Модель «кишечник-на-чипе» для изучения оси микробиом-нервная система кишечника

1. Культивирование и сортировка клеток Индуцированные плюрипотентные энтеральные нейроны, полученные из стволовых клетокПРИМЕЧАНИЕ: Культивируйте ИПСК за 6 недель до начала прогона. Протокол дифференциации для ЭН был адаптирован из Fattahi et al.6.Культивирование ИПСК на матричной 6-луночной планшете, покрытой гелем, в 2 мл/лунку питательной среды ИПСК с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина (P/S). При слиянии 80%-90% пассажируют клетки, засеивают в матричную пластину, покрытую гелем, используя ту же среду, инкубируют при 37 °C, 5%CO2 и относительной влажности (RH) 90%. Для получения ИПСК, после двух проходов после размораживания, при слиянии 80%-90%, клетки засевают в матричную 6-луночную пластину с гелевым покрытием с плотностью 100 000 клеток/лунку. Инкубируют в вышеописанной среде + ингибитор ROCK Y-27632 (1:2,000) в течение 24 ч при 37 °C. Через 24 ч замените надосадочную среду средой для приема на 0-й день в соответствии с таблицей 1. Включите одну контрольную лунку, которая будет использоваться в качестве отрицательного контроля во время сортировки клеток для процесса деривации. Хорошо держать контроль в составе среды Дня 0 в течение всего периода деривации. Меняйте среду через день со 2 по 10 день в соответствии с таблицей 1. На 11-й день отсортируйте клетки на CD49d-положительные клетки, которые будут использоваться на следующих этапах этого протокола.Объедините клетки, подлежащие сортировке, на основе CD49d-положительных клеток, а также контрольную скважину. Центрифугируют клетки в течение 3 мин при 300 × г. Ресуспендант клеточной гранулы в 2% бычьем сывороточном альбумине (BSA) + 1% P/S в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS). Разделите каждую партию клеток (объединенную и контрольную) на две части: одну фракцию окрасьте антителами к CD49d, а другую — антителами к контролю изотипа. Гейт основной клеточной популяции, а затем гейт одиночных клеток, на основе которого будут отобраны клетки, представляющие CD49d на своей поверхности. Соберите эти клетки для следующего этапа дифференцировки.ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно 30%-40% отсортированных клеток являются CD49d-положительными. Переложите от двух до четырех миллионов отсортированных клеток на одну 6-луночную пластину сверхнизкого присоединения в среде N2B27 (см. таблицу 2) + FGF2 + CHIR на 4 дня, чтобы обеспечить образование сфероида. На 15-й день перенесите сфероиды на 6-луночный планшет с покрытием из поли-L-орнитина/ламинина/фибронектина (P/L/F) в 2 мл/лунку среды N2B27 с GDNF и аскорбиновой кислотой (AA). Заменяйте средство каждые 2-3 дня.ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение покрытия: поли-L-орнитин, 15 мкг/мл; ламинин, 2 мкг/мл; фибронектин, 2 мкг/мл в 1х ПБС. Через 3 недели используйте клетки для посева в аппарате. Какао-2ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте клетки Caco-2 не менее чем за 1 неделю до запуска.Засейте колбу T75 с 1 × 106 клеток Caco-2 в добавке глютамина RPMI 1640 + HEPES + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS); инкубируют при 37 °C, 5%CO2 и относительной влажности 90%.ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих экспериментов в идеале используйте Caco-2 при их первом или втором прохождении после оттаивания. 2. Подготовка к запуску HuMiX Подготовка и покрытие крышки из поликарбонатаАвтоклавируйте пару крышек из поликарбоната (ПК) (рис. 2) вместе с четырьмя винтами, используя начальный приборный цикл устройства (подробнее см. Таблицу 3 ). В шкафу биобезопасности вставьте по четыре винта в каждый угол нижней крышки ПК (см. рисунок 3) и перенесите в стерильную квадратную чашку Петри для двухступенчатого процесса нанесения покрытия.В первый день добавьте 2 мл 1,5% поли-L-орнитина в PBS (1x) в середину крышки ПК. Инкубируйте в течение ночи при температуре 37 °C, 5%CO2 и относительной влажности 90%. На следующий день удалите раствор и замените его раствором, содержащим 0,2% ламинина и 0,2% фибронектина в PBS (1x), чтобы покрыть поверхность клеточной камеры нейрона. Инкубируйте крышку в течение ночи при температуре 37 °C, 5%CO2 и относительной влажности 90%. После инкубации держите раствор покрытия на крышке ПК и закройте чашку Петри герметизирующей пленкой. Поместите их при температуре 4 °C для хранения до использования. Перед использованием удалить раствор покрытия и высушить на воздухе в шкафу биобезопасности в течение 30 минут до полного высыхания покрытия. Подготовка прокладок и нанесение покрытияПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается, как подготовить прокладки путем приклеивания полупроницаемых мембран к силиконовым прокладкам. После начального этапа автоклавирования прокладки покрываются коллагеном или муцином, чтобы обеспечить адгезию эпителиальных клеток кишечника или бактерий. Мембрана, покрытая муцином, имитирует слизистый барьер, присутствующий в кишечнике человека.Прикрепите поликарбонатную мембрану размером 1 мкм к коллагеновой прокладке и поликарбонатную мембрану размером 50 нм между нижней и верхней сэндвич-прокладками. Автоклавируют прокладки с прикрепленными мембранами, используя начальный приборный цикл устройства (см. таблицу 3). Чтобы покрыть мембраны, поместите каждую прокладку в стерильную квадратную посуду.ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение покрытия производится в стерильных условиях в шкафу биобезопасности.Для коллагеновой прокладки добавьте 3 мл коллагена (50 мкг/мл) в мембрану и инкубируйте в течение 3 ч при 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не касайтесь мембраны наконечником пипетки при добавлении коллагена, чтобы не повредить мембрану. Для покрытия муцином поместите сэндвич-прокладку верхней стороной вверх в чашку Петри, чтобы покрыть верхнюю сторону мембраны 3 мл муцина (0,025 мг/мл). Инкубируют прокладки при 37 °C в течение 1 ч. По истечении инкубационного периода аспирируйте растворы коллагена и муцина из соответствующих прокладок и высушите мембрану на воздухе в шкафу биобезопасности в течение 30 минут. Закройте посуду, закройте лабораторной уплотнительной пленкой и храните прокладки при температуре 4 °C до использования. Монтаж насосно-компрессорных трубПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается, как собрать трубку для перфузии устройства. Перед сборкой автоклавируйте все детали и/или купите те, которые упакованы по отдельности в стерильную упаковку. Поместите все компоненты в шкаф биобезопасности.Используйте три трубки для каждого устройства и для каждой трубной линии, одну часть трубопровода насоса, две части длинных марпреновых трубок (20 см), две короткие марпреновые трубки (8 см), одну иглу 40 мм для бутылки для слива, одну иглу 120 мм для бутылок для притока 250 мл или иглу 80 мм для небольших бутылок для притока, три штекерных и семь гнездовых соединителей Luer-to-barb, три адаптера Luer и два трехходовых запорных крана. Соберите трубопроводы слева направо, используя автоклавные и стерилизованные компоненты, перечисленные выше (Рисунок 4).ПРИМЕЧАНИЕ: Распыляйте на каждый компонент 70% этанола между каждым этапом соединения. Подготовка материалаПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается, как подготовить среду для различных типов клеток в устройстве, а также как стерильно перенести среду во флаконы с сывороткой.Дополните RPMI 1640 10% фильтром 0,22 мкм, термоинактивированным FBS. Дополните носитель N2B27 новыми GDNF и AA. Перелейте средство во флаконы с сывороткой в стерильных условиях. Перенесите 200 мл среды RPMI 1640 во флаконы по 250 мл и 30 мл среды N2B27 во флаконы по 50 мл.Приготовьте бактериальную среду (RPMI 1640 + 10% FBS + 5% De Man, Rogosa и культуральную среду Shapre [MRS]) на более позднем этапе, так как это требуется только в течение последних 24 часов эксперимента. Закройте бутылки перегородкой, обжмите их алюминием и автоклавом. Для переноса носителя снимите алюминиевый обжим с помощью соответствующего укупорщика (диаметр = 20 мм). Также удалите перегородку. Осторожно разлейте приготовленное средство по флаконам с сывороткой, не прикасаясь к флакону. Для стерилизации подожгите отверстие бутылки с помощью портативной горелки Бунзена. Запечатайте бутылки, распылив на перегородку 70% этилового спирта, добавив его в бутылку и закрыв ее алюминиевым обжимом с помощью обжимного устройства для уплотнения. Закрытые флаконы поместить в инкубатор при температуре 37 °С, 5%СО2 на 24 ч для прогрева среды до 37 °С, а также убедиться в отсутствии видимых признаков загрязнения перед использованием флаконов со средой для устройства. 3. Запуск HuMiX Сборка NeuroHuMiXПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе объясняется, как собрать устройство. Короче говоря, зажимная система стерилизуется и снова затягивается, после чего нижняя крышка из поликарбоната помещается на основание зажима. Затем прокладки с покрытием и верхние крышки из поликарбоната укладываются друг на друга, а затем верхняя часть хомута. Наконец, зажим затягивается, чтобы сжать прокладки и сделать систему герметичной и газонепроницаемой. На рисунке 4 показаны различные детали, необходимые для сборки.Перед сборкой автоклавируйте зажимы и две крышки из поликарбоната (верхнюю и нижнюю). Затяните винты, используемые для сборки верхней и нижней частей зажима (Рисунок 4C, D). Откройте винты перед процессом автоклавирования и затяните их позже. Переместите покрытую и высушенную (шаг 2.2.3) нижнюю крышку ПК (Рисунок 4 A1) из квадратной чашки Петри в верхнюю часть основания зажима, удерживая четыре винта в углах крышки ПК.ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к крышке ПК, чтобы снизить риск загрязнения. Стерильным пинцетом поместите прокладку эпителиальной камеры вверх (т.е. мембраной сверху) на крышку поликарбоната. С помощью винтов выровняйте прокладку и крышку из поликарбоната, чтобы впускные и выпускные отверстия в углах крышки совпали с отверстиями в прокладке (Рисунок 3). С помощью стерильного пинцета поместите прокладку для сэндвича поверх коллагеновой прокладки верхней стороной вверх. Поместите верхнюю крышку ПК поверх сэндвич-прокладки. Чтобы снизить риск загрязнения, делайте это, прикасаясь только к краям крышки (не прикасайтесь к верхней или нижней части крышки). Убедитесь, что заусеницы на крышке зажима совпадают с входным и выпускным отверстиями мембраны в сборе, а винты от нижней крышки ПК входят в отверстие верхней крышки ПК. Чтобы закрыть устройство, поместите зажимную крышку (верхнюю часть зажима) поверх крышки ПК. Убедитесь, что отверстия крышки совпадают с входными и выпускными зазубринами верхней крышки из поликарбоната. Закройте защелки. Держите закрытое устройство (Рисунок 5) под колпаком, чтобы подключить его к загрунтованным трубопроводам (шаг 3.2.6). Грунтовка насосно-компрессорных трубПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается, как подсоединить трубку к бутылкам для входа и выхода, а также к насосу, затем заправить трубку средой для удаления любых остатков продуктов, используемых во время очистки и стерилизации, и убедиться, что в трубке нет пузырьков.Грунтовка насосно-компрессорных труб производится в шкафу биобезопасности. Вставьте аэрационные иглы с фильтрами в перегородку каждой входной и выходной бутылки. Чистым стерильным пинцетом вставьте иглы диаметром 120 мм во флаконы с сывороткой объемом 250 мл. Вставьте иглы диаметром 80 мм во флаконы с сывороткой объемом 50 мл. Вставьте иглы диаметром 40 мм в конце каждой трубки во флакон с сывороткой. В каждом устройстве имеется две выпускные бутылки для трех трубопроводных линий. 40-миллиметровые иглы линии эпителиальных и нейрональных трубок соединены с одной и той же бутылкой для слива среды. Линия бактериальной трубки идет ко второму выпускному флакону. Вставьте трубопроводы насоса в кассеты насоса. Убедитесь, что все трехходовые запорные краны трубопроводов открыты. В начале настройте перистальтический насос так, чтобы он направлял среду из впускной бутылки в бутылку для слива со скоростью 5 об/мин (см. таблицу 4).ПРИМЕЧАНИЕ: Во время заливки трубопровода скорость может быть увеличена до 10 об/мин для ускорения процесса. Запустите насос, нажав кнопку запуска , и убедитесь, что направление откачки – по часовой стрелке. После того, как среда попадет в бутылки для слива, убедитесь, что в трубопроводах трубок и точках соединения не осталось утечек и пузырьков воздуха. Удалите оставшиеся пузырьки, постукивая по трубкам и соединителям или увеличивая скорость насоса. Когда все трубные линии опускаются в бутылки для слива, установите скорость потока на 2 об/мин для подключения начального устройства. Грунтовка прибораПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается, как заправить устройство питательной средой для клеток, чтобы убедиться, что все камеры заполнены и предварительно покрыты средой, чтобы в системе не осталось пузырьков и клетки могли легко прилипнуть во время инокуляции.Грунтовка прибора производится в шкафу биобезопасности в стерильных условиях. Чтобы подключить устройство, начните с подключения нейронной линии, нижней камеры устройства. Чтобы подключить линию, закройте трехходовые запорные краны (Рисунок 5C), начиная сначала со стороны выхода, где короткая трубка отсоединяется от гнездового соединителя Луэра и подключается к выпускному порту устройства, проталкивая трубку через зазубрину. Чтобы обеспечить правильное соединение и снизить вероятность утечек и/или загрязнения, убедитесь, что трубка соприкасается с крышкой, надавив на нее до упора на соединитель. Таким же образом подсоедините впускную трубку. После того, как одна линия будет полностью подключена к устройству (приток и выпуск), откройте трехходовые запорные краны. Повторите предыдущий шаг с эпителиальной линией, а затем с бактериальной линией. Поддерживайте скорость потока насоса 2 об/мин. Увеличьте частоту вращения насоса до 2,5 об/мин, но не выше, чтобы избежать утечек из-за повышения давления. Дайте насосу заполнить камеры в устройстве. Постоянно контролируйте количество флаконов с сывороткой. Если пузырьки воздуха застревают в камерах, трубопроводах или соединителе, трубопровод с пузырьком воздуха внутри больше не будет опускаться в камеру слива. Чтобы избавиться от пузырьков воздуха, сначала дайте устройствам поработать в течение нескольких минут. Если это не решит проблему, закройте одну из других линий, которые падают, на короткое время, закрыв трехходовой запорный кран слива. После того, как все камеры аппарата будут полностью заполнены питательной средой для клеточных культур и в аппарате не останется пузырьков, уменьшите частоту вращения насоса до 0,5 об/мин. Теперь устройство готово к клеточной инокуляции. 4. Подготовка клеток и посев ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается, как подготовить различные типы клеток, необходимых для инокуляции устройства, а также как засеять их в устройство стерильным способом и без введения пузырьков воздуха. Кроме того, в нем описывается, как выполнить освежение среды для нейрональных клеток и как подготовить среду для бактериальной культуры в устройстве. Эпителиальные клеткиОтделите клетки Caco-2 от колбы с помощью трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), ресуспендируйте в RPMI 1640 + 10% FBS и подсчитайте в счетчике клеток Нойбауэра с помощью анализа исключения трипанового синего. Центрифугируют клеточную суспензию Caco-2 (3 мин, 300 × г) и выбрасывают надосадочную жидкость для удаления оставшегося трипсина-ЭДТА. Ресуспендировать клетки Caco-2 в RMPI 1640 + 10% FBS для получения суспензии 350 000 клеток/мл. Для каждого прибора необходим объем 1,5 мл. Перелейте 1,5 мл клеточной суспензии Caco-2 в стерильный шприц объемом 2 мл и удалите весь воздух или пузырьки, оставшиеся в шприце. Закройте трехходовые запорные краны трубок бактериальной и нейрональной камер. Отсоедините трубки бактериальной и нейрональной камер от насоса, сняв кассеты с соответствующими трубками с ротора. Откройте крышку трехходового запорного клапана впускной трубки, ведущей к эпителиальной камере, и поверните трехходовой запорный клапан, чтобы перенаправить поток среды от устройства к «открытому соединителю» (рис. 5C). Дайте среде течь до тех пор, пока капля среды не появится на открытом конце трехходового запорного крана. Вставьте шприц, содержащий эпителиальные клетки, в «открытый коннектор», используя метод «капля-капля», чтобы шприц можно было ввести в коннектор без введения пузырьков воздуха. Поверните клапан трехходового запорного крана, чтобы остановить поток среды из входного флакона (через насос) и обеспечить поток из подключенного шприца к исходному устройству. Отсоедините эпителиальный канал от помпы. Медленно нажмите на шприц, чтобы засеять эпителиальную камеру клеточной суспензией. Следите за тем, чтобы примерно одна капля каждые 3 с попадала в сливную бутылку. Добавьте 1,5 мл суспензии ячейки, затем закройте клапан выпускного трехходового запорного крана. Отсоедините шприц и закройте открытый конец трехходового запорного крана колпачком. Держите камеру закрытой не менее 2 ч. Тем временем инокулируйте нейронные клетки. Нейрональные клеткиОтделите нейрональные клетки от лунки, повторно суспендировав клетки среды из соответствующих лунок с помощью пипетки. Инокуляция каждого устройства полностью сливающимися клетками из одной лунки (9,6см2) 6-луночной пластины. Ресуспендант клеточной гранулы в соответствующем объеме среды N2B27 (1,5 мл среды на устройство) + 1 мкл фибронектина/мл клеточной суспензии. Перелейте 1,5 мл ресуспендированной клеточной суспензии в шприц объемом 2 мл и удалите все пузырьки воздуха, оставшиеся в шприце. Поместите заполненный шприц в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл и перенесите в шкаф биобезопасности, содержащий загрунтованное устройство HuMiX. Следуйте тому же процессу посева, который был описан ранее для инокуляции эпителиальной камеры, за исключением замены линии трубки. Здесь отсоедините бактериальную и эпителиальную трубки от насоса. После посева нейрональных клеток закройте все трехходовые запорные краны трубных линий и отсоедините от насоса. Поместите прибор в инкубатор при температуре 37 °C и 5% CO2. Держите все каналы закрытыми в течение 2 часов, чтобы клетки могли прикрепиться. Через 2 ч подсоедините бактериальный и эпителиальный каналы к насосу и откройте входной и выпускной трехходовые запорные краны обеих линий. Держите нейронную камеру закрытой в течение следующих 14 дней после первоначального запуска устройства, за исключением времени смены среды. В течение 14-дневного бега меняйте среду нейронной камеры каждые 3-4 дня. Для среднего обновления приготовьте 3 мл свежей среды N2B27 на устройство и перелейте в стерильный флакон с сывороткой объемом 20 мл. Закройте флакон с сывороткой со средой, используя стерильную перегородку и алюминиевую обжимную пломбу. Вставьте аэрацию и иглу диаметром 80 мм в перегородку новой бутылки. Замените старую бутылку со средой на новую в инкубаторе, отсоединив самца Люэра от иглы старой бутылки к игле новой бутылки. Соедините кассету с трубкой насоса нейронной камеры к насосу и откройте трехходовые запорные краны. Дайте среде течь со скоростью 0,5 об/мин в течение 2 ч, прежде чем закрыть трехходовые запорные краны нейрональной трубки и отсоединиться от насоса до следующей замены среды. 5. Бактериальный посев и посев ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании на 12-й день жидкую культуру Limosilactobacillus reuteri штамма F275 реанимировали из глицеринового запаса. В зависимости от потребностей или дизайна исследования могут быть использованы другие виды бактерий. Приготовьте три пробирки с 5 мл бульона MRS – одну стерильную контрольную пробирку и две для посева L. reuteri. С помощью инокуляционной петли соскребите верхнюю часть глицеринового бульона и переложите его в одну пробирку. Повторите то же самое со второй прививочной пробиркой. Инкубируйте пробирки при температуре 37 °C, 170 об/мин в течение ночи.ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте бульону глицерина оттаять. Приготовьте свежую среду для начальных устройств, смешав Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 + 10% FBS с 5% бульоном MRS. Приготовьте 25 мл на устройство и перелейте во флаконы с сывороткой по 100 мл в стерильных условиях. Закройте бутылки стерильной перегородкой и алюминиевым обжимом. Поместите бутылочки в инкубатор при температуре 37 °C, 5%CO2 на ночь. Перед подключением флаконов к бактериальной трубке добавьте аэрационную иглу и иглу 80 мм в каждый флакон с фильтрующим материалом RPMI 1640/MRS. Приготовьте новые пробирки, в каждой из которых будет 3 мл RPMI 1640 + 10% бульона FBS + 5% MRS. Подготовьте не менее двух пробирок, одну контрольную и одну пробирку на устройство. Посев 15 мкл ночной культуры L. reuteri (оптическая плотность [OD] > 2) в две из вновь подготовленных пробирок. Инкубируют пробирки в течение 1 ч при 37 °C, 170 об/мин, после чего достигают наружного диаметра 0,05-0,10, что соответствует ~1 × 107 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл. Перелейте 1,5 мл в шприц объемом 2 мл (по одному на устройство). Используйте оставшуюся бактериальную суспензию для покрытия КОЕ и окрашивания живым/мертвым цветом. Для бактериального посева устройства выполните ту же процедуру, что и на шаге 4.1, за исключением того, что здесь линии нейрональной и эпителиальной трубок закрыты. После инокуляции также закройте линию бактериальной трубки, закрыв клапаны и отключив от насоса на 30 минут. Соедините эпителиальную и бактериальную трубки и снова откройте. Дайте устройствам поработать еще 24 часа при температуре 37 °C и 0,5 об/мин. 6. Вскрытие и отбор проб HuMiX ПРИМЕЧАНИЕ: В разделе ниже описана выборка различных типов ячеек. Например, гранулы нейрональных клеток используются для экстракции РНК и последующей количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), бактериальные гранулы — для экстракции ДНК и секвенирования гена 16S рРНК, а супернатанты — для иммуноферментного анализа (ИФА) и других анализов (например, анализа лактата). На 14-й день, в день открытия, закройте все трехходовые запорные краны, отсоедините трубки от насоса и выньте устройство инкубатора на лабораторный стол.ПРИМЕЧАНИЕ: При перемещении устройства убедитесь, что оно находится в горизонтальном положении. Перед медленным открытием зажима снимите трубки, подключенные к устройству, и снимите крышку зажима. Осторожно снимите верхнюю крышку ПК, соберите среду в пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл и поместите ее на лед. Аккуратно снимите сэндвич-прокладку, собирая при этом среду из эпителиальной камеры; Будьте осторожны, чтобы не прикоснуться к клеточному слою. Поместите прокладку для сэндвича в квадратную чашку Петри и добавьте стерильный 0,9% раствор NaCl вH2Oв бактериальную камеру до тех пор, пока камера не будет полностью покрыта (примерно 1 мл). Медленно извлеките коллагеновую прокладку, собирая среду из нейронной камеры и перенося ее в микроцентрифужную пробирку. Поместите все трубки носителя на лед. Поместите коллагеновую прокладку в квадратную чашку и осторожно добавьте несколько миллилитров 1x PBS в слой Caco-2, пока клеточный слой не будет полностью покрыт. Поместите нижнюю крышку ПК в квадратную чашку Петри и осторожно добавьте примерно 2 мл 1x PBS поверх нейрональных клеток, чтобы они не высохли в процессе отбора проб. Центрифугируют пробирку с бактериальной средой при 5 000 × г в течение 5 мин при 4 °C. Центрифугируют эпителиальные и нейрональные пробирки при 300 × г в течение 5 мин при 4 °С. После центрифугирования перелейте надосадочную жидкость из каждой пробирки в новую пробирку микроцентрифуги и сразу же поместите ее на сухой лед. Эпителиальные клеткиАккуратно снимите PBS с прокладки и соберите в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте 2 мл трипсина к клеткам и инкубируйте прокладку в течение 5 мин при 37 °C, 5% CO2. Добавьте 2 мл RPMI 1640 в прокладку после инкубации, повторно суспендируйте клетки и соберите в другую коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугируют обе пробирки в течение 5 мин при 300 × г. Выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте гранулу из промывки PBS в 300 мкл PBS и клеточную гранулу в 1 мл PBS. Перелейте 50 мкл каждой пробирки в пробирку для микроцентрифуги объемом 0,5 мл для автоматического счетчика клеток и подсчета клеток для анализа на трипановый синий эксклюзионный анализ. Переложите ресуспендированную клеточную гранулу (1 мл) в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугу при 300 × г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 250 мкл лизисного буфера + 1% бета-меркаптоэтанола и поместите пробирку на сухой лед. Нейрональные клеткиВозьмите квадратную чашку Петри с нижней прозрачной крышкой из поликарбоната с нейрональными клетками из предыдущего шага (6,5) для инвертированного фазово-контрастного микроскопа.ПРИМЕЧАНИЕ: Перемещая крышку ПК с PBS поверх нее, будьте очень осторожны, так как нейронная сеть очень легко отсоединяется. Выполните последнюю проверку качества перед инокуляцией, наблюдая за морфологией и плотностью клеток нейронов с помощью светлопольной микроскопии. Убедитесь, что клетки мигрировали из сфероидов и сформировалась нейронная сеть. Нейронная сеть должна сливаться примерно на 90%. Для получения более подробной информации см. Fattahi et al.6. На стенде ресуспендируйте клетки в PBS и соберите в пробирку объемом 1,5 мл. Центрифугируют пробирку при 300 × г в течение 3 мин. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 250 мкл лизисного буфера + 1% бета-меркаптоэтанола и поместите на сухой лед.ПРИМЕЧАНИЕ: Иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание может быть выполнено на нейрональных клетках на крышке ПК. Если окрашивание ПФ является предпочтительным анализом, чтобы не разрушить нейронную сеть, клетки должны быть зафиксированы на крышке ПК с 4% параформальдегидом (PFA), что препятствует повторному использованию крышки ПК в будущих экспериментах. Бактериальные клеткиРесуспендировать бактериальные клетки, прикрепленные к мембране, в 0,9% растворе NaCl. Если клетки прочно прикреплены, осторожно используйте скребок для клеток, чтобы отделить бактериальные клетки от мембраны.ПРИМЕЧАНИЕ: Использование скребка может повредить клетки, увеличивая вероятность увидеть больше мертвых клеток. Соберите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте гранулы, оставшиеся от ранее собранной среды, в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифугу при 5 000 × г в течение 5 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл 0,9% раствора NaCl. Разделите этот объем на три части: одну для замораживания бактериальной гранулы для экстракции нуклеиновых кислот (650 мкл), одну для покрытия КОЕ (50 мкл) на пластинах MRS и одну для живого/мертвого окрашивания (300 мкл). Для приготовления гранулы для экстракции нуклеиновых кислот переносят клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку, центрифугируют при 5 000 × г в течение 5 мин при 4 °С и выбрасывают надосадочную жидкость. Поместите клеточную гранулу на сухой лед. По окончании отбора проб переложите все пробирки на сухом льду в морозильную камеру с температурой -80 °C для хранения для последующего анализа.ПРИМЕЧАНИЕ: Надосадочную жидкость можно в дальнейшем использовать для анализа газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Кроме того, во время вскрытия мембрана, покрытая коллагеном, может быть разделена на разные части для различных анализов: одна часть будет использоваться для окклюдинового окрашивания, другая часть для экстракции РНК для дальнейшего анализа экспрессии генов, а третья часть для подсчета клеток.