Un modello gut-on-a-chip per studiare l'asse microbioma intestinale-sistema nervoso

1. Coltura cellulare e cernita Neuroni enterici derivati da cellule staminali pluripotenti indotteNOTA: Coltivare le iPSC 6 settimane prima dell’inizio di una corsa. Il protocollo di differenziazione per le EN è stato adattato da Fattahi et al.6.Coltura delle iPSC su una piastra a 6 pozzetti rivestita di gel in 2 ml/pozzetto di terreno di coltura iPSC integrato con penicillina-streptomicina (P/S) all’1%. All’80%-90% di confluenza, far passare le cellule, seminare in una piastra rivestita di gel a matrice utilizzando lo stesso terreno, incubare a 37 °C, 5% di CO2 e 90% di umidità relativa (RH). Per la derivazione delle iPSC, dopo due passaggi dopo lo scongelamento, all’80%-90% di confluenza, seminare le cellule in una piastra a 6 pozzetti rivestita di gel a matrice con una densità di 100.000 cellule/pozzetto. Incubare nel terreno sopra descritto + inibitore ROCK Y-27632 (1:2.000) per 24 ore a 37 °C. Dopo 24 ore, sostituire il terreno surnatante con il terreno del giorno 0, secondo la Tabella 1. Includere un pozzetto di controllo da utilizzare come controllo negativo durante l’ordinamento delle cellule per il processo di derivazione. Mantenere bene il controllo nella composizione del terreno del giorno 0 per l’intero periodo di derivazione. Cambiare il mezzo a giorni alterni dal giorno 2 al giorno 10, secondo la Tabella 1. Il giorno 11, ordinare le cellule per le cellule CD49d-positive, che verranno utilizzate nei passaggi successivi di questo protocollo.Raggruppare le cellule da ordinare in base alle cellule CD49d-positive, nonché il pozzetto di controllo. Centrifugare le cellule per 3 minuti a 300 × g. Risospendere il pellet cellulare in albumina sierica bovina al 2% (BSA) + 1% P/S in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Dividi ogni lotto di cellule (raggruppate e di controllo) in due: colora una frazione con l’anticorpo anti-CD49d umano e l’altra frazione con un anticorpo di controllo dell’isotipo. Gate la popolazione cellulare principale e poi gate le singole cellule, in base alle quali verranno selezionate le cellule che presentano CD49d sulla loro superficie. Raccogli queste cellule per la fase successiva della differenziazione.NOTA: Di solito, il 30%-40% delle cellule ordinate sono CD49d-positive. Trasferire da due a quattro milioni di cellule selezionate in una piastra a 6 pozzetti di una piastra a bassissimo attacco in terreni N2B27 (vedere Tabella 2) + FGF2 + CHIR per 4 giorni per consentire la formazione di sferoidi. Il giorno 15, riplaccare gli sferoidi su una piastra a 6 pozzetti rivestita di poli-L-ornitina/laminina/fibronectina (P/L/F) in 2 ml/pozzetto di terreno N2B27 con GDNF e acido ascorbico (AA). Sostituire il mezzo ogni 2-3 giorni.NOTA: Rapporto di rivestimento: poli L-ornitina, 15 μg/mL; laminina, 2 μg/mL; fibronectina, 2 μg/mL in 1x PBS. Dopo 3 settimane, utilizzare le cellule per l’inoculazione nel dispositivo. Caco-2NOTA: Scongelare le cellule Caco-2 almeno 1 settimana prima di una corsa.Seminare un pallone T75 con 1 × 106 cellule Caco-2 in integratore di glutammina RPMI 1640 + HEPES + 10% di siero fetale bovino (FBS); incubare a 37 °C, 5% di CO2 e 90% di umidità relativa.NOTA: Per questi esperimenti, utilizzare idealmente Caco-2 al primo o al secondo passaggio dopo lo scongelamento. 2. Preparazione della corsa HuMiX Preparazione e rivestimento del coperchio in policarbonatoSterilizzare in autoclave una coppia di coperchi in policarbonato (PC) (Figura 2) insieme a quattro viti utilizzando il ciclo iniziale dello strumento del dispositivo (vedere la Tabella 3 per i dettagli). In una cabina di biosicurezza, inserire quattro viti in ciascun angolo del coperchio inferiore del PC (vedere la Figura 3) e trasferire in una capsula di Petri quadrata sterile per un processo di rivestimento in due fasi.Il primo giorno, aggiungere 2 ml di poli-ornitina all’1,5% in PBS (1x) al centro del coperchio del PC. Incubare per una notte a 37 °C, 5% di CO2 e 90% di umidità relativa. Il giorno successivo, rimuovere la soluzione e sostituirla con una soluzione contenente lo 0,2% di laminina e lo 0,2% di fibronectina in PBS (1x) per coprire la superficie della camera cellulare neuronale. Incubare il coperchio per una notte a 37 °C, 5% di CO2 e 90% di umidità relativa. Dopo l’incubazione, tenere la soluzione di rivestimento sul coperchio del PC e chiudere la capsula di Petri con una pellicola sigillante. Collocarli a 4 °C per la conservazione fino al momento dell’uso. Prima dell’uso, rimuovere la soluzione di rivestimento e asciugare all’aria in una cabina di sicurezza biologica per 30 minuti fino a quando il rivestimento non è completamente asciutto. Preparazione e rivestimento della guarnizioneNOTA: Questa sezione descrive come preparare le guarnizioni incollando membrane semipermeabili alle guarnizioni in silicone. Dopo una prima fase di sterilizzazione in autoclave, le guarnizioni vengono rivestite con collagene o mucina per consentire l’adesione di cellule epiteliali intestinali o batteri. La membrana rivestita di mucina imita la barriera di muco presente nell’intestino umano.Collegare una membrana in policarbonato con pori da 1 μm alla guarnizione in collagene e una membrana in policarbonato con pori da 50 nm tra le guarnizioni sandwich inferiore e superiore. Autoclavare le guarnizioni con le membrane attaccate utilizzando il ciclo iniziale dello strumento del dispositivo (vedi Tabella 3). Per rivestire le membrane, posizionare ciascuna guarnizione in un piatto quadrato sterile.NOTA: Il rivestimento viene eseguito in condizioni sterili in una cabina di biosicurezza.Per la guarnizione di collagene, aggiungere 3 mL di collagene (50 μg/mL) alla membrana e incubare per 3 ore a 37 °C.NOTA: Fare attenzione a non toccare la membrana con la punta della pipetta quando si aggiunge il collagene per evitare di danneggiare la membrana. Per il rivestimento della mucina, posizionare la guarnizione a sandwich con il lato superiore della guarnizione rivolto verso l’alto in una capsula di Petri per rivestire il lato superiore della membrana con 3 mL di mucina (0,025 mg/mL). Incubare le guarnizioni a 37 °C per 1 h. Trascorso il tempo di incubazione, aspirare le soluzioni di collagene e mucina dalle rispettive guarnizioni e asciugare la membrana all’aria in una cabina di biosicurezza per 30 minuti. Chiudere le stoviglie, sigillare con pellicola sigillante da laboratorio e conservare le guarnizioni a 4 °C fino all’uso. Assemblaggio di tubiNOTA: Questa sezione descrive come assemblare il tubo per la perfusione del dispositivo. Prima dell’assemblaggio, sterilizzare in autoclave tutti i pezzi e/o acquistare quelli confezionati singolarmente in una confezione sterile. Collocare tutti i componenti in una cabina di biosicurezza.Utilizzare tre tubi per ciascun dispositivo e per ogni tubo tubolare, un pezzo di tubo della pompa, due pezzi di tubo Marprene lungo (20 cm), due pezzi di tubo Marprene corto (8 cm), un ago da 40 mm per il flacone di deflusso, un ago da 120 mm per i flaconi di afflusso da 250 ml o ago da 80 mm per i flaconi di afflusso più piccoli, tre connettori Luer a barb maschio e sette femmina, tre adattatori Luer e due valvole a rubinetto a tre vie. Assemblare le linee di tubi da sinistra a destra utilizzando i componenti sterilizzati e sterilizzati in autoclave sopra elencati (Figura 4).NOTA: Spruzzare ogni componente con etanolo al 70% tra ogni fase di connessione. Preparazione dei supportiNOTA: Questa sezione descrive come preparare il terreno per i diversi tipi di cellule nel dispositivo, nonché come trasferire il terreno nei flaconi di siero in modo sterile.Supplemento RPMI 1640 con FBS filtrato al 10% da 0,22 μm e inattivato termicamente. Integrare i terreni N2B27 con GDNF e AA. Trasferire il terreno nei flaconi di siero in condizioni sterili. Trasferire 200 mL di terreno RPMI 1640 in flaconi da 250 mL e 30 mL di terreno N2B27 in flaconi da 50 mL.Preparare il terreno batterico (RPMI 1640 + 10% FBS + 5% terreno di coltura De Man, Rogosa e Shapre [MRS]) in una fase successiva, poiché ciò è necessario solo durante le ultime 24 ore dell’esperimento. Chiudere le bottiglie con un setto nasale, crimparle in alluminio e sterilizzarle in autoclave. Per trasferire il supporto, rimuovere la crimpatura in alluminio utilizzando un apposito decapsulatore (diametro = 20 mm). Rimuovere anche il setto. Versare con cautela il terreno preparato nei flaconi di siero senza toccare il flacone. Per sterilizzare, fiammare l’apertura del flacone utilizzando un bruciatore Bunsen portatile. Sigillare le bottiglie spruzzando il setto con etanolo al 70%, aggiungendolo alla bottiglia e chiudendola con una crimpatura di alluminio utilizzando una crimpatrice di tenuta. Mettere i flaconi chiusi nell’incubatore a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore per riscaldare il terreno a 37 °C, nonché per assicurarsi che non vi siano segni visibili di contaminazione prima di utilizzare i flaconi di terreno per il dispositivo. 3. Avvio di HuMiX Assemblaggio NeuroHuMiXNOTA: Questa sezione spiega come assemblare il dispositivo. In breve, il sistema di bloccaggio viene sterilizzato e ristretto, dopodiché il coperchio inferiore del PC viene posizionato sulla base del morsetto. Quindi, le guarnizioni rivestite e i coperchi superiori in PC vengono impilati l’uno sull’altro, seguiti dalla parte superiore del morsetto. Infine, il morsetto viene serrato per comprimere le guarnizioni e rendere il sistema privo di perdite e a tenuta di gas. La Figura 4 illustra le diverse parti necessarie per l’assemblaggio.Autoclavare i morsetti e i due coperchi del PC (superiore e inferiore) prima del montaggio. Serrare le viti utilizzate per assemblare le parti superiore e inferiore del morsetto (Figura 4C,D). Aprire le viti prima del processo di sterilizzazione in autoclave e serrarle nuovamente in seguito. Trasferire il coperchio inferiore del PC rivestito e asciugato (passaggio 2.2.3) (Figura 4 A1) dalla piastra di Petri quadrata alla parte superiore della base del morsetto tenendo le quattro viti negli angoli del coperchio del PC.NOTA: Evitare di toccare il coperchio del PC per ridurre il rischio di contaminazione. Posizionare la guarnizione della camera epiteliale rivolta verso l’alto (cioè con la membrana in alto) sul coperchio del PC utilizzando una pinzetta sterile. Utilizzare le viti per allineare la guarnizione e il coperchio del PC per assicurarsi che le porte di ingresso e uscita negli angoli del coperchio siano allineate con le aperture della guarnizione (Figura 3). Usando le pinzette sterili, posiziona la guarnizione a sandwich sopra la guarnizione in collagene, con il lato superiore rivolto verso l’alto. Posizionare il coperchio superiore del PC sopra la guarnizione a sandwich. Per ridurre il rischio di contaminazione, farlo toccando solo i bordi del coperchio (non toccare la parte superiore o inferiore del coperchio). Assicurarsi che le spine sul clamp coperchio allineato con l’ingresso e l’apertura di uscita sul gruppo membrana e che le viti del coperchio del PC inferiore si inseriscano nell’apertura del coperchio del PC superiore. Per chiudere il dispositivo, posizionare il coperchio del morsetto (la parte superiore del morsetto) sopra il coperchio del PC. Assicurarsi che le aperture del coperchio coincidano con le alette di ingresso e uscita del coperchio superiore del PC. Chiudere i fermi. Tenere il dispositivo chiuso (Figura 5) sotto il cofano per collegarlo alle linee di tubi adescate (passaggio 3.2.6). Adescamento di linee di tubiNOTA: Questa sezione descrive come collegare il tubo alle bottiglie di ingresso e di uscita, nonché alla pompa, successivamente adescare il tubo con il fluido per rimuovere eventuali residui di prodotti utilizzati durante la pulizia e la sterilizzazione e assicurarsi che non siano presenti bolle nel tubo.L’adescamento delle linee di tubi viene eseguito nella cabina di biosicurezza. Inserire aghi di aerazione con filtri nel setto di ogni bottiglia di afflusso e deflusso. Utilizzando una pinzetta pulita e sterile, inserire gli aghi da 120 mm nei flaconi di siero da 250 ml. Inserire gli aghi da 80 mm nei flaconi di siero da 50 ml. Inserire gli aghi da 40 mm, all’estremità di ciascuna linea di tubi, in un flacone di siero in uscita. Per ogni dispositivo, ci sono due bottiglie di deflusso per le tre linee di tubi. Gli aghi da 40 mm delle linee di tubi epiteliali e neuronali sono collegati allo stesso flacone di deflusso per lo scarto del mezzo. La linea del tubo batterico va al secondo flacone di deflusso. Inserire le tubazioni della pompa nelle cassette della pompa. Assicurarsi che i rubinetti a tre vie delle linee dei tubi siano tutti aperti. All’inizio, impostare la pompa peristaltica in modo che diriga il fluido dall’afflusso al flacone di uscita a una velocità di 5 giri/min (vedere la Tabella 4).NOTA: Durante l’adescamento della linea di tubi, la velocità può essere aumentata fino a 10 giri/min per accelerare il processo. Avviare la pompa premendo il pulsante di avvio e assicurarsi che la direzione dell’azione di pompaggio sia in senso orario. Una volta che il fluido cade nelle bottiglie di deflusso, assicurarsi che non vi siano perdite e che non rimangano bolle d’aria nelle linee dei tubi e nei punti di connessione. Rimuovere eventuali bolle rimanenti picchiettando il tubo e i connettori o aumentando la velocità della pompa. Quando tutte le linee del tubo cadono nelle bombole di deflusso, impostare la portata a 2 giri/min per il collegamento del dispositivo iniziale. Adescamento del dispositivoNOTA: Questa sezione descrive come adescare il dispositivo con il terreno di coltura cellulare per garantire che tutte le camere siano riempite e prerivestite con il terreno, in modo che non rimangano bolle nel sistema e le cellule possano aderire facilmente durante l’inoculazione.L’adescamento del dispositivo viene eseguito nella cabina di biosicurezza in condizioni sterili. Per collegare il dispositivo, inizia collegando la linea neuronale, la camera inferiore del dispositivo. Per collegare una linea, chiudere le valvole del rubinetto a tre vie (Figura 5C), iniziando prima dal lato di uscita, dove il tubo corto viene scollegato dal connettore Luer femmina e collegato alla porta di uscita dal dispositivo, spingendo il tubo sopra l’ardiglione. Per garantire un collegamento corretto e ridurre la possibilità di perdite e/o contaminazione, assicurarsi che il tubo sia a contatto con il coperchio spingendolo fino in fondo sopra il connettore. Collegare il tubo di afflusso allo stesso modo. Una volta che una linea è completamente collegata al dispositivo (in entrata e in uscita), aprire i rubinetti a tre vie. Ripetere il passaggio precedente con la linea epiteliale e poi con la linea batterica. Mantenere la pompa a una portata di 2 giri/min. Aumentare la velocità della pompa a 2,5 giri/min, ma non oltre, per evitare perdite dovute all’accumulo di pressione. Lasciare che la pompa adeschi le camere nel dispositivo. Monitorare sempre i flaconi di siero in uscita. Se le bolle d’aria rimangono bloccate nelle camere, nelle linee o nel connettore, una linea di tubi con una bolla d’aria all’interno non cadrà più nella camera di deflusso. Per eliminare le bolle d’aria, lasciare prima in funzione i dispositivi per alcuni minuti. Se questo non risolve il problema, chiudere una delle altre linee che stanno cadendo per un breve periodo di tempo chiudendo il rubinetto a tre vie del deflusso. Una volta che tutte le camere del dispositivo sono completamente adescate, tutte le camere sono riempite con terreno di coltura cellulare e non rimangono bolle nel dispositivo, ridurre la velocità della pompa a 0,5 giri/min. Il dispositivo è ora pronto per l’inoculazione cellulare. 4. Preparazione e inoculo delle cellule NOTA: Questa sezione descrive come preparare i diversi tipi di cellule necessari per inoculare il dispositivo, nonché come inocularle nel dispositivo in modo sterile e senza introdurre bolle d’aria. Inoltre, descrive come eseguire il raffreddamento del terreno per le cellule neuronali e come preparare il terreno per la coltura batterica nel dispositivo. Cellule epitelialiStaccare le cellule Caco-2 dal matraccio utilizzando l’acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA), risospendere in RPMI 1640 + 10% FBS e contare in un contatore di cellule Neubauer utilizzando il test di esclusione del blu di tripano. Centrifugare la sospensione cellulare Caco-2 (3 min, 300 × g) ed eliminare il surnatante per rimuovere la tripsina-EDTA rimanente. Risospendere le celle Caco-2 in RMPI 1640 + 10% FBS per ottenere una sospensione di 350.000 cellule/mL. Per ogni dispositivo è necessario un volume di 1,5 mL. Trasferire 1,5 mL della sospensione cellulare Caco-2 in una siringa sterile da 2 mL e rimuovere l’aria o le bolle rimaste nella siringa. Chiudere le valvole del rubinetto a tre vie del tubo delle camere batteriche e neuronali. Scollegare il tubo delle camere batterica e neuronale dalla pompa rimuovendo le cassette con il rispettivo tubo dal rotore. Aprire il tappo della valvola di arresto a tre vie del tubo di afflusso che porta alla camera epiteliale e ruotare la valvola di arresto a tre vie per reindirizzare il flusso del fluido dal dispositivo al “connettore aperto” (Figura 5C). Lasciare scorrere il fluido fino a quando non appare una goccia di fluido all’estremità aperta della valvola del rubinetto a tre vie. Inserire la siringa contenente le cellule epiteliali nel “connettore aperto” utilizzando il metodo di connessione drop-drop per consentire l’inserimento della siringa nel connettore senza l’introduzione di bolle d’aria. Ruotare la valvola del rubinetto a tre vie per arrestare il flusso del fluido dal flacone di afflusso (tramite la pompa) e per consentire il flusso dalla siringa collegata al dispositivo iniziale. Scollegare il canale epiteliale dalla pompa. Premere lentamente la siringa per inoculare la sospensione cellulare nella camera epiteliale. Assicurarsi che circa una goccia ogni 3 s cada nel flacone di deflusso. Aggiungere 1,5 mL della sospensione cellulare, quindi chiudere la valvola del rubinetto di arresto a tre vie di deflusso. Scollegare la siringa e chiudere l’estremità aperta del rubinetto a tre vie con il tappo. Tenere la camera chiusa per almeno 2 ore. Nel frattempo, inoculare le cellule neuronali. Cellule neuronaliStaccare le cellule neuronali dal pozzetto risospendendo le cellule nel terreno dai rispettivi pozzetti utilizzando una pipetta. Inoculare ciascun dispositivo con cellule completamente confluenti da un pozzetto (9,6 cm2) di una piastra a 6 pozzetti. Risospendere il pellet cellulare nel corrispondente volume medio N2B27 (1,5 mL di terreno per dispositivo) + 1 μL di fibronectina/mL di sospensione cellulare. Trasferire 1,5 mL della sospensione cellulare risospesa in una siringa da 2 mL e rimuovere eventuali bolle d’aria rimaste nella siringa. Posizionare la siringa riempita in una provetta conica sterile da 50 mL e trasferirla nell’armadio di biosicurezza contenente il dispositivo HuMiX innescato. Seguire lo stesso processo di inoculazione descritto in precedenza per l’inoculazione in camera epiteliale, ad eccezione del cambio di linea del tubo. In questo caso, scollegare le linee del tubo batterico ed epiteliale dalla pompa. Dopo l’inoculazione delle cellule neuronali, chiudere tutti i rubinetti a tre vie delle linee del tubo e scollegare dalla pompa. Posizionare il dispositivo nell’incubatrice a 37 °C e al 5% di CO2 . Tenere tutti i canali chiusi per 2 ore per consentire alle celle di attaccarsi. Dopo 2 ore, collegare i canali batterico ed epiteliale alla pompa e aprire i rubinetti di arresto a tre vie di afflusso e deflusso di entrambe le linee. Tenere chiusa la camera neuronale durante i successivi 14 giorni dall’esecuzione iniziale del dispositivo, tranne durante il cambio del fluido. Durante la corsa di 14 giorni, cambiare il mezzo della camera neuronale ogni 3-4 giorni. Per un aggiornamento medio, preparare 3 ml di terreno N2B27 fresco per dispositivo e trasferire in un flacone sterile di siero da 20 mL. Chiudere il flacone di siero con il terreno utilizzando un setto sterile e una guarnizione a crimpare in alluminio. Inserire un’aerazione e un ago da 80 mm nel setto del nuovo flacone. Sostituire il vecchio flacone del terreno con quello nuovo nell’incubatrice scollegando il Luer maschio dall’ago del vecchio flacone all’ago del nuovo flacone. Collegare la cassetta con il tubo della pompa della camera neuronale alla pompa e aprire i rubinetti a tre vie. Lasciare scorrere il fluido a 0,5 giri/min per 2 ore prima di chiudere i rubinetti a tre vie del tubo neuronale e scollegare dalla pompa, fino al successivo scambio del fluido. 5. Coltura batterica e inoculo NOTA: In questo studio, il giorno 12, una coltura liquida di Limosilactobacillus reuteri ceppo F275 è stata rianimata da uno stock di glicerolo. A seconda delle esigenze o dei disegni di studio, possono essere utilizzate altre specie batteriche. Preparare tre provette con 5 mL di brodo MRS: una provetta di controllo sterile e due per l’inoculazione di L. reuteri. Con un anello di inoculazione, raschiare la parte superiore del brodo di glicerolo e trasferirlo in una provetta. Ripetere l’operazione con un secondo tubo di inoculazione. Incubare le provette a 37 °C, 170 giri/min per una notte.NOTA: Non lasciare scongelare il brodo di glicerolo. Preparare un terreno fresco per i dispositivi iniziali mescolando Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 + 10% FBS con brodo MRS al 5%. Preparare 25 mL per dispositivo e trasferire in flaconi di siero da 100 mL in condizioni sterili. Chiudere i flaconi con un setto sterile e una crimpatura in alluminio. Mettere i flaconi nell’incubatrice a 37 °C, 5% CO2 per una notte. Prima di collegare i flaconi alla linea del tubo batterico, aggiungere un ago di aerazione e un ago da 80 mm a ciascun flacone di terreno RPMI 1640/MRS. Preparare nuove provette, ciascuna con 3 mL di brodo RPMI 1640 + 10% FBS + 5% MRS. Preparare almeno due provette, una di controllo e una provetta per dispositivo. Inoculare 15 μL di coltura notturna di L. reuteri (densità ottica [OD] > 2) in due delle provette appena preparate. Incubare le provette per 1 ora a 37 °C, 170 giri/min, dopodiché si raggiunge un OD di 0,05-0,10, corrispondente a ~1 × 107 unità formanti colonie (CFU)/mL. Trasferire 1,5 mL in una siringa da 2 mL (una per dispositivo). Utilizzare il resto della sospensione batterica per la placcatura CFU e la colorazione viva/morta. Per l’inoculazione batterica del dispositivo, seguire la stessa procedura menzionata al punto 4.1, tranne per il fatto che in questo caso le linee del tubo neuronale ed epiteliale sono chiuse. Dopo l’inoculazione, chiudere anche la linea del tubo batterico, chiudendo le valvole e scollegando dalla pompa per 30 min. Collegare le linee del tubo epiteliale e batterico e riaprire. Lasciare in funzione i dispositivi per altre 24 ore a 37 °C e 0,5 giri/min. 6. Apertura e campionamento di HuMiX NOTA: La sezione seguente descrive il campionamento di diversi tipi di cellule. Ad esempio, i pellet di cellule neuronali sono utilizzati per l’estrazione dell’RNA e la successiva reazione quantitativa a catena della polimerasi (qPCR), i pellet batterici per l’estrazione del DNA e il sequenziamento del gene rRNA 16S e i surnatanti per i saggi di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e altri saggi (ad esempio, il saggio del lattato). Il giorno 14, il giorno dell’apertura, chiudere tutti i rubinetti a tre vie, scollegare i tubi dalla pompa ed estrarre il dispositivo dell’incubatrice sul banco del laboratorio.NOTA: Quando si sposta il dispositivo, assicurarsi di mantenere il dispositivo in posizione orizzontale. Rimuovere le linee di tubi collegate al dispositivo prima di aprire lentamente il clamp e rimuovere il clamp coperchio. Con cautela, rimuovere il coperchio superiore del PC, raccogliere il terreno in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e posizionarlo sul ghiaccio. Rimuovere delicatamente la guarnizione a sandwich, mentre si raccoglie il mezzo dalla camera epiteliale; Fare attenzione a non toccare lo strato cellulare. Posizionare la guarnizione a sandwich in una capsula di Petri quadrata e aggiungere una soluzione sterile di NaCl allo 0,9% in H2O nella camera batterica fino a coprire completamente la camera (circa 1 mL). Rimuovere lentamente la guarnizione di collagene mentre si raccoglie il terreno dalla camera neuronale e lo si trasferisce in una provetta per microcentrifuga. Posizionare tutti i tubi del supporto sul ghiaccio. Metti la guarnizione di collagene in un piatto quadrato e aggiungi delicatamente alcuni millilitri di PBS 1x allo strato di Caco-2 fino a quando lo strato cellulare non è completamente coperto. Posizionare il coperchio inferiore del PC in una capsula di Petri quadrata e aggiungere delicatamente circa 2 ml di PBS 1x sopra le cellule neuronali, in modo che non si secchino durante il processo di campionamento. Centrifugare la provetta batterica a 5.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Centrifugare le provette epiteliali e neuronali a 300 × g per 5 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante di ciascuna provetta in una nuova provetta per microcentrifuga e posizionarla immediatamente su ghiaccio secco. Cellule epitelialiRimuovere delicatamente il PBS dalla guarnizione e raccoglierlo in una provetta conica da 15 mL. Aggiungere 2 mL di tripsina alle cellule e incubare la guarnizione per 5 minuti a 37 °C, 5% CO2 . Aggiungere 2 mL di RPMI 1640 alla guarnizione dopo l’incubazione, risospendere le cellule e raccoglierle in un’altra provetta conica da 15 mL. Centrifugare entrambe le provette per 5 minuti a 300 × g. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet dal lavaggio PBS in 300 μL di PBS e il pellet cellulare in 1 mL di PBS. Trasferire 50 μL di ciascuna provetta in una provetta per microcentrifuga da 0,5 mL per il contatore automatico di cellule e il conteggio delle cellule del test di esclusione del blu di tripano. Trasferire il pellet cellulare risospeso (1 mL) in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 300 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 250 μL di tampone di lisi + 1% di beta-mercaptoetanolo e posizionare la provetta su ghiaccio secco. Cellule neuronaliPortare la capsula di Petri quadrata, con il coperchio inferiore in PC trasparente con le cellule neuronali del passaggio precedente (6.5) a un microscopio a contrasto di fase invertito.NOTA: Quando si sposta il coperchio del PC con il PBS sopra di esso, sii molto delicato, poiché la rete neuronale si stacca molto facilmente. Eseguire un ultimo controllo di qualità prima dell’inoculazione osservando la morfologia e la densità cellulare delle cellule neuronali utilizzando la microscopia in campo chiaro. Verificare che le cellule siano migrate dagli sferoidi e che si sia formata una rete neuronale. La rete neuronale dovrebbe essere confluente per circa il 90%. Per maggiori dettagli, fare riferimento a Fattahi et al.6. Al banco, risospendere le cellule in PBS e raccoglierle in una provetta da 1,5 mL. Centrifugare la provetta a 300 × g per 3 min. Scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 250 μL di tampone di lisi + 1% di beta-mercaptoetanolo e porre su ghiaccio secco.NOTA: La colorazione a immunofluorescenza (IF) può essere eseguita sulle cellule neuronali sul coperchio del PC. Se la colorazione IF è il test preferito per non distruggere la rete neuronale, le cellule devono essere fissate sul coperchio del PC con il 4% di paraformaldeide (PFA), che impedisce il riutilizzo del coperchio del PC in esperimenti futuri. Cellule battericheRisospendere le cellule batteriche attaccate alla membrana in una soluzione di NaCl allo 0,9%. Se le cellule sono saldamente attaccate, utilizzare delicatamente un raschietto per cellule per staccare le cellule batteriche dalla membrana.NOTA: L’uso di un raschietto può danneggiare le cellule, aumentando la probabilità di vedere più cellule morte. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 ml. Aggiungere il pellet rimasto dal terreno precedentemente raccolto nella provetta conica da 15 ml. Centrifugare a 5.000 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di soluzione di NaCl allo 0,9%. Dividere questo volume in tre parti: una per il congelamento di un pellet batterico per l’estrazione dell’acido nucleico (650 μL), una per la placcatura CFU (50 μL) su piastre MRS e una per la colorazione viva/morta (300 μL). Per la preparazione del pellet per l’estrazione dell’acido nucleico, trasferire la sospensione cellulare in una provetta per microcentrifuga, centrifugare a 5.000 × g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Mettere il pellet cellulare sul ghiaccio secco. Al termine del campionamento, trasferire tutte le provette su ghiaccio secco in un congelatore a -80 °C per la conservazione per le successive analisi a valle.NOTA: Il surnatante può essere ulteriormente utilizzato per l’analisi di gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS). Inoltre, durante l’apertura, la membrana rivestita di collagene può essere divisa in diverse parti per diverse analisi: una metà da utilizzare per la colorazione dell’occlusina IF, un’altra parte per l’estrazione dell’RNA per ulteriori analisi dell’espressione genica e un’altra parte per il conteggio delle cellule.