מודל מעיים-על-שבב לחקר ציר המיקרוביום-מערכת העצבים של המעי

1. תרבית תאים ומיון תאי עצב אנטריים פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזעהערה: תאי גזע iPSCs 6 שבועות לפני תחילת ריצה. פרוטוקול הבידול עבור ה-ENs הותאם מ-Fattahi et al.6.תרבית את iPSCs על צלחת מצופה ג’ל מטריצה 6 בארות ב 2 מ”ל / באר של מדיום תרבית iPSC בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין (P / S). במפגש של 80%-90%, מעבירים את התאים, זורעים בצלחת מצופה ג’ל מטריצה באמצעות אותו תווך, דוגרים ב-37°C, 5%CO2 ו-90% לחות יחסית (RH). עבור נגזרת iPSC, לאחר שני מעברים לאחר ההפשרה, במפגש של 80%-90%, זרעו את התאים בצלחת 6 בארות מצופת ג’ל מטריצה בצפיפות של 100,000 תאים/באר. לדגור במדיה המתוארת לעיל + מעכב ROCK Y-27632 (1:2,000) במשך 24 שעות ב 37 ° C. לאחר 24 שעות, החלף את התווך הסופרנטנטי בתווך יום 0, לפי טבלה 1. כלול פקד אחד היטב שישמש כבקרה שלילית במהלך מיון התאים לתהליך הנגזרת. שמור היטב על הבקרה בהרכב המדיה של יום 0 למשך כל תקופת הנגזרת. החליפו את המדיום כל יומיים מימים 2 עד 10, לפי טבלה 1. ביום ה-11, מיין את התאים עבור תאים חיוביים ל-CD49d, אשר ישמשו בשלבים הבאים של פרוטוקול זה.אחסן את התאים למיון בהתבסס על תאים חיוביים CD49d, כמו גם את הבקרה היטב. צנטריפוגה את התאים במשך 3 דקות ב 300 × גרם. יש להשהות מחדש את כדורית התא באלבומין 2% בסרום בקר (BSA) + 1% P/S במי מלח חוצצי פוספט 1x (PBS). חלק כל תא (מאוגד ובקרה) לשניים: מכתים חלק אחד עם נוגדן CD49d אנטי אנושי, ואת החלק השני עם נוגדן בקרת איזוטיפ. שער אוכלוסיית התאים הראשית ולאחר מכן שער תאים בודדים, שעל בסיסו ייבחרו התאים המציגים CD49d על פני השטח שלהם. אסוף תאים אלה לשלב הבא של התמיינות.הערה: בדרך כלל, 30%-40% מהתאים הממוינים הם חיוביים ל- CD49d. העבר שניים עד ארבעה מיליון תאים ממוינים לצלחת אחת בת 6 בארות של צלחת חיבור נמוכה במיוחד במדיה N2B27 (ראה טבלה 2) + FGF2 + CHIR למשך 4 ימים כדי לאפשר היווצרות ספרואידים. ביום ה-15, יש לצלחת מחדש את הספרואידים על צלחת 6 בארות מצופות פולי L-אורניתין/למינין/פיברונקטין (P/L/F) ב-2 מ”ל/באר של מדיה N2B27 עם GDNF וחומצה אסקורבית (AA). החלף את המדיום כל 2-3 ימים.הערה: יחס ציפוי: פולי L-אורניתין, 15 מיקרוגרם / מ”ל; למינין, 2 מיקרוגרם/מ”ל; פיברונקטין, 2 מיקרוגרם/מ”ל ב-1x PBS. לאחר 3 שבועות, השתמש בתאים לחיסון במכשיר. קאקו-2הערה: הפשירו תאי Caco-2 לפחות שבוע לפני ריצה.זרעו בקבוק T75 עם 1 × 106 תאי Caco-2 בתוסף גלוטמין RPMI 1640 + HEPES + סרום בקר עוברי 10% (FBS); יש לדגור ב-37°C, 5%CO2 ו-90% RH.הערה: עבור ניסויים אלה, באופן אידיאלי להשתמש Caco-2 במעבר הראשון או השני שלהם לאחר ההפשרה. 2. הכנה לריצה של HuMiX הכנת מכסה פוליקרבונט וציפויוAutoclave זוג מכסי פוליקרבונט (PC) יחד עם ארבעה ברגים באמצעות מחזור המכשיר הראשוני (ראה טבלה 3 לפרטים). בארון בטיחות ביולוגית, הכנס ארבעה ברגים בכל פינה של מכסה המחשב התחתון (ראה איור 3) והעבר לצלחת פטרי מרובעת סטרילית לתהליך ציפוי דו-שלבי.ביום הראשון, הוסף 2 מ”ל של 1.5% פולי L-אורניתין ב- PBS (1x) לאמצע מכסה המחשב. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-90% לחות יחסית (RH). למחרת, הסר את התמיסה והחלף אותה בתמיסה המכילה 0.2% למינין ו -0.2% פיברונקטין ב- PBS (1x) כדי לכסות את פני השטח של תא העצב. יש לדגור על המכסה למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-90% RH. לאחר הדגירה, יש לשמור את תמיסת הציפוי על מכסה המחשב האישי ולסגור את צלחת הפטרי בעזרת סרט איטום. הניחו אותם בטמפרטורה של 4°C לאחסון עד לשימוש. לפני השימוש, הסירו את תמיסת הציפוי, וייבשו באוויר בארון בטיחות ביולוגית למשך 30 דקות עד שהציפוי יבש לחלוטין. הכנת אטם וציפויוהערה: סעיף זה מתאר כיצד להכין אטמים על-ידי הדבקת ממברנות חדירות למחצה לאטמי סיליקון. לאחר שלב אוטוקלאבינג ראשוני, האטמים מצופים בקולגן או מוצין כדי לאפשר הידבקות של תאי אפיתל מעיים או חיידקים. הקרום המצופה במוצין מחקה את מחסום הריר שנמצא במעי האדם.חברו קרום פוליקרבונט בגודל 1 מיקרומטר לאטם הקולגן וקרום פוליקרבונט בגודל 50 ננומטר בין אטמי הכריך התחתון והעליון. בצע Autoclave של האטמים עם הממברנות המחוברות באמצעות מחזור המכשירים הראשוני של ההתקן (ראה טבלה 3). כדי לצפות את הממברנות, מניחים כל אטם בכלי ריבועי סטרילי.הערה: הציפוי נעשה בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית.עבור אטם קולגן, להוסיף 3 מ”ל של קולגן (50 מיקרוגרם / מ”ל) לממברנה לדגור במשך 3 שעות ב 37 ° C.הערה: היזהר לא לגעת בקרום עם קצה פיפטה בעת הוספת הקולגן כדי למנוע נזק לממברנה. לציפוי המוצין, מניחים את אטם הכריך עם האטם העליון כלפי מעלה בצלחת פטרי כדי לצפות את הצד העליון של הממברנה ב-3 מ”ל מוצין (0.025 מ”ג/מ”ל). לדגור את האטמים ב 37 ° C במשך 1 שעה. לאחר זמן הדגירה, שאפו את תמיסות הקולגן והמוצין מאטמים בהתאמה וייבשו את הממברנה באוויר בארון בטיחות ביולוגית למשך 30 דקות. סוגרים את הכלים, אוטמים בסרט איטום מעבדה ומאחסנים את האטמים בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. הרכבת אבוביםהערה: סעיף זה מתאר כיצד להרכיב את הצינור לזילוח ההתקן. לפני ההרכבה, autoclave כל חתיכות ו / או לקנות את אלה ארוזים בנפרד באריזה סטרילית. הכניסו את כל הרכיבים לארון בטיחות ביולוגית.השתמש בשלושה קווי צינור עבור כל מכשיר ועבור כל קו צינור, חתיכה אחת של צינור משאבה, שתי חתיכות של צינורות מרפרן ארוכים (20 ס”מ), שתי חתיכות של צינורות מרפרן קצרים (8 ס”מ), מחט אחת של 40 מ”מ עבור בקבוק היציאה, מחט אחת של 120 מ”מ עבור בקבוקי זרימה של 250 מ”ל או מחט 80 מ”מ עבור בקבוקי זרימה קטנים יותר, שלושה מחברי Luer to barb זכריים ושבעה נקבות, שלושה מתאמי Luer ושני שסתומי סטופקוק תלת-כיווניים. הרכיבו קווי צינורות משמאל לימין באמצעות הרכיבים האוטומטיים והמעוקרים שצוינו לעיל (איור 4).הערה: יש לרסס כל רכיב באתנול בשיעור 70% בין כל שלב חיבור. הכנת מדיההערה: סעיף זה מתאר כיצד להכין את המדיום לסוגי התאים השונים במכשיר, וכן כיצד להעביר את המדיום לבקבוקי הסרום באופן סטרילי.תוספת RPMI 1640 עם 10% 0.22 מיקרומטר מסונן, FBS מנוטרל חום. השלם את המדיה N2B27 טרי עם GDNF ו- AA. מעבירים את המדיום לבקבוקי הסרום בתנאים סטריליים. העבר 200 מ”ל של מדיה RPMI 1640 לבקבוקים של 250 מ”ל ו- 30 מ”ל של מדיה N2B27 לבקבוקים של 50 מ”ל.הכינו מדיום חיידקי (RPMI 1640 + 10% FBS + 5% מדיום תרבית דה מאן, רוגוסה ושפרה [MRS]) בשלב מאוחר יותר, מכיוון שהדבר נדרש רק במהלך 24 השעות האחרונות של הניסוי. סוגרים את הבקבוקים עם מחיצה, אלומיניום מכווץ אותם, ו autoclave. כדי להעביר את המדיה, הסר את כיווץ האלומיניום באמצעות מכסה מתאים (קוטר = 20 מ”מ). הסירו גם את המחיצה. בזהירות לשפוך את המדיום מוכן לתוך בקבוקי הסרום מבלי לגעת בבקבוק. כדי לעקר, יש להבעיר את פתח הבקבוק באמצעות מבער Bunsen נייד. אטמו את הבקבוקים על ידי ריסוס המחיצה באתנול 70%, הוספתו לבקבוק וסגירתו עם כיווץ אלומיניום באמצעות מכופף איטום. מניחים את הבקבוקים הסגורים באינקובטור ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 24 שעות כדי לחמם את המדיום ל 37 ° C, כמו גם כדי לוודא שאין סימנים גלויים של זיהום לפני השימוש בקבוקי מדיה עבור המכשיר. 3. התחלת HuMiX הרכבת NeuroHuMiXהערה: סעיף זה מסביר כיצד להרכיב את ההתקן. בקיצור, מערכת ההידוק מעוקרת ומהודקת מחדש, ולאחר מכן מכסה המחשב התחתון ממוקם על בסיס המהדק. לאחר מכן, האטמים המצופים ומכסי המחשב העליונים נערמים זה על זה, ואחריו החלק העליון של המהדק. לבסוף, המהדק מהדק כדי לדחוס את האטמים ולהפוך את המערכת ללא דליפה ואטומה לגז. איור 4 מתאר את החלקים השונים הדרושים להרכבה.בצע Autoclave של מלחציים ושני מכסי המחשב (עליון ותחתון) לפני ההרכבה. הדקו את הברגים המשמשים להרכבת החלקים העליונים והתחתונים של המהדק (איור 4C,D). פתח את הברגים לפני תהליך autoclaving והידק אותם מחדש מאוחר יותר. העבר את מכסה המחשב התחתון המצופה והמיובש (שלב 2.2.3) (איור 4 A1) מצלחת הפטרי המרובעת לחלק העליון של בסיס המהדק על-ידי החזקת ארבעת הברגים בפינות מכסה המחשב.הערה: הימנע מלגעת במכסה המחשב כדי להפחית את הסיכון לזיהום. הניחו את אטם תא האפיתל כשהוא פונה כלפי מעלה (כלומר, עם הממברנה למעלה) על מכסה המחשב באמצעות פינצטה סטרילית. השתמשו בברגים כדי ליישר את האטם ואת מכסה המחשב כדי לוודא שפתחי הכניסה והשקע בפינות המכסה מיושרים עם הפתחים באטם (איור 3). בעזרת הפינצטה הסטרילית, מניחים את אטם הסנדוויץ’ מעל אטם הקולגן, כשהצד העליון פונה כלפי מעלה. הניחו את מכסה המחשב העליון על אטם הכריך. כדי להפחית את הסיכון לזיהום, עשו זאת על ידי נגיעה רק בשולי המכסה (אין לגעת בחלק העליון או התחתון של המכסה). ודא שהברגים על מכסה המהדק מתיישרים עם פתח הכניסה והשקע במכלול הממברנה, ושהברגים ממכסה המחשב התחתון מתאימים לפתח מכסה המחשב העליון. כדי לסגור את ההתקן, הנח את מכסה המהדק (החלק העליון של המהדק) על מכסה המחשב. ודא שפתחי המכסה חופפים לפתחי הכניסה והשקע של מכסה המחשב העליון. סגור את התפחים. שמור את המכשיר הסגור (איור 5) מתחת למכסה המנוע כדי להתחבר לקווי הצינור הדרוכים (שלב 3.2.6). הנחת קווי אבוביםהערה: סעיף זה מתאר כיצד לחבר את הצינור לבקבוקים הנכנסים והיוצאים, כמו גם למשאבה, ולאחר מכן לכוון את הצינור עם מדיום כדי להסיר את כל שאריות המוצרים המשמשים במהלך ניקוי ועיקור, ולוודא שאין בועות בצינורית.הנחת קווי הצינורות מתבצעת בארון הבטיחות הביולוגית. הכנס מחטי אוורור עם מסננים במחיצה של כל בקבוק זרימה ויציאה. בעזרת פינצטה נקייה וסטרילית, הכנס את מחטי ה-120 מ”מ לבקבוקי הסרום בנפח 250 מ”ל. הכנס את המחטים בקוטר 80 מ”מ לבקבוקי הסרום של 50 מ”ל. הכנס את המחטים בקוטר 40 מ”מ, בקצה כל קו צינורות, לבקבוק סרום יציאה. בכל מכשיר, ישנם שני בקבוקי זרימה עבור שלושת קווי הצינורות. המחטים בקוטר 40 מ”מ של קווי האפיתל והצינור העצבי מחוברות לאותו בקבוק יציאה להשלכה בינונית. קו צינור החיידקים עובר לבקבוק היציאה השני. הכנס את קווי צינורות המשאבה לקלטות המשאבה. ודא שהסטופקוקים התלת-כיווניים של קווי הצינורות פתוחים כולם. בהתחלה, כוונו את המשאבה הפריסטלטית לכוון את המדיה מהזרימה לבקבוק הזרימה במהירות של 5 סל”ד (ראו טבלה 4).הערה: במהלך פרימת קו אבובים, ניתן להגדיל את המהירות עד 10 סל”ד כדי להאיץ את התהליך. הפעל את המשאבה על ידי לחיצה על לחצן התחל וודא שכיוון פעולת השאיבה הוא בכיוון השעון. ברגע שהתקשורת נופלת לתוך בקבוקי היציאה, יש לוודא שאין נזילות ולא נותרות בועות אוויר בקווי הצינורות ובנקודות החיבור. הסר את כל הבועות שנותרו על ידי הקשה על הצינור והמחברים או על ידי הגדלת מהירות המשאבה. כאשר כל קווי הצינור נופלים לתוך בקבוקי היציאה, הגדר את קצב הזרימה ל -2 סל”ד לחיבור המכשיר הראשוני. פרימת המכשירהערה: סעיף זה מתאר כיצד לכוון את המכשיר עם מדיום תרבית תאים כדי להבטיח שכל התאים מלאים ומצופים מראש בתווך, כך שלא יישארו בועות במערכת והתאים יוכלו להיצמד בקלות במהלך החיסון.פרימת המכשיר מתבצעת בארון הבטיחות הביולוגית בתנאים סטריליים. כדי לחבר את המכשיר, התחל על ידי חיבור הקו העצבי, החדר התחתון של המכשיר. כדי לחבר קו, סגור את שסתומי הסטופקוק התלת-כיווניים (איור 5C), החל מהצד היוצא, שבו הצינור הקצר מנותק ממחבר Luer הנשי ומחובר ליציאת היציאה מהמכשיר, על-ידי דחיפת הצינור מעל המשקוף. כדי להבטיח חיבור תקין ולהפחית את הסיכוי לדליפות ו/או זיהום, ודא שהצינור בא במגע עם המכסה על ידי דחיפתו כל הדרך למטה מעל המחבר. חבר את צינורות הזרימה באותו אופן. לאחר חיבור מלא של קו אחד למכשיר (זרימה ויציאה), פתח את הסטופקוקים התלת-כיווניים. חזור על השלב הקודם עם קו האפיתל, ולאחר מכן עם קו החיידקים. שמור על המשאבה בקצב זרימה של 2 סל”ד. הגדל את מהירות המשאבה ל -2.5 סל”ד, אך לא גבוה יותר, על מנת למנוע דליפות עקב הצטברות לחץ. אפשרו למשאבה להפעיל את התאים במכשיר. יש לעקוב אחר היציאות של בקבוקי הסרום בכל עת. אם בועות אוויר נתקעות בתאים, בקווים או במחברים, קו צינורות עם בועת אוויר בפנים לא ייפול יותר בתא היציאה. כדי להיפטר מבועות אוויר, תחילה תן למכשירים לפעול במשך כמה דקות. אם פעולה זו אינה פותרת את הבעיה, סגור את אחד הקווים האחרים שיורדים לפרק זמן קצר על-ידי סגירת הסטופקוק התלת-כיווני של היציאה. ברגע שכל תאי המכשיר מוכנים במלואם – כל התאים מלאים בתווך תרבית תאים ולא נשארות בועות במכשיר – הפחיתו את מהירות המשאבה ל-0.5 סל”ד. המכשיר מוכן כעת לחיסון תאים. 4. הכנת תאים וחיסון הערה: סעיף זה מתאר כיצד להכין את סוגי התאים השונים הדרושים לחיסון המכשיר, וכן כיצד לחסן אותם במכשיר באופן סטרילי וללא החדרת בועות אוויר. יתר על כן, הוא מתאר כיצד לבצע רענון בינוני לתאי העצב, וכיצד להכין מדיום לתרבית החיידקים במכשיר. תאי אפיתלנתקו את תאי Caco-2 מהבקבוק באמצעות חומצה טריפסין-אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA), השהו מחדש בסל”ד 1640 + 10% FBS, וספרו במונה תאי נויבאואר באמצעות בדיקת ההרחקה הכחולה של טריפאן. צנטריפוגו את תרחיף תאי Caco-2 (3 דקות, 300 × גרם), והשליכו את הסופרנאטנט כדי להסיר את שאריות הטריפסין-EDTA. השהה מחדש את תאי Caco-2 ב- RMPI 1640 + 10% FBS כדי להשיג השעיה של 350,000 תאים / מ”ל. עבור כל מכשיר, נפח של 1.5 מ”ל נדרש. העבר 1.5 מ”ל של תרחיף התא Caco-2 לתוך מזרק סטרילי 2 מ”ל והסר כל אוויר או בועות שנותרו במזרק. סגור את שסתומי הסטופקוק התלת-כיווניים של צינורות תאי החיידקים והנוירונים. נתק את הצינורית של תאי החיידקים והעצבים מהמשאבה על ידי הסרת הקלטות עם הצינור המתאים מהרוטור. פתח את המכסה של שסתום הסטופקוק התלת-כיווני של צינור הזרימה המוביל לתא האפיתל וסובב את שסתום הסטופקוק התלת-כיווני כדי להפנות את הזרימה הבינונית מהמכשיר ל’מחבר הפתוח’ (איור 5C). אפשר לתווך לזרום עד שתופיע טיפה של תווך בקצה הפתוח של שסתום הסטופקוק התלת-כיווני. הכנס את המזרק המכיל את תאי האפיתל ל’מחבר הפתוח’ בשיטת חיבור טיפה-טיפה כדי לאפשר החדרת המזרק למחבר ללא הכנסת בועות אוויר. סובב את השסתום של הסטופקוק התלת-כיווני כדי לעצור את זרימת התווך מבקבוק הזרימה (דרך המשאבה) ולאפשר זרימה מהמזרק המחובר למכשיר הראשוני. נתקו את תעלת האפיתל מהמשאבה. לחץ לאט על המזרק כדי לחסן את תא האפיתל עם השעיית התא. יש לוודא שכטיפה אחת לכל 3 שניות נכנסת לבקבוק היוצא. הוסף 1.5 מ”ל של השעיית התא, ולאחר מכן סגור את השסתום של סטופקוק תלת כיווני החוצה. נתקו את המזרק וסגרו את הקצה הפתוח של הסטופקוק המשולש עם הפקק. השאירו את התא סגור למשך שעתיים לפחות. בינתיים, לחסן את התאים העצביים. תאי עצבנתק את התאים העצביים מהבאר על ידי השעיית התאים במדיה מהבארות המתאימות באמצעות פיפטה. לחסן כל מכשיר עם תאים בזרימה מלאה מבאר אחת (9.6 ס”מ2) של צלחת 6 בארות. השהה מחדש את גלולת התא בנפח הבינוני המתאים N2B27 (1.5 מ”ל מדיה לכל מכשיר) + 1 מיקרוליטר של פיברונקטין / מ”ל של השעיית התא. העבר 1.5 מ”ל של תרחיף התא המרחף לתוך מזרק 2 מ”ל והסר את כל בועות האוויר שנותרו במזרק. מניחים את המזרק המלא בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ”ל ומעבירים לארון הבטיחות הביולוגית המכיל את מכשיר HuMiX המוכן. בצע את אותו תהליך חיסון כפי שתואר קודם לכן עבור חיסון תא אפיתל, למעט שינוי קו הצינור. כאן, נתקו את קווי צינור החיידקים והאפיתל מהמשאבה. לאחר חיסון תאי עצב, סגור את כל הסטופקוקים התלת-כיווניים של קווי הצינור והתנתק מהמשאבה. מקם את המכשיר באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2. השאר את כל הערוצים סגורים למשך שעתיים כדי לאפשר לתאים להתחבר. לאחר שעתיים, חברו את תעלות החיידקים והאפיתל למשאבה ופתחו את הזרימה והזרימה התלת-כיוונית של שני הקווים. שמור על החדר העצבי סגור במהלך 14 הימים הבאים של הפעלת המכשיר הראשוני, למעט במהלך שינוי בינוני. במהלך 14 יום ריצה, לשנות את המדיום של החדר העצבי כל 3-4 ימים. לרענון בינוני, יש להכין 3 מ”ל מדיום N2B27 טרי לכל מכשיר ולהעביר לבקבוק סרום סטרילי בנפח 20 מ”ל. סוגרים את בקבוק הסרום במדיום בעזרת מחיצה סטרילית ואטם אלומיניום. הכנס אוורור ומחט 80 מ”מ לתוך המחיצה של הבקבוק החדש. החליפו את בקבוק המדיה הישן בחדש באינקובטור על ידי ניתוק הלואר הגברי ממחט הבקבוק הישן למחט של הבקבוק החדש. חבר את הקלטת עם צינור המשאבה של החדר העצבי למשאבה ופתח את הסטופקוקים התלת-כיווניים. תן למדיה לזרום ב 0.5 סל”ד במשך 2 שעות לפני סגירת הסטופק המשולש של הצינור העצבי והתנתקות מהמשאבה, עד חילופי המדיום הבא. 5. תרבית חיידקים וחיסון הערה: במחקר זה, ביום ה-12, תרבית נוזלית של זן Limosilactobacillus reuteri F275 הוחייתה מחדש ממלאי גליצרול. בהתאם לצרכים או לעיצובי המחקר, ניתן להשתמש בזני חיידקים אחרים. הכינו שלושה צינורות עם 5 מ”ל של ציר MRS – צינור בקרה סטרילי אחד ושניים לחיסון L. reuteri. בעזרת לולאת חיסון, מגרדים את החלק העליון של מלאי הגליצרול ומעבירים אותו לצינורית אחת. חזור על הפעולה עם צינורית חיסון שנייה. לדגור את הצינורות ב 37 ° C, 170 סל”ד לילה.הערה: אין לתת למלאי הגליצרול להפשיר. הכינו מדיום טרי למכשירים הראשוניים על ידי ערבוב Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 + 10% FBS עם 5% מרק MRS. הכינו 25 מ”ל לכל מכשיר והעבירו לבקבוקי סרום של 100 מ”ל בתנאים סטריליים. סוגרים את הבקבוקים עם מחיצה סטרילית וכיווץ אלומיניום. הניחו את הבקבוקים באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך הלילה. לפני חיבור הבקבוקים לקו צינור החיידקים, הוסף מחט אוורור ומחט 80 מ”מ לכל בקבוק של מדיה RPMI 1640/MRS. הכינו צינורות חדשים, כל אחד עם 3 מ”ל של RPMI 1640 + 10% FBS + 5% מרק MRS. הכינו לפחות שני צינורות, בקרה אחת וצינור אחד לכל מכשיר. יש לחסן 15 μL של תרבית הלילה L. reuteri (צפיפות אופטית [OD] > 2) בשניים מהצינורות החדשים שהוכנו. לדגור את הצינורות במשך 1 שעה ב 37 ° C, 170 סל”ד, ולאחר מכן OD של 0.05-0.10 הוא הגיע, המקביל ~ 1 × 107 יחידות יצירת מושבה (CFU) / מ”ל. מעבירים 1.5 מ”ל למזרק 2 מ”ל (אחד לכל מכשיר). השתמש בשאר המתלים החיידקיים לציפוי CFU ולהכתמה חיה/מתה. עבור חיסון חיידקי של המכשיר, בצע את אותו הליך שהוזכר בשלב 4.1, אלא שכאן קווי הצינור העצבי והאפיתל סגורים. לאחר החיסון, סגור גם את קו צינור החיידקים, על ידי סגירת השסתומים וניתוק מהמשאבה למשך 30 דקות. חבר את קווי צינור האפיתל והבקטריאלי ופתח שוב. תן למכשירים לפעול עוד 24 שעות ב 37 ° C ו 0.5 סל”ד. 6. פתיחה ודיגום של HuMiX הערה: הסעיף הבא מתאר את הדגימה של סוגי תאים שונים. לדוגמה, כדורי תאים עצביים משמשים למיצוי RNA ולתגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR), כדוריות חיידקיות למיצוי DNA וריצוף גנים 16S rRNA, וסופרנאטנטים לבדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (ELISAs) ובדיקות אחרות (למשל, בדיקת לקטט). ביום ה-14, יום הפתיחה, סוגרים את כל הסטופק התלת-כיווני, מנתקים את הצינורות מהמשאבה ומוציאים את מכשיר האינקובטור לספסל המעבדה.הערה: בעת העברת ההתקן, הקפד לשמור על ההתקן בפועל אופקי. הסר את קווי הצינור המחוברים למכשיר לפני פתיחה איטית של המהדק והסר את מכסה המהדק. בזהירות, הסר את מכסה המחשב העליון, אסוף את המדיה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל והנח אותו על קרח. הסר בעדינות את אטם הכריך, תוך איסוף התקשורת מתא האפיתל; היזהר לא לגעת בשכבת התא. מניחים את אטם הכריך בצלחת פטרי מרובעת ומוסיפים תמיסת NaCl סטרילית 0.9% ב- H2O לתא החיידקים עד לכיסוי מלא של התא (כ -1 מ”ל). הסר באיטיות את אטם הקולגן תוך איסוף המדיה מהחדר העצבי והעברתו לצינור מיקרוצנטריפוגה. מניחים את כל צינורות המדיה על קרח. הכניסו את אטם הקולגן לתבנית מרובעת והוסיפו בעדינות כמה מיליליטרים של 1x PBS לשכבת Caco-2 עד ששכבת התא תכסה במלואה. הניחו את מכסה המחשב התחתון בצלחת פטרי מרובעת והוסיפו בעדינות כ-2 מ”ל של 1x PBS על גבי התאים העצביים, כך שהם לא יתייבשו במהלך תהליך הדגימה. צנטריפוגה את צינור המדיה החיידקי ב 5,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. צנטריפוגה את צינורות האפיתל והמדיה העצבית ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C. לאחר הצנטריפוגה, מעבירים את הסופרנאטנט של כל צינור לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש ומניחים אותו מיד על קרח יבש. תאי אפיתלהסר בעדינות את PBS מהאטם ואסוף בצינור חרוטי של 15 מ”ל. מוסיפים 2 מ”ל טריפסין לתאים ודגרים על האטם במשך 5 דקות ב-37°C, 5% CO2. הוסף 2 מ”ל של RPMI 1640 לאטם לאחר הדגירה, להשעות מחדש את התאים, ולאסוף עוד 15 מ”ל צינור חרוט. צנטריפוגה שני צינורות במשך 5 דקות ב 300 × גרם. השליכו את הסופרנטנט. להשעות מחדש את הגלולה מן PBS לשטוף ב 300 μL של PBS ואת גלולת התא ב 1 מ”ל של PBS. העבר 50 μL מכל צינור לצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ”ל עבור מונה התאים האוטומטי וספירת תאי בדיקת הרחקה כחולה טריפאן. העבר את גלולת התא המרחף (1 מ”ל) לצינור 1.5 מ”ל וצנטריפוגה ב 300 × גרם למשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 250 μL של חיץ ליזיס + 1% בטא-מרקפטואתנול ומניחים את הצינור על קרח יבש. תאי עצבקח את צלחת פטרי מרובעת, עם מכסה המחשב התחתון ושקוף עם תאים עצביים מהשלב הקודם (6.5) למיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה.הערה: בעת הזזת מכסה המחשב עם PBS עליו, היה עדין מאוד, מכיוון שהרשת העצבית מתנתקת בקלות רבה. בצע בדיקת איכות אחרונה לפני החיסון על ידי התבוננות במורפולוגיה ובצפיפות התא של תאי העצב באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. ודא כי התאים נדדו מן הספרואידים וכי רשת עצבית נוצרה. הרשת העצבית צריכה להיות כ 90% confluent. לפרטים נוספים, עיין ב-Fattahi et al.6. על הספסל, להשעות מחדש את התאים PBS ולאסוף בצינור 1.5 מ”ל. צנטריפוגה את הצינור ב 300 × גרם במשך 3 דקות. יש להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את גלולת התא ב-250 מיקרוליטר של חיץ ליזיס + 1% בטא-מרקפטואתנול, ולהניח על קרח יבש.הערה: צביעת Immunofluorescence (IF) יכולה להיעשות על התאים העצביים על מכסה המחשב. אם צביעת IF היא הבדיקה המועדפת כדי לא להרוס את הרשת העצבית, התאים צריכים להיות קבועים על מכסה המחשב עם 4% paraformaldehyde (PFA), אשר מונע שימוש חוזר של מכסה המחשב בניסויים עתידיים. תאי חיידקיםלהשהות מחדש את תאי החיידק המחוברים לממברנה בתמיסת NaCl 0.9%. אם התאים מחוברים היטב, השתמש בעדינות במגרד תאים כדי לנתק את תאי החיידקים מהממברנה.הערה: שימוש במגרד יכול להזיק לתאים, להגדיל את ההסתברות לראות יותר תאים מתים. לאסוף את השעיית התא בצינור חרוטי 15 מ”ל. הוסף את הגלולה שנותרה מהמדיה שנאספה בעבר לצינור החרוטי 15 מ”ל. צנטריפוגה ב 5,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את גלולת התא ב-1 מ”ל של תמיסת NaCl של 0.9%. חלק נפח זה לשלושה חלקים: אחד להקפאת גלולה חיידקית למיצוי חומצות גרעין (650 μL), אחד לציפוי CFU (50 μL) על לוחות MRS, ואחד להכתמה חיה/מתה (300 μL). להכנת הגלולה למיצוי חומצת גרעין, מעבירים את תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה, צנטריפוגה ב 5,000 × גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ומשליכים את הסופרנטנט. מניחים את גלולת התא על קרח יבש. בסוף הדגימה, מעבירים את כל הצינורות על קרח יבש למקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לניתוחים מאוחרים יותר במורד הזרם.הערה: Supernatant יכול לשמש גם לניתוח ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית גז (GC-MS). יתר על כן, במהלך הפתיחה, ניתן לחלק את הממברנה המצופה בקולגן לחלקים שונים לאנליזות שונות – מחצית אחת תשמש לצביעת IF occludin, חלק אחר למיצוי RNA לניתוח ביטוי גנים נוסף, וחלק נוסף לספירת תאים.