadas son positivas para CD49d. Transfiera de dos a cuatro millones de células clasificadas a una placa de 6 pocillos de una placa de unión ultra baja en medios N2B27 (ver Tabla 2) + FGF2 + CHIR durante 4 días para permitir la formación de esferoides. El día 15, vuelva a colocar los esferoides en una placa de 6 pocillos recubierta de poli L-ornitina/laminina/fibronectina (P/L/F) en 2 mL/pocillo de medio N2B27 con GDNF y ácido ascórbico (AA). Reemplace el medio cada 2-3 días.NOTA: Relación de recubrimiento: poli L-ornitina, 15 μg/mL; laminina, 2 μg/mL; fibronectina, 2 μg/mL en 1x PBS. Después de 3 semanas, use las células para la inoculación en el dispositivo. Caco-2NOTA: Descongele las células de Caco-2 al menos 1 semana antes de una carrera.Siembrar un matraz T75 con 1 × 106 células Caco-2 en suplemento de glutamina RPMI 1640 + HEPES + 10% de suero fetal bovino (FBS); incubar a 37 °C, 5% de CO2 y 90% de HR.NOTA: Para estos experimentos, lo ideal es utilizar Caco-2 en su primer o segundo paso después de la descongelación. 2. Preparación para la ejecución de HuMiX Preparación y recubrimiento de tapas de policarbonatoAutoclave un par de tapas de policarbonato (PC) (Figura 2) junto con cuatro tornillos utilizando el ciclo inicial del instrumento del dispositivo (consulte la Tabla 3 para obtener más detalles). En un gabinete de bioseguridad, inserte cuatro tornillos en cada esquina de la tapa inferior de la PC (consulte la Figura 3) y transfiéralos a una placa de Petri cuadrada estéril para un proceso de recubrimiento de dos pasos.El primer día, agregue 2 ml de poli L-ornitina al 1,5% en PBS (1x) en el centro de la tapa de la PC. Incubar durante la noche a 37 °C, 5% de CO2 y 90% HR. Al día siguiente, retire la solución y reemplácela con una solución que contenga 0,2% de laminina y 0,2% de fibronectina en PBS (1x) para cubrir la superficie de la cámara celular neuronal. Incubar la tapa durante la noche a 37 °C, 5% de CO2 y 90% HR. Después de la incubación, mantenga la solución de recubrimiento en la tapa de la PC y cierre la placa de Petri con una película de sellado. Colóquelos a 4 °C para almacenarlos hasta su uso. Antes de usar, retire la solución de recubrimiento y séquela al aire en un gabinete de bioseguridad durante 30 minutos hasta que el recubrimiento esté completamente seco. Preparación y recubrimiento de juntasNOTA: Esta sección describe cómo preparar juntas pegando membranas semipermeables a juntas de silicona. Después de un paso inicial de autoclave, las juntas se recubren con colágeno o mucina para permitir la adhesión de células epiteliales intestinales o bacterias. La membrana recubierta de mucina imita la barrera mucosa que está presente en el intestino humano.Coloque una membrana de policarbonato de 1 μm de tamaño de poro a la junta de colágeno y una membrana de policarbonato de 50 nm de tamaño de poro entre las juntas sándwich inferior y superior. Autoclave las juntas con las membranas adheridas utilizando el ciclo inicial del instrumento del dispositivo (ver Tabla 3). Para recubrir las membranas, coloque cada junta en un plato cuadrado estéril.NOTA: El recubrimiento se realiza en condiciones estériles en una cabina de bioseguridad.Para la junta de colágeno, añadir 3 ml de colágeno (50 μg/ml) a la membrana e incubar durante 3 h a 37 °C.NOTA: Tenga cuidado de no tocar la membrana con la punta de la pipeta al agregar el colágeno para evitar dañar la membrana. Para el recubrimiento de mucina, coloque la junta sándwich con el lado superior de la junta hacia arriba en una placa de Petri para cubrir la parte superior de la membrana con 3 ml de mucina (0,025 mg/ml). Incubar las juntas a 37 °C durante 1 h. Después del tiempo de incubación, aspire las soluciones de colágeno y mucina de sus respectivas juntas y seque al aire la membrana en una cabina de bioseguridad durante 30 min. Cierre los platos, selle con film de sellado de laboratorio y guarde las juntas a 4 °C hasta su uso. Montaje de tubosNOTA: Esta sección describe cómo ensamblar el tubo para la perfusión del dispositivo. Antes del montaje, autoclave todas las piezas y/o compre las que se envasan individualmente en un envase estéril. Coloque todos los componentes en un gabinete de bioseguridad.Utilice tres líneas de tubos para cada dispositivo y para cada línea de tubos, un trozo de tubo de bombeo, dos trozos de tubo largo de Marprene (20 cm), dos trozos de tubo corto de Marprene (8 cm), una aguja de 40 mm para la botella de salida, una aguja de 120 mm para las botellas de entrada de 250 ml o una aguja de 80 mm para botellas de entrada más pequeñas, tres conectores Luer macho y siete hembra a lengüeta, tres adaptadores Luer y dos válvulas llave de paso de tres vías. Ensamble las líneas de tubería de izquierda a derecha utilizando los componentes esterilizados y esterilizados en autoclave enumerados anteriormente (Figura 4).NOTA: Rocíe cada componente con etanol al 70% entre cada paso de conexión. Preparación de los medios de comunicaciónNOTA: En esta sección se describe cómo preparar el medio para los diferentes tipos de células del dispositivo, así como cómo transferir el medio a los frascos de suero de forma estéril.Complemente RPMI 1640 con un 10% de FBS filtrado e inactivado por calor de 0,22 μm. Complemente el medio N2B27 con GDNF y AA. Transfiera el medio a frascos de suero en condiciones estériles. Transfiera 200 ml de medios RPMI 1640 a frascos de 250 ml y 30 ml de medios N2B27 a frascos de 50 ml.Prepare el medio bacteriano (RPMI 1640 + 10% FBS + 5% medio de cultivo De Man, Rogosa y Shapre [MRS]) en una etapa posterior, ya que esto solo es necesario durante las últimas 24 h del experimento. Cierre las botellas con un tabique, engarce de aluminio y autoclave. Para transferir el medio, retire el engarzado de aluminio con un destaponador adecuado (diámetro = 20 mm). Retire también el tabique. Vierta con cuidado el medio preparado en los frascos de suero sin tocar el frasco. Para esterilizar, encienda la abertura del biberón con un quemador Bunsen portátil. Selle las botellas rociando el tabique con etanol al 70%, agregándolo a la botella y cerrándolo con un engarzado de aluminio con una engarzadora de sellos. Coloque los frascos cerrados en la incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante 24 h para calentar el medio a 37 °C, así como para asegurarse de que no haya signos visibles de contaminación antes de usar los frascos de medios para el dispositivo. 3. Inicio de HuMiX Montaje de NeuroHuMiXNOTA: En esta sección se explica cómo ensamblar el dispositivo. En resumen, el sistema de sujeción se esteriliza y se vuelve a apretar, después de lo cual se coloca la tapa inferior de PC en la base de la abrazadera. A continuación, las juntas recubiertas y las tapas superiores de PC se apilan entre sí, seguidas de la parte superior de la abrazadera. Finalmente, la abrazadera se aprieta para comprimir las juntas y hacer que el sistema esté libre de fugas y sea hermético al gas. La figura 4 muestra las diferentes piezas necesarias para el montaje.Autoclave las abrazaderas y las dos tapas de PC (superior e inferior) antes del montaje. Apriete los tornillos utilizados para ensamblar las partes superior e inferior de la abrazadera (Figura 4C, D). Abra los tornillos antes del proceso de esterilización en autoclave y vuelva a apretarlos más tarde. Transfiera la tapa inferior de PC recubierta y seca (paso 2.2.3) (Figura 4 A1) de la placa de Petri cuadrada a la parte superior de la base de la abrazadera sujetando los cuatro tornillos en las esquinas de la tapa de PC.NOTA: Evite tocar la tapa de la PC para reducir el riesgo de contaminación. Coloque la junta de la cámara epitelial hacia arriba (es decir, con la membrana en la parte superior) en la tapa de la PC con pinzas estériles. Utilice los tornillos para alinear la junta y la tapa de la PC para asegurarse de que los puertos de entrada y salida en las esquinas de la tapa estén alineados con las aberturas de la junta (Figura 3). Con las pinzas estériles, coloque la junta sándwich encima de la junta de colágeno, con la parte superior hacia arriba. Coloque la tapa superior de la PC encima de la junta sándwich. Para reducir el riesgo de contaminación, hágalo tocando solo los bordes de la tapa (no toque la parte superior o inferior de la tapa). Asegúrese de que las lengüetas de la tapa de la abrazadera estén alineadas con la abertura de entrada y salida del conjunto de membrana, y de que los tornillos de la tapa inferior de la PC encajen en la abertura de la tapa superior de la PC. Para cerrar el dispositivo, coloque la tapa de la abrazadera (la parte superior de la abrazadera) encima de la tapa de la PC. Asegúrese de que las aberturas de la tapa coincidan con las lengüetas de entrada y salida de la tapa superior de la PC. Cierre los pestillos. Mantenga el dispositivo cerrado (Figura 5) debajo del capó para conectarlo a las líneas de tubería cebadas (paso 3.2.6). Cebado de líneas de tuberíaNOTA: Esta sección describe cómo conectar el tubo a los frascos de entrada y salida, así como a la bomba, cebar posteriormente el tubo con medio para eliminar cualquier producto residual utilizado durante la limpieza y esterilización, y asegurarse de que no haya burbujas en el tubo.El cebado de las líneas de tubería se realiza en la cabina de bioseguridad. Inserte agujas de aireación con filtros en el tabique de cada botella de entrada y salida. Con unas pinzas limpias y estériles, introduzca las agujas de 120 mm en los frascos de suero de 250 ml. Inserte las agujas de 80 mm en los frascos de suero de 50 ml. Inserte las agujas de 40 mm, al final de cada línea de tubería, en un frasco de suero de salida. Por dispositivo, hay dos botellas de salida para las tres líneas de tuberías. Las agujas de 40 mm de las líneas de tubos epiteliales y neuronales están conectadas a la misma botella de salida para el descarte medio. La línea de tubos bacterianos va a la segunda botella de salida. Inserte las líneas de tubería de la bomba en los casetes de la bomba. Asegúrese de que las llaves de paso de tres vías de las líneas de tubería estén abiertas. Al principio, configure la bomba peristáltica para dirigir el medio desde el flujo de entrada a la botella de salida a una velocidad de 5 rpm (consulte la Tabla 4).NOTA: Durante el cebado de la línea de tubería, la velocidad se puede aumentar hasta 10 rpm para acelerar el proceso. Encienda la bomba presionando el botón de inicio y asegúrese de que la dirección de la acción de bombeo sea en el sentido de las agujas del reloj. Una vez que el medio caiga en las botellas de salida, asegúrese de que no haya fugas y que no queden burbujas de aire en las líneas de tubería y los puntos de conexión. Elimine las burbujas restantes golpeando la tubería y los conectores o aumentando la velocidad de la bomba. Cuando todas las líneas de tubos caigan en las botellas de salida, ajuste el caudal a 2 rpm para conectar el dispositivo inicial. Cebado del dispositivoNOTA: Esta sección describe cómo cebar el dispositivo con medio de cultivo celular para garantizar que todas las cámaras estén llenas y precubiertas con medio, de modo que no queden burbujas en el sistema y las células puedan adherirse fácilmente durante la inoculación.El cebado del dispositivo se realiza en la cabina de bioseguridad en condiciones estériles. Para conectar el dispositivo, comience conectando la línea neuronal, la cámara inferior del dispositivo. Para conectar una línea, cierre las válvulas de llave de paso de tres vías (Figura 5C), comenzando primero por el lado de salida, donde el tubo corto se desconecta del conector Luer hembra y se conecta al puerto de salida del dispositivo, empujando el tubo sobre la lengüeta. Para garantizar una conexión adecuada y reducir la posibilidad de tener fugas y/o contaminación, asegúrese de que el tubo esté en contacto con la tapa empujándolo completamente hacia abajo sobre el conector. Conecte el tubo de entrada de la misma manera. Una vez que una línea esté completamente conectada al dispositivo (entrada y salida), abra las llaves de paso de tres vías. Repite el paso anterior con la línea epitelial, y luego con la línea bacteriana. Mantenga la bomba a un caudal de 2 rpm. Aumente la velocidad de la bomba a 2,5 rpm, pero no más, para evitar fugas debido a la acumulación de presión. Deje que la bomba cebe las cámaras del dispositivo. Controle los frascos de suero de salida en todo momento. Si las burbujas de aire se atascan en las cámaras, las líneas o el conector, una línea de tubería con una burbuja de aire en su interior ya no caerá en la cámara de salida. Para deshacerse de las burbujas de aire, primero deje que los dispositivos funcionen durante unos minutos. Si esto no resuelve el problema, cierre una de las otras líneas que están cayendo durante un corto período de tiempo cerrando la llave de paso de tres vías del flujo de salida. Una vez que todas las cámaras del dispositivo estén completamente cebadas, todas las cámaras se llenan con medio de cultivo celular y no quedan burbujas en el dispositivo, reduzca la velocidad de la bomba a 0,5 rpm. El dispositivo ya está listo para la inoculación celular. 4. Preparación e inoculación celular NOTA: En esta sección se describe cómo preparar los diferentes tipos de células necesarias para inocular el dispositivo, así como cómo inocularlas en el dispositivo de forma estéril y sin introducir burbujas de aire. Además, se describe cómo realizar el refresco del medio para las células neuronales y cómo preparar el medio para el cultivo bacteriano en el dispositivo. Células epitelialesSepare las células de Caco-2 del matraz utilizando ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA), vuelva a suspender en RPMI 1640 + 10% de FBS y cuente en un contador de células de Neubauer utilizando el ensayo de exclusión de azul de tripano. Centrifugar la suspensión celular de Caco-2 (3 min, 300 × g) y desechar el sobrenadante para eliminar la tripsina-EDTA restante. Resuspender las células Caco-2 en RMPI 1640 + 10% FBS para obtener una suspensión de 350.000 células/mL. Para cada dispositivo, se necesita un volumen de 1,5 ml. Transfiera 1,5 ml de la suspensión de células de Caco-2 a una jeringa estéril de 2 ml y elimine el aire o las burbujas que queden en la jeringa. Cierre las válvulas de llave de paso de tres vías de la tubería de las cámaras bacterianas y neuronales. Desconecte los tubos de las cámaras bacterianas y neuronales de la bomba retirando los casetes con el tubo respectivo del rotor. Abra la tapa de la válvula de llave de paso de tres vías de la tubería de entrada que conduce a la cámara epitelial y gire la válvula de llave de paso de tres vías para redirigir el flujo del medio desde el dispositivo hasta el “conector abierto” (Figura 5C). Deje que el medio fluya hasta que aparezca una gota de medio en el extremo abierto de la válvula de llave de paso de tres vías. Inserte la jeringa que contiene las células epiteliales en el “conector abierto” utilizando el método de conexión gota-gota para permitir la inserción de la jeringa en el conector sin la introducción de burbujas de aire. Gire la válvula de la llave de paso de tres vías para detener el flujo del medio desde la botella de entrada (a través de la bomba) y permitir el flujo desde la jeringa conectada hasta el dispositivo inicial. Desconecte el canal epitelial de la bomba. Presione lentamente la jeringa para inocular la cámara epitelial con la suspensión celular. Asegúrese de que aproximadamente una gota por cada 3 s caiga en la botella de salida. Agregue 1,5 ml de la suspensión de la celda, luego cierre la válvula de la llave de paso de tres vías de salida. Desconecte la jeringa y cierre el extremo abierto de la llave de paso de tres vías con la tapa. Mantenga la cámara cerrada durante al menos 2 h. Mientras tanto, inocular las células neuronales. Células neuronalesSepare las células neuronales del pocillo resuspendiendo las células en el medio de los pocillos respectivos con una pipeta. Inocular cada dispositivo con células totalmente confluentes de un pocillo (9,6 cm2) de una placa de 6 pocillos. Resuspender el gránulo celular en el volumen medio N2B27 correspondiente (1,5 ml de medio por dispositivo) + 1 μl de fibronectina/ml de suspensión celular. Transfiera 1,5 ml de la suspensión celular resuspendida a una jeringa de 2 ml y elimine las burbujas de aire que queden en la jeringa. Coloque la jeringa llena en un tubo cónico estéril de 50 ml y transfiérala a la cabina de bioseguridad que contiene el dispositivo HuMiX cebado. Siga el mismo proceso de inoculación descrito anteriormente para la inoculación en cámara epitelial, excepto por el cambio de línea de tubo. Aquí, desconecte las líneas de tubos bacterianos y epiteliales de la bomba. Después de la inoculación de las células neuronales, cierre todas las llaves de paso de tres vías de las líneas de tubo y desconéctelas de la bomba. Coloque el dispositivo en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2. Mantenga todos los canales cerrados durante 2 h para permitir que las células se adhieran. Después de 2 h, conecte los canales bacteriano y epitelial a la bomba y abra las llaves de paso de tres vías de entrada y salida de ambas líneas. Mantenga la cámara neuronal cerrada durante los próximos 14 días de la ejecución inicial del dispositivo, excepto durante el cambio de medio. Durante la carrera de 14 días, cambie el medio de la cámara neuronal cada 3-4 días. Para un enfriamiento medio, prepare 3 ml de medio N2B27 fresco por dispositivo y transfiéralo a un frasco de suero estéril de 20 ml. Cierre el frasco de suero con medio usando un tabique estéril y un sello de engarce de aluminio. Inserte una aireación y una aguja de 80 mm en el tabique de la nueva botella. Reemplace la botella de medios vieja por la nueva en la incubadora desconectando el Luer macho de la aguja de la botella vieja a la aguja de la botella nueva. Conecte el casete con el tubo de la bomba de la cámara neuronal a la bomba y abra las llaves de paso de tres vías. Deje que el medio fluya a 0,5 rpm durante 2 h antes de cerrar las llaves de paso de tres vías del tubo neuronal y desconectarse de la bomba, hasta el siguiente intercambio de medios. 5. Cultivo bacteriano e inoculación NOTA: En este estudio, el día 12, se reanimó un cultivo líquido de la cepa F275 de Limosilactobacillus reuteri a partir de un stock de glicerol. Dependiendo de las necesidades o de los diseños de los estudios, se pueden utilizar otras especies bacterianas. Prepare tres tubos con 5 mL de caldo MRS: un tubo de control estéril y dos para la inoculación de L. reuteri. Con un asa de inoculación, raspe la parte superior del caldo de glicerol y transfiéralo a un tubo. Repita con un segundo tubo de inoculación. Incubar los tubos a 37 °C, 170 rpm durante la noche.NOTA: No deje que el caldo de glicerol se descongele. Prepare el medio fresco para los dispositivos iniciales mezclando Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 + 10% FBS con 5% de caldo MRS. Prepare 25 ml por dispositivo y transfiéralo a frascos de suero de 100 ml en condiciones estériles. Cierre los frascos con un tabique estéril y un engarce de aluminio. Coloque los biberones en la incubadora a 37 °C, 5% de CO2 durante la noche. Antes de conectar los frascos a la línea de tubos bacterianos, agregue una aguja de aireación y una aguja de 80 mm a cada frasco de medios RPMI 1640/MRS. Prepare tubos nuevos, cada uno con 3 mL de caldo RPMI 1640 + 10% FBS + 5% MRS. Prepare al menos dos tubos, un control y un tubo por dispositivo. Inocular 15 μL de cultivo nocturno de L. reuteri (densidad óptica [DO] > 2) en dos de los tubos recién preparados. Incubar los tubos durante 1 h a 37 °C, 170 rpm, después de lo cual se alcanza un OD de 0,05-0,10, correspondiente a ~1 × 107 unidades formadoras de colonias (UFC)/mL. Transfiera 1,5 ml a una jeringa de 2 ml (una por dispositivo). Utilice el resto de la suspensión bacteriana para la colocación de placas de UFC y la tinción de vivos o muertos. Para la inoculación bacteriana del dispositivo, siga el mismo procedimiento que se mencionó en el paso 4.1, excepto que aquí las líneas de los tubos neuronales y epiteliales están cerradas. Después de la inoculación, cierre también la línea del tubo bacteriano, cerrando las válvulas y desconectando de la bomba durante 30 minutos. Conecte las líneas de los tubos epiteliales y bacterianos y ábralos de nuevo. Deje que los dispositivos funcionen durante otras 24 h a 37 °C y 0,5 rpm. 6. Apertura y muestreo de HuMiX NOTA: La siguiente sección describe el muestreo de diferentes tipos de células. Por ejemplo, los gránulos de células neuronales se utilizan para la extracción de ARN y la posterior reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), los gránulos bacterianos para la extracción de ADN y la secuenciación del gen ARNr 16S, y los sobrenadantes para ensayos de inmunoadsorción enzimática (ELISA) y otros ensayos (por ejemplo, ensayo de lactato). El día 14, el día de la inauguración, cierre todas las llaves de paso de tres vías, desconecte los tubos de la bomba y saque el dispositivo de la incubadora a la mesa de laboratorio.NOTA: Al mover el dispositivo, asegúrese de mantener el dispositivo real en posición horizontal. Retire las líneas de tubería conectadas al dispositivo antes de abrir lentamente la abrazadera y retire la tapa de la abrazadera. Con cuidado, retire la tapa superior de la PC, recoja los medios en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y colóquelo en hielo. Retire con cuidado la junta sándwich mientras recoge los medios de la cámara epitelial; Tenga cuidado de no tocar la capa celular. Coloque la junta sándwich en una placa de Petri cuadrada y agregue una solución estéril de NaCl al 0,9% en H2O a la cámara bacteriana hasta que la cámara esté completamente cubierta (aproximadamente 1 mL). Retire lentamente la junta de colágeno mientras recoge los medios de la cámara neuronal y los transfiere a un tubo de microcentrífuga. Coloque todos los tubos de medios sobre hielo. Coloque la junta de colágeno en un plato cuadrado y agregue suavemente unos mililitros de 1x PBS a la capa de Caco-2 hasta que la capa celular esté completamente cubierta. Coloque la tapa inferior de PC en una placa de Petri cuadrada y agregue suavemente aproximadamente 2 ml de 1x PBS en la parte superior de las células neuronales, para que no se sequen durante el proceso de muestreo. Centrifugar el tubo del medio bacteriano a 5.000 × g durante 5 min a 4 °C. Centrifugar los tubos de medios epiteliales y neuronales a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante de cada tubo a un nuevo tubo de microcentrífuga e inmediatamente colóquelo sobre hielo seco. Células epitelialesRetire suavemente el PBS de la junta y recójalo en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 2 mL de tripsina a las células e incubar la junta durante 5 min a 37 °C, 5% CO2. Agregue 2 ml de RPMI 1640 a la junta después de la incubación, vuelva a suspender las células y recolóquelas en otro tubo cónico de 15 ml. Centrifugar ambos tubos durante 5 min a 300 × g. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo del lavado de PBS en 300 μL de PBS y el gránulo celular en 1 mL de PBS. Transfiera 50 μl de cada tubo a un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml para el contador celular automatizado y el recuento de células del ensayo de exclusión de azul de tripano. Transfiera el gránulo de celda resuspendida (1 ml) a un tubo de 1,5 ml y centrifugue a 300 × g durante 5 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 250 μL de tampón de lisis + beta-mercaptoetanol al 1% y coloque el tubo sobre hielo seco. Células neuronalesLleve la placa de Petri cuadrada, con la tapa inferior transparente de PC con células neuronales del paso anterior (6.5) a un microscopio de contraste de fase invertida.NOTA: Al mover la tapa de la PC con PBS encima, tenga mucho cuidado, ya que la red neuronal se desprende muy fácilmente. Realizar un último control de calidad previo a la inoculación mediante la observación de la morfología y densidad celular de las células neuronales mediante microscopía de campo claro. Verifica que las células han migrado de los esferoides y que se ha formado una red neuronal. La red neuronal debe ser aproximadamente 90% confluente. Para más detalles, véase Fattahi et al.6. En el banco, resuspenda las células en PBS y recoléquelas en un tubo de 1,5 ml. Centrifugar el tubo a 300 × g durante 3 min. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo celular en 250 μL de tampón de lisis + 1% de beta-mercaptoetanol y colóquelo en hielo seco.NOTA: La tinción por inmunofluorescencia (IF) se puede realizar en las células neuronales de la tapa del PC. Si la tinción de FI es el ensayo preferido para no destruir la red neuronal, las células deben fijarse en la tapa del PC con paraformaldehído (PFA) al 4%, lo que impide la reutilización de la tapa del PC en futuros experimentos. Células bacterianasResuspender las células bacterianas adheridas a la membrana en una solución de NaCl al 0,9%. Si las células están firmemente adheridas, utilice suavemente un raspador celular para separar las células bacterianas de la membrana.NOTA: El uso de un raspador puede dañar las células, lo que aumenta la probabilidad de ver más células muertas. Recoja la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml. Agregue el gránulo sobrante del medio previamente recolectado al tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 5.000 × g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en 1 ml de solución de NaCl al 0,9%. Divida este volumen en tres partes: una para congelar un gránulo bacteriano para la extracción de ácido nucleico (650 μL), otra para la siembra de UFC (50 μL) en placas MRS y otra para la tinción viva/muerta (300 μL). Para la preparación del gránulo para la extracción de ácido nucleico, transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga, centrifugue a 5.000 × g durante 5 min a 4 °C y deseche el sobrenadante. Coloque el gránulo de celda sobre hielo seco. Al final de la toma de muestras, transfiera todos los tubos en hielo seco a un congelador a -80 °C para almacenarlos para análisis posteriores.NOTA: El sobrenadante se puede utilizar además para el análisis de cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). Además, durante la apertura, la membrana recubierta de colágeno se puede dividir en diferentes partes para diferentes análisis: una mitad se utilizará para la tinción de ocludina IF, otra parte para la extracción de ARN para un análisis posterior de la expresión génica y otra parte para el recuento celular.